杜偉，吳思瀾，楊雪，陳慧，葉蘭△

運動疲勞是一種正常的、休息后可緩解的生理現(xiàn)象，表現(xiàn)為機體運動能力下降［1］。但部分人群運動疲勞后通過休息未能緩解，遷延6個月及以上成為慢性疲勞綜合征。研究顯示，荷蘭多達1/3的成年人可診斷為慢性疲勞綜合征［2］。我國慢性疲勞綜合征患病率為12.54%［3］。目前沒有應對疲勞的公認方案，藥物干預是重要的舉措之一［4］。因此，篩選并開發(fā)具有抗疲勞作用的藥物對于改善疲勞人群生活質(zhì)量具有現(xiàn)實意義。運動疲勞可激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素蛋白（mTOR）信號通路，進而調(diào)控糖代謝，增強機體運動能力［5-6］。既往研究表明，從黃芪、黃精、枸杞等常見中藥提取的多糖具有抗運動疲勞作用，機制包括改善葡萄糖代謝，降低運動代謝物堆積等［7］。AMPK/mTOR信號通路成為中藥多糖抗運動疲勞的潛在通路。近期有研究認為，多糖中所含的單糖種類越豐富，其抗運動疲勞活性可能越強［8］。火把花根多糖從火把花藥材提取獲得，具有單糖組成豐富的特征，目前有關火把花根多糖抗疲勞作用的相關研究較少。本研究基于AMPK/mTOR信號通路探究火把花根多糖抗運動疲勞的作用機制，為運動疲勞的治療提供更多的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級ICR雄性小鼠24只，體質(zhì)量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于明暗交替（12 h/12 h），溫度20～26℃，濕度40%～70%環(huán)境中，自由攝取水和飼料。動物使用符合重慶市中藥研究院倫理要求。

1.1.2 火把花根多糖制備 火把花藥材為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物昆明山海棠干燥根，購自重慶市中藥研究院門診部。稱取火把花藥材粉碎，參照文獻［9］，以水提醇沉法獲取火把花根多糖（醇沉淀物），冷凍干燥，得黃褐色火把花根多糖樣品。經(jīng)苯酚-濃硫酸法檢測多糖含量為54%，經(jīng)親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HILIC-ELSD）分析火把花根多糖樣品由7種單糖聚合形成，單糖組成比例為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶巖藻糖（1.9∶2.8∶17.0∶15.2∶35.2∶25.3∶2.6）?；鸢鸦ǜ嗵菢悠酚眉兓芙?，使質(zhì)量濃度為20 g/L，作為本研究的火把花根多糖受試液。

1.1.3 單糖混合物制備 參照火把花根多糖的單糖組成與溶解方法，制成質(zhì)量濃度為20 g/L的單糖混合物受試液。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖和巖藻糖購自阿拉丁試劑有限公司；葡萄糖、半乳糖購自索萊寶生物科技有限公司。

1.1.4 試劑與儀器 三酰甘油（TG）和血糖（GLU）檢測試劑購自貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；TRIzol試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；病理糖原染色（PAS）試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；疲勞轉(zhuǎn)棒儀購自成都泰盟科技有限公司；AU480全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司；Mias-2000病理圖象處理系統(tǒng)購自四川大學圖象處理國家研究所；CFX Connect Real-Time System購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠按隨機數(shù)字表法分為靜止對照組、疲勞對照組、疲勞+單糖組、疲勞+火把花根多糖組，每組6只。疲勞+火把花根多糖組給予火把花根多糖受試液，疲勞+單糖組給予單糖混合物受試液，靜止對照組和疲勞對照組給予純化水，各組均按20 mL/kg每日灌胃給藥1次，連續(xù)14 d。

1.2.2 一般狀況觀察 給藥期間每天觀察1次動物行為活動、腺體分泌、呼吸、排泄物等狀況；給藥第1、4、7、10、13天稱小鼠體質(zhì)量，記錄飼料和飲水的給予量，給藥第2、5、8、11、14天記錄飼料和飲水的剩余量，使用前1天給予量減去后1天剩余量計算攝食量和飲水量。

1.2.3 運動能力檢測 除靜止對照組外，其余各組小鼠均于給藥后1 h進行運動能力檢測。檢測方法為疲勞轉(zhuǎn)棒與力竭游泳。（1）疲勞轉(zhuǎn)棒：采用文獻［10］的方法，分別在給藥第6、13天將各組小鼠置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀上（15 r/min），先進行小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒訓練3次（每次2 min，間隔10 min），然后休息30min開始正式實驗，記錄小鼠運動性疲勞后從轉(zhuǎn)棒上跌落的時間，即小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒時間。（2）力竭游泳：采用文獻［11］的方法，小鼠分6次在給藥第14天完成力竭游泳，每次每組取1只小鼠，將其尾根部負荷5%體質(zhì)量鉛皮后置于同一游泳箱中（水深不少于30 cm，水溫25℃±1.0℃），當小鼠力竭時會沉至水面下，小鼠沉至水面下7 s時，記錄每只小鼠游泳結(jié)束時間，即小鼠力竭游泳時間。

1.2.4 生化指標檢測 小鼠力竭游泳后即眼眶取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用AU480全自動生化分析儀檢測血清中TG和GLU濃度。

1.2.5 組織病理學檢查 小鼠力竭游泳取血后，安樂死處死小鼠，快速采集腓腸肌。左側(cè)腓腸肌經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、貼片后制備石蠟病理切片。采用HE染色觀察左側(cè)腓腸肌病理變化；按照PAS試劑盒說明書操作，觀察左側(cè)腓腸肌糖原著色。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測AMPK/mTOR信號通路與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT-4）mRNA表達 取20 mg右側(cè)腓腸肌組織，加入TRIzol試劑提取總RNA，測定RNA濃度，并進行擴增反應。取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應體系為20μL；反應條件為37℃15 min，85℃5 s。PCR引物由南京金瑞斯生物科技公司合成，見表1。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。通過檢測解鏈曲線來驗證引物的特異性。40個循環(huán)后分析熔解曲線及Ct值，每個樣本重復3次，取平均 值。采 用2-ΔΔCt法 計 算AMPK、mTOR、GLUT-4經(jīng) 內(nèi) 參GAPDH標化后的相對表達量。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 火把花根多糖對小鼠一般狀況的影響 給藥期間未見各組小鼠行為活動、腺體分泌、呼吸、排泄物等異常。給藥第13天，與靜止對照組比較，疲勞+火把花根多糖組的體質(zhì)量減輕（P＜0.05）。余各時間點各組體質(zhì)量、攝食量、飲水量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2～4。

Tab.2 Comparison of body mass of mice at different time points between the four groups表2各組小鼠不同給藥時間體質(zhì)量的比較（n=6，g，±s）

Tab.2 Comparison of body mass of mice at different time points between the four groups表2各組小鼠不同給藥時間體質(zhì)量的比較（n=6，g，±s）

＊P＜0.05；a與靜止對照組比較，P＜0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F第1天20.1±0.6 20.1±0.8 20.1±0.7 20.1±0.7 0.003第4天24.0±1.2 24.1±1.4 24.1±1.0 23.5±1.1 0.357第7天27.3±1.9 27.4±2.0 27.3±1.6 25.8±1.5 1.141第10天30.0±2.3 30.1±2.2 29.1±1.4 27.5±1.9 2.119第13天31.4±2.0 31.4±2.4 29.8±1.4 28.1±1.7a 4.192＊

Tab.3 Comparison of food intake of mice at different time points between the four groups表3各組小鼠不同給藥時間攝食量的比較（n=6，g，±s）

Tab.3 Comparison of food intake of mice at different time points between the four groups表3各組小鼠不同給藥時間攝食量的比較（n=6，g，±s）

均P＞0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F第1天9.50±1.25 9.37±0.70 9.40±1.04 9.50±0.95 0.014第4天12.00±0.90 11.73±0.70 12.33±0.91 12.50±0.89 0.483第7天12.42±0.80 12.77±0.91 12.60±0.79 12.37±1.12 0.115第10天12.67±0.78 12.73±0.74 12.68±1.12 12.50±1.48 0.026第13天12.00±0.82 12.17±0.35 11.80±0.66 12.03±0.60 0.174

Tab.4 Comparison of water consumption of mice at different time points between the four groups表4各組小鼠不同給藥時間飲水量的比較（n=6，g，±s）

Tab.4 Comparison of water consumption of mice at different time points between the four groups表4各組小鼠不同給藥時間飲水量的比較（n=6，g，±s）

均P＞0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F第1天11.6±0.6 11.7±0.9 12.0±0.7 12.1±0.2 0.354第4天14.8±0.8 15.2±0.4 15.2±0.4 14.8±0.9 0.313第7天16.1±0.6 15.9±0.4 16.2±0.7 15.8±0.5 0.297第10天14.9±0.9 15.0±0.2 15.0±0.7 14.9±0.9 0.015第13天13.3±0.7 13.1±0.4 13.2±0.9 13.4±0.3 0.173

2.2 火把花根多糖對小鼠運動能力的影響 與疲勞對照組比較，疲勞+火把花根多糖組在給藥第6天疲勞轉(zhuǎn)棒時間差異無統(tǒng)計學意義；在給藥第13天，疲勞轉(zhuǎn)棒時間顯著增加（P＜0.05）。在給藥第14天，疲勞+火把花根多糖組力竭游泳時間增加（P＜0.05）。疲勞+單糖組小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒時間和力竭游泳時間與疲勞對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表5。

Tab.5 Comparison of fatigue rotating rod and weightbearing swimming time of mice between the three groups表5各組小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒與力竭游泳時間的比較（min，±s）

Tab.5 Comparison of fatigue rotating rod and weightbearing swimming time of mice between the three groups表5各組小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒與力竭游泳時間的比較（min，±s）

＊＊P＜0.01；a與疲勞對照組比較，P＜0.05。

組別疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F n 666疲勞轉(zhuǎn)棒時間第6天2.74±1.10 2.66±1.05 4.12±0.96 3.737第13天2.63±1.45 2.84±1.76 10.58±2.36a 34.268＊＊力竭游泳時間10.2±3.4 14.0±3.3 24.2±4.8a 20.512＊＊

2.3 火把花根多糖對小鼠TG和GLU的影響 與靜止對照組比較，疲勞對照組、疲勞+單糖組、疲勞+火把花根多糖組小鼠血清中TG均上調(diào)（P＜0.05），但后3組間差異無統(tǒng)計學意義。與靜止對照組比較，疲勞對照組、疲勞+單糖組、疲勞+火把花根多糖組小鼠血清中GLU均降低（P＜0.05）；與疲勞對照組比較，疲勞+火把花根多糖組GLU降低（P＜0.05）。見表6。

Tab.6 Comparison of serum levels of TG and GLU between the four groups of mice表6各組小鼠血清TG和GLU比較（mmol/L，±s）

Tab.6 Comparison of serum levels of TG and GLU between the four groups of mice表6各組小鼠血清TG和GLU比較（mmol/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與靜止對照組比較，b與疲勞對照組比較，P＜0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F n6666 TG 0.67±0.11 1.08±0.36a 1.05±0.13a 1.06±0.15a 5.111＊＊GLU 6.33±1.52 3.35±1.11a 2.75±1.08a 1.40±0.40ab 21.405＊＊

2.4 火把花根多糖對小鼠組織病理學的影響HE染色顯示各組小鼠腓腸肌未見明顯異常。PAS染色可見疲勞對照組與疲勞+單糖組腓腸肌著色略深，而疲勞+火把花根多糖組著色最深。見圖1。

Fig.1 Pathological observation of gastrocnemius muscle in each group圖1各組小鼠腓腸肌病理觀察

2.5 火把花根多糖對AMPK/mTOR信號通路與GLUT-4的影響 與靜止對照組和疲勞對照組比較，疲勞+火把花根多糖組小鼠腓腸肌中AMPK、mTOR、GLUT-4 mRNA均上調(diào)（P＜0.05），見表7。

Tab.7 The relative expression levels of AMPK,mTOR and GLUT-4 mRNA in gastrocnemius muscle of mice after weight-bearing swimming in each group表7各組小鼠力竭游泳后腓腸肌AMPK、mTOR和GLUT-4 mRNA的比較 （n=6，±s）

Tab.7 The relative expression levels of AMPK,mTOR and GLUT-4 mRNA in gastrocnemius muscle of mice after weight-bearing swimming in each group表7各組小鼠力竭游泳后腓腸肌AMPK、mTOR和GLUT-4 mRNA的比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與靜止對照組比較，b與疲勞對照組比較，P＜0.05。

組別靜止對照組疲勞對照組疲勞+單糖組疲勞+火把花根多糖組F AMPK mRNA 1.13±0.59 1.34±0.57 1.51±0.51 2.20±0.82ab 3.181＊mTOR mRNA 1.18±0.62 1.14±0.90 1.57±0.87 2.62±0.95ab 4.007＊GLUT-4 mRNA 1.09±0.50 1.13±0.83 1.08±0.28 2.90±0.58ab 14.381＊＊

3 討論

運動性疲勞的研究從19世紀初開始，至今一直是運動醫(yī)學研究的熱點［12］。目前的研究表明，多種因素與運動能力相關，如體質(zhì)量增加、能量攝入不足、能源物質(zhì)耗竭均可能加速機體運動疲勞［13-14］。通常通過食物限制和力竭游泳產(chǎn)生的運動疲勞小鼠模型來評估藥物的抗疲勞作用［15］。

本研究未采取食物限制措施，所有小鼠均可自由攝取食物和飲水。小鼠攝食和飲水數(shù)據(jù)表明，火把花根多糖對小鼠攝食和飲水無影響，排除了小鼠能量攝入差異的可能?，F(xiàn)有的研究支持多糖類化合物通過調(diào)控糖脂代謝而降低小鼠體質(zhì)量［16］。筆者認為疲勞+火把花根多糖組小鼠體質(zhì)量的降低屬火把花根多糖藥理效應。除力竭游泳實驗外，本研究還設計了小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實驗。力竭游泳實驗方法與抑郁癥模型制備時采用的強迫游泳實驗類似，多次力竭游泳可能引起小鼠精神紊亂［17］，而未見疲勞轉(zhuǎn)棒實驗引起小鼠精神紊亂的報道，所以力竭游泳實驗在抗疲勞研究中通常被設計至實驗觀察終點作單次觀察?；鸢鸦ǜ嗵墙o藥第6天未見疲勞轉(zhuǎn)棒時間的顯著變化，而在給藥第13天可見疲勞轉(zhuǎn)棒時間較疲勞對照組顯著增加，表明火把花根多糖發(fā)揮抗疲勞作用需要一個持續(xù)的用藥周期。在給藥第14天，觀察到疲勞+火把花根多糖組力竭游泳時間顯著增加，進一步證實了火把花根多糖抗疲勞的作用。

既往對多糖的認識，涉及抗運動疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等功效［18］。機體運動時需要消耗大量的能源物質(zhì)，如糖類、脂肪和蛋白質(zhì)［19］。因此，多糖抗疲勞的研究廣泛集中于探討其對能量代謝的調(diào)節(jié)作用。本研究檢測了血清TG、GLU，PAS染色觀察了腓腸肌糖原的著色。TG是與脂肪代謝密切相關的指標，GLU、糖原是糖代謝的重要指標。研究結(jié)果顯示，火把花根多糖對血清TG無調(diào)控作用，而對血清GLU和PAS染色糖原的調(diào)控明顯，表明火把花根多糖調(diào)節(jié)糖代謝是發(fā)揮抗疲勞作用的重要途徑。

基于AMPK信號通路闡釋藥物抗疲勞機制是現(xiàn)行的主流趨勢，研究普遍認為AMPK對能量變化較為敏感，在急性運動中，骨骼肌收縮誘發(fā)AMPK信號通路激活以適應運動引起的全身代謝反應，從而維持能量平衡［6，20］。大部分觀點認為AMPK通路一旦被激活，會增加細胞對營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖的攝取，刺激分解代謝，抑制合成代謝，從而以負反饋的方式重建能量平衡，與腺苷三磷酸（ATP）消耗有關；小部分觀點則認為肌肉AMPK通路激活后維持細胞能量平衡并不一定會消耗ATP［21］。mTOR是生長因子和營養(yǎng)信號的整合器，整合上游的信號（如AMPK）進而調(diào)節(jié)細胞的生長［22］。GLUT-4跨膜轉(zhuǎn)運葡萄糖，在AMPK激活后扮演“搬運工”角色，促進能量平衡［23］。在本研究中，疲勞+火把花根多糖組小鼠AMPK、mTOR、GLUT-4與疲勞對照組比較顯著上調(diào)，可見火把花根多糖抗疲勞機制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路有關。

多糖為大分子化合物，由10個以上單糖通過苷鍵聚合形成，無法直接入血。有研究認為多糖通常在機體內(nèi)被降解為寡糖或單糖實現(xiàn)對機體的作用［16］。因此本研究按照火把花根多糖的單糖組成設置了疲勞+單糖組。與疲勞對照組比較，疲勞+單糖組小鼠各指標均未見顯著差異，表明單糖混合物不能發(fā)揮顯著抗疲勞作用，說明火把花根多糖抗疲勞作用可能與多種單糖的苷鍵聚合相關。而具體的苷鍵聚合特征有待進一步闡明。

綜上，火把花根多糖具有抗運動疲勞作用，其機制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路調(diào)控的糖代謝有關。