劉帥兵，閆墨，王楷斌，楊闊，王玉琢

前列腺癌（PCa）是全球男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，由于我國老年人口的占比越來越高，PCa的發(fā)病率和病死率也逐年增高［1］。盡管對于PCa的早期診斷和治療策略研究方面已取得了進(jìn)展，大多數(shù)PCa患者在確診時已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療手段局限于內(nèi)分泌治療和放療，患者的預(yù)后仍然較差［2-3］。G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族成員是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的大部分可用藥物的靶標(biāo)。然而，許多GPCR的生理作用和藥理特性仍然未知，部分內(nèi)源性配體未知的GPCR被稱為孤兒GPCR［4］。此類GPCR可能是PCa治療的可能靶標(biāo)［5］。一些孤兒GPCR，如GPRC6A和GPR160，已被證明與PCa細(xì)胞增殖和疾病進(jìn)展有關(guān)［6］。GPR19編碼一種進(jìn)化上保守的孤兒GPCR，最初是通過篩選人類表達(dá)序列數(shù)據(jù)庫（EST）確定的。其在成人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中呈高表達(dá)，在卵巢和睪丸組織中呈中度表達(dá)［7］。研究證實(shí)，GPR19在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平與生長優(yōu)勢相關(guān)［8］，也能通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白表達(dá)來影響乳腺癌的侵襲性［9］。但目前GPR19在PCa中的報道少見，本研究通過分析PCa患者中GPR19的表達(dá)水平，探討GPR19是否可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)PCa發(fā)展，為PCa的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 正常前列腺細(xì)胞系RWPE-1及6種PCa細(xì)胞系LNCaP、DU145、PC3、22RV1、C4-2、VCap均由天津市泌尿外科研究所凍存、復(fù)蘇；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶購自以色列BI公司；胎牛血清（FBS）購自中國MRC公司；RNA提取試劑盒購自美國Omega Biotek公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國光大公司，細(xì)胞總蛋白提取試劑、蛋白酶抑制劑、BCA法蛋白濃度測定試劑盒購自中國索萊寶公司；蛋白Marker、KSFM培養(yǎng)基和全自動酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；羅氏轉(zhuǎn)染試劑購自美國默克公司，EdU檢測試劑盒、兔抗GPR19抗體購自中國Abbkine公司；兔抗CDK1抗體、鼠抗GAPDH抗體、羊抗兔及羊抗鼠二抗均購自中國Proteintech公司。針對GPR19的特異性siRNA購自吉瑪基因（蘇州）。FV1000倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，PCR擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司。

1.2 生物信息學(xué)分析 利用R語言分析TCGA及Oncomine數(shù)據(jù)庫，得到GPR19在PCa中的差異表達(dá)情況；GEPIA網(wǎng)站分析GPR19的無進(jìn)展生存率；R語言“dplyr”包分析GPR19在不同臨床病理特征患者中的分布情況，“survival”包進(jìn)行Cox回歸分析；GSEA軟件進(jìn)行GPR19基因的通路富集分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常前列腺細(xì)胞系RWPE-1使用含有生長因子的K-SFM培養(yǎng)基，6種PCa細(xì)胞系均采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%左右進(jìn)行傳代。

1.4 Western blot待細(xì)胞密度生長至80%左右后用蛋白提取試劑提取總蛋白，BCA法測定所提蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液后95℃變性5 min。每孔加30μg蛋白行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)至NC膜。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，4℃過夜孵育GAPDH（1∶1 500），CDK1（1∶500），GPR19（1∶1 000）一抗，次日室溫孵育二抗1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法對蛋白條帶進(jìn)行成像處理。Image J軟件測量灰度值，計算目的蛋白表達(dá)量。目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 qPCR采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA（1 μg）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。GAPDH作為內(nèi)參對照。所用引物見表1。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃10 s、60℃20 s、72℃30 s進(jìn)行45個循環(huán)，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的LNCaP細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約2×105個細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后使用轉(zhuǎn)染試劑將細(xì)胞與siGPR19或者siRNA NC共同孵育4 h，分別設(shè)為siGPR19組和Control組。siRNA序列為：正義鏈5'-CCUUCACUAUGUGCUGAAATT-3'，反義鏈5'-UUUCAGCACAUAGUGAAGGTT-3'。通過qPCR檢測敲低效率，步驟同1.5。

1.7 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)siGPR19組和Control組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入EdU染料孵育4 h，然后對細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、孵育EdU檢測試劑，最后使用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察計數(shù)。藍(lán)色為DAPI進(jìn)行核定位，橙色為EdU染料標(biāo)記增殖細(xì)胞，細(xì)胞增殖率（%）=增殖細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用R（v3.6.3）及Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析PCa中GPR19的表達(dá)TCGA和Oncomine數(shù)據(jù)庫分析顯示，PCa組織中GPR19mRNA表達(dá)量高于癌旁組織，此外，在TCGA數(shù)據(jù)庫多個患者隊(duì)列信息中顯示GPR19表達(dá)升高的患者無進(jìn)展生存時間明顯縮短，見圖1。

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析GPR19 mRNA表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系 分析不同臨床特征患者GPR19表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，GPR19高表達(dá)比例無進(jìn)展死亡患者高于存活患者，Gleason評分＞7分患者高于≤7分患者，T3～T4期患者高于T1～T2期患者，年齡＞60歲患者高于≤60歲患者，見表2。

Fig.1 Bioinformatic analysis of GPR19 expression in prostate cancer圖1生物信息學(xué)分析GPR19在PCa中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

Tab.2 GPR19 expression in patients with different clinicopathological features表2不同臨床病理特征患者GPR19基因表達(dá)情況

2.3 影響PCa患者無進(jìn)展生存的Cox回歸分析 在單因素Cox回歸分析中，Gleason評分、TNM分期和GPR19表達(dá)是PCa患者無進(jìn)展生存的影響因素，見表3。但在多因素Cox分析中，僅Gleason評分＞7分是PCa的獨(dú)立危險因素，見表4。

2.4 不同PCa細(xì)胞系中GPR19 mRNA和蛋白表達(dá)情況 與正常前列腺細(xì)胞RWPE-1相比，PCa細(xì)胞系VCaP、LNCaP、C4-2、22RV1、PC3、DU145中GPR19 mRNA表達(dá)升高。Western blot結(jié)果也顯示，PCa細(xì)胞系中GPR19蛋白水平表達(dá)也有不同程度的升高，見表5，圖2。鑒于GPR19 mRNA及蛋白在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)均較高，后續(xù)使用LNCaP細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。

Tab.3 Univariate Cox regression analysis for prostate cancer relapse-free survival表3 PCa無進(jìn)展生存的單因素Cox回歸分析

Tab.4 Multivariate Cox regression analysis for prostate cancer relapse-free survival表4 PCa無進(jìn)展生存的多因素Cox回歸分析

2.5 GPR19敲除效率驗(yàn)證 在LNCaP細(xì)胞中，siGPR19組GPR19 mRNA表達(dá)低于Control組（0.10±0.02vs.0.99±0.01，n=3，t=16.056，P＜0.05）。

2.6 敲低GPR19對PCa細(xì)胞增殖的影響EdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，siGPR19組LNCaP細(xì)胞增殖率下降（33.24%±2.47%vs.45.79%±1.21%，n=3，t=12.164，P＜0.05），見圖3。

2.7 GPR19 GESA通路富集分析GSEA通路富集分析結(jié)果顯示，GPR19基因能夠被G2M信號檢查點(diǎn)、E2F信號靶點(diǎn)、精子發(fā)生、DNA修復(fù)等7個通路富集，見圖4。

Tab.5 Expression of GPR19 mRNA and GPR19 protein in each cell line表5各細(xì)胞系中GPR19 mRNA及其蛋白相對表達(dá)（±s）

Tab.5 Expression of GPR19 mRNA and GPR19 protein in each cell line表5各細(xì)胞系中GPR19 mRNA及其蛋白相對表達(dá)（±s）

＊P＜0.05；a與RWPE-1細(xì)胞比較，P＜0.05。

細(xì)胞系RWPE-1 C4-2 PC3 LNCaP VCaP 22RV1 DU145 F n3333333 GPR19 mRNA 0.989±0.029 2.104±0.120a 3.208±0.122a 8.661±0.354a 2.009±0.244a 1.701±0.052a 3.718±0.451a 331.000＊GPR19蛋白0.389±0.133 0.960±0.129a 0.745±0.148a 0.941±0.013a 0.416±0.297 0.329±0.272 0.724±0.225 5.478＊

Fig.2 Results of GPR19 protein expression in different PCa cell lines圖2不同PCa細(xì)胞系中GPR19蛋白表達(dá)結(jié)果

2.8 敲低GPR19對PCa細(xì)胞G2M信號檢查點(diǎn)通路的影響GPR19與G2M信號檢查點(diǎn)通路的關(guān)鍵基因CDK1存在較高的相關(guān)性（r=0.510），見圖5A；與Control組相比，siGPR19組CDK1的mRNA相對表達(dá)量降低（0.483±0.033vs.0.939±0.105，n=3，t=7.175，P＜0.05），Western blot結(jié)果顯示CDK1的蛋白表達(dá)也有降低趨勢，見圖5B。

2.9 GPR19影響PCa發(fā)生發(fā)展的下游靶基因的預(yù)測 由于在PCa中E2F信號靶點(diǎn)和G2M信號檢查點(diǎn)信號通路被預(yù)測為高度激活，這2個通路的基因組中發(fā)現(xiàn)有73個基因重疊，在這些共有基因中，CDKN3的表達(dá)與GPR19基因表達(dá)的相關(guān)性最高，見圖6。

Fig.3 The cell proliferation efficiency after GPR19 knockdown detected by EdU proliferation assay圖3敲低GPR19后EdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖效率

3 討論

目前GPR19在肺癌［7］、乳腺癌［8］、腎上腺癌［10］等腫瘤發(fā)病中的作用已被廣泛報道，但其在PCa中的致癌機(jī)制仍不清楚。本研究首先通過2個PCa獨(dú)立隊(duì)列研究的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，PCa患者中GPR19表達(dá)水平升高，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，GPR19的表達(dá)與Gleason評分、TNM分期、年齡、無進(jìn)展生存率相關(guān)，而Gleason評分是有力的預(yù)后預(yù)測因素，能夠更好地識別高風(fēng)險和低風(fēng)險患者［11］。單因素Cox分析中也發(fā)現(xiàn)GPR19的表達(dá)與無進(jìn)展生存有關(guān)，多因素Cox分析顯示GPR19并非預(yù)后的獨(dú)立影響因素，但從對其無進(jìn)展生存率及其他臨床特征關(guān)系的分析可以看出，GPR19對于PCa的發(fā)生發(fā)展仍具有一定的作用，因此，本研究從生物信息學(xué)及細(xì)胞行為學(xué)方面進(jìn)行驗(yàn)證，推測GPR19可能為PCa的研究提供新的靶點(diǎn)方向。

本研究進(jìn)一步通過qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)對生物信息學(xué)的預(yù)測進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCa細(xì)胞系的GPR19 mRNA和蛋白水平表達(dá)高于正常前列腺上皮細(xì)胞，與生信分析結(jié)果一致。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低GPR19后能夠降低腫瘤細(xì)胞的增殖效率。

為了探究GPR19在PCa中的作用機(jī)制，筆者對GPR19進(jìn)行GSEA通路富集分析，結(jié)果顯示在周期相關(guān)通路E2F信號靶點(diǎn)、G2M信號檢查點(diǎn)中有較高的富集分?jǐn)?shù)。E2F、G2M是細(xì)胞周期的特異性基因［12］，已有研究證實(shí)GPR19可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來影響肺癌的發(fā)展［7］。CDK1作為G2M信號檢查點(diǎn)上的關(guān)鍵蛋白分子，主要調(diào)節(jié)G2M相變，其功能也不能被其他CDK代替［13-14］。研究表明，CDK1不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，而且也在腫瘤細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用［15］。細(xì)胞質(zhì)中CDK1的積累與上皮性卵巢癌的存 活 率 相 關(guān)［16］。本 研 究 發(fā) 現(xiàn)，TCGA數(shù) 據(jù) 庫 中GPR19與CDK1 mRNA表達(dá)量具有一定的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲低GPR19后PCa細(xì)胞中CDK1的蛋白及mRNA表達(dá)均降低。因此，預(yù)測GPR19可能通過促進(jìn)CDK1的表達(dá)進(jìn)一步影響細(xì)胞周期，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖，這可能就是EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果siGPR19組細(xì)胞增殖率下降的原因。CDKN3作為與GPR19相關(guān)性較強(qiáng)的基因，已有研究［17］證實(shí)，其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和DNA復(fù)制來影響PCa，在其他癌癥如直腸癌、腎細(xì)胞癌、肝癌中也被證明發(fā)揮了一定作用［18-20］。以上研究提示GPR19可能與CDKN3存在上下游關(guān)系，共同通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來影響PCa的進(jìn)展。

Fig.4 Pathway enrichment analysis of GPR19 in prostate cancer圖4 PCa中GPR19的通路富集分析

Fig.5 The relationship of GPR19 and CDK1,a key molecule on the G2M checkpoint圖5 GPR19與G2M檢查點(diǎn)關(guān)鍵分子CDK1的相關(guān)性

Fig.6 Correlation between GPR19 and genes in the periodic pathway圖6 GPR19與周期通路中基因的相關(guān)性

綜上所述，本研究證實(shí)GPR19基因在PCa中高表達(dá)，并與多個臨床要素相關(guān)。下調(diào)GPR19表達(dá)可抑制PCa細(xì)胞的增殖及降低G2M信號檢查點(diǎn)關(guān)鍵分子CDK1的表達(dá)，預(yù)測CDKN3可能與GPR19共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期來影響PCa的發(fā)生與進(jìn)展。本研究為進(jìn)一步全面了解GPR19在PCa中的作用及后續(xù)的研究提供了有價值的信息。