龔雪蛟，秦 琳，黃穎博，張 翔，葉玉龍，李蘭英，堯 渝，王迎春，羅 凡*

（1 四川省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所, 四川成都 610066；2 國家土壤質量雅安觀測實驗站, 四川雅安 625014；3 四川省農(nóng)業(yè)科學院質量標準與檢測技術研究所, 四川成都 610066）

茶樹是我國重要的經(jīng)濟作物之一，茶葉因其獨特的風味口感和人體保健價值正成為僅次于水的世界第二大飲品[1]。茶鮮葉中的多酚類、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖等天然產(chǎn)物是加工形成優(yōu)質茶葉產(chǎn)品的物質基礎[2-3]，其含量高低及配比主要由茶樹品種決定[4-5]，同時受土壤、氣候等茶園環(huán)境[6-10]和栽培措施影響[11-14]。施肥直接影響茶園土壤養(yǎng)分含量及肥力，進而影響茶樹對養(yǎng)分的吸收利用和茶葉生化品質，對茶鮮葉綜合品質差異的貢獻度約為7.48%[15]。氮是茶樹營養(yǎng)“三要素”之一，過量施氮或施氮不足均不利于茶樹生長和茶葉品質，且過量施肥加重環(huán)境負荷，造成面源污染[16-18]。因此，茶園養(yǎng)分管理以氮肥投入為核心，大量研究圍繞“茶園適宜供氮”展開。有研究提出茶園年施氮肥300～450 kg/hm2[19]，最有利于茶鮮葉品質維持在較高水平；劉美雅等[20]研究表明茶園年施氮285～474 kg/hm2，茶葉氨基酸、β-芳樟醇、橙花叔醇含量顯著增加；劉揚等[15]提出福建省安溪縣鐵觀音茶園高產(chǎn)優(yōu)質的適宜施氮量為每年200～400 kg/hm2。Sun等[21]研究表明，分別以有機肥(牛糞)和尿素施入等量氮養(yǎng)分，茶葉中氨基酸、糖、脂肪酸的富集途徑差異明顯，牛糞處理使谷氨酰胺、奎寧酸和脯氨酸積累較多，而十八烷酸、十六烷酸和二十烷酸等有機酸含量顯著減少，所制綠茶感官品質更優(yōu)；Xie 等[22]建議用有機肥氮替代20%化肥氮；朱旭君等[23]研究認為有機肥替代化肥氮的比例在50%以上更有利于提高茶園產(chǎn)量和名優(yōu)綠茶品質。Tang等[24]研究表明，銨態(tài)氮較硝態(tài)氮更易被茶樹吸收利用。Li等[25]鑒定出AMT、NRT、AQP是調(diào)控茶樹氮吸收的關鍵基因，氮累積則受GOGAT和GS等基因控制，CHS、CHI、DFR與兒茶素合成相關[26]，不同供氮量和氮形態(tài)均會誘導相關基因差異表達。

黃酮類化合物是茶葉多酚物質的重要組分[27]，約為茶多酚含量的13%，占茶葉 (干重) 的3%～4%，是茶葉“苦澀、收斂”風味和保健功能的重要物質來源[1]。茶葉中的黃酮類代謝物主要有黃烷醇、花色素、黃酮和黃酮醇等[28]，除黃烷醇外，多以黃酮糖苷形式存在，如蕓香苷、槲皮苷、山奈苷、花色苷等[29]，是綠茶湯色“黃綠”的構成因子。除黃酮苷外，茶鮮葉中還存在其它糖苷類代謝物，如萜苷、皂甙、脂酰苷等，在內(nèi)源糖苷酶作用下釋放出單萜烯醇或芳香族醇等具有愉快花果香的游離態(tài)苷元，是茶葉香氣的主要前體物質[30]。不同茶葉品類[31-33]、不同茶樹品種[5]生化成分差異明顯，因而品質各異。茶葉中黃酮類代謝物的積累模式和調(diào)控機制隨不同氮素條件而存在顯著差異，Huang等[34]茶樹幼苗水培試驗表明，缺氮促進多種黃酮類物質累積，隨著氮供應量增加，黃酮類物質合成受到抑制。Dong等[35]茶樹幼苗盆栽試驗表明，茶葉中槲皮素-3-葡萄糖苷、山奈素-3-半乳糖苷等多種黃酮苷與蔗糖、果糖、葡萄糖含量呈顯著正相關，適量供氮誘導黃酮和碳水化合物代謝相關基因上調(diào)表達，從而促進黃酮苷合成，氮過量或缺氮均表現(xiàn)為抑制作用。Liu等[36]研究指出，茶樹嫩梢黃酮類物質的累積與茶樹根系、成熟葉片中的碳氮代謝密切相關，增加氮供應促進茶樹樹體碳向成熟葉和根系分配，導致嫩葉中用于黃酮類物質合成的“碳骨架”減少。就氮形態(tài)而言，硝態(tài)氮促進茶多酚、兒茶素合成相關基因表達和累積量增加，銨態(tài)氮促進茶氨酸、谷氨酸、精氨酸累積量增加[37]。此外，茶樹黃酮類物質還受植物激素調(diào)控，如孫平[38]研究發(fā)現(xiàn)，脫落酸(ABA) 處理后茶樹中苯丙烷途徑和類黃酮途徑的基因(DHD、SDH1等)表達均顯著上升。

然而，茶園栽培條件下，長期不同施氮方式對茶葉黃酮類及糖苷組分的影響鮮有研究。這些物質不僅是茶葉的重要品質成分，還能為深入了解茶樹對環(huán)境變化的生理響應提供重要信息[39-40]。本研究在四川茶樹種植的典型區(qū)域，通過連續(xù)3年田間試驗比較了不施肥、常量化肥氮、有機肥替代和減施氮肥對茶葉生化品質的影響，并基于非靶向代謝組學檢測結果，分析了不同施氮模式下茶葉黃酮類及糖苷類代謝物的累積差異，旨在豐富茶園養(yǎng)分高效管理及綠色生產(chǎn)的理論基礎，為實現(xiàn)茶葉優(yōu)質高產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于四川省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所國家土壤質量雅安觀測實驗站基地 (30°16′N、103°17′E，海拔766 m)，屬于亞熱帶季風性濕潤氣候，年平均氣溫15.8℃，無霜期297天，年降雨量1500 mm左右。茶園土壤類型為酸性黃壤土，0—20 cm土層土壤基礎理化性質為：pH 4.42、有機質 17.5 g/kg、全氮0.97 g/kg、全磷0.38 g/kg、全鉀 13.81 g/kg、硝態(tài)氮9.51 mg/kg、銨態(tài)氮 0.57 mg/kg、有效磷 12.7 mg/kg、速效鉀 147 mg/kg；20—40 cm土層土壤基礎理化性質為：pH 4.80、有機質 12.3 g/kg、全氮 0.79 g/kg、全磷 0.37 g/kg、全鉀 12.15 g/kg、硝態(tài)氮 5.80 mg/kg、銨態(tài)氮 1.48 mg/kg、有效磷13.4 mg/kg、速效鉀 92.0 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗設4個處理：1) 不施肥對照 (CK)；2) 常量化肥氮 (TF)；3) 與TF施氮總量一致，以有機肥氮替代25%化肥氮 (OF)；4) 采用茶樹專用配方肥，氮肥減量25%并增施鉀肥 (SF)。常量化肥氮施用量為 N 585 kg/hm2，試驗用氮磷鉀復合肥的N-P2O5-K2O為15%-15%-15%)，尿素含N 46.3%。供試有機肥為商品有機肥 (N-P2O5-K2O 3.2%-0.8%-1.0%)和茶樹專用配方肥 (N-P2O5-K2O 22%-9%-15%)。每年10月中旬開溝基施肥料，溝深20 cm，翌年春茶結束一次性撒施追施。每個處理設3次重復，共設12個試驗小區(qū)，小區(qū)面積約400 m2，隨機排列，不同小區(qū)間設2行隔離茶行。各處理病蟲害防治、茶園采摘、修剪等其它管理措施一致。試驗期為2016—2018年，各處理施肥量及年養(yǎng)分投入見表1。

表1 不同施肥處理年養(yǎng)分投入(kg/hm2)Table 1 Annual nutrient inputs of fertilization treatments in field experiment

1.3 樣品采集

2019年春季，于茶樹蓬面新梢30%通過一芽二葉物候期采摘一芽二葉鮮葉，隨機稱取各處理鮮葉500 g，采用蒸青固樣、自然陰干[41-42]，用于茶葉主要品質成分測定；另取100 g鮮葉立即放入液氮保存，用于LC-MS非靶向代謝檢測。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 光合生理指標測定 于天氣晴朗、無風少云之日，采用Li-COR 6800型植物光合測量系統(tǒng)進行光合生理指標采集。選取茶樹蓬面向光性良好的新梢成熟葉片 (第四片或第五片)，每個處理測定20個葉片(重復)、每個葉片采集10組數(shù)據(jù)，測定時間為2019年4月26日上午9：30—11：00。

1.4.2 茶葉品質成分含量測定方法 1) 茶多酚含量測定參照GB/T 8313—2018，采用分光光度法；游離氨基酸含量測定參照GB/T 8314—2013，采用茚三酮比色法；咖啡堿含量測定參照GB/T 8312—2013，采用高效液相色譜法；水浸出物含量測定參照GB/T 8305—2013，采用差量法；可溶性糖總量測定采用蒽酮比色法；茶氨酸含量測定參照GB/T 23193—2017，采用高效液相色譜法。酚氨比為茶多酚含量與游離氨基酸含量之比。

2) 黃酮類及糖苷類代謝物測定，稱取經(jīng)液氮研磨的茶鮮葉樣品50 mg，加入400 μL 提取液[V(甲醇):V(水)=4∶1]。采用高通量組織破碎儀低溫破碎(-20℃，50 HZ，6 min)。渦旋 (30 s) 混勻后，低溫超聲萃取30 min (5℃，40 KHz)。將樣品靜置 (-20℃，30 min) 后離心 (13000 g、4℃、15 min)，取上清液并轉移至LC-MS進樣小瓶中上機分析。

采用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質譜系統(tǒng)(AB SCIEX, UHPLC-Triple TOF) 進行非靶向代謝物檢測[31]。色譜條件：色譜柱為BEH C18 柱 (100 mm ×2.1 mm i.d., 1.7 μm; Waters, Milford, USA)；流動相A為去離子水 (含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈/異丙醇(1/1) (含0.1%甲酸)；進樣量10 μL，流速為0.40 mL/min，柱溫40℃。流動相洗脫梯度：0～3 min，95% A、5% B；3～9 min，80%～5% A、20%～95%B；保持4 min；13～16 min，95% A、5% B。質譜條件：分別采用正、負離子掃描模式，離子噴霧電壓(+5 kv、-4 kv)、噴霧氣50 psi、輔助加熱氣50 psi、離子源加熱溫度500℃、質量范圍50～1000 M/Z、碰撞電壓20～60 eV。

分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性采用質控樣品(QC)進行考察。質控樣品由所有檢測樣品混合而成，在儀器分析過程中，每3個樣品插入1個質控樣本，通過該樣本的重復性分析考察檢測過程中儀器穩(wěn)定性，同時篩查分析系統(tǒng)中變異較大的變量，保證結果的可靠性。

3) 黃酮類及糖苷類代謝物的鑒定，首先，將UPLC-Q-TOF/MS分析得到的原始數(shù)據(jù)導入代謝組學處理軟件Progenesis QI (Waters Corporation，Milford,USA)，進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，得到保留時間、質荷比和峰強度等質譜信息，并與代謝數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca/；https://metlin.scripps.edu)進行匹配，對檢測到的代謝物定性。然后，通過保留至少一組樣品中非零值80%以上的變量、原始矩陣極小值補缺、總峰歸一化、刪除質控樣本相對標準偏差(RSD)≥30%的變量等數(shù)據(jù)預處理，去除搜庫得分＜50.0的代謝物。最后，依據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫中物質分類及物質結構式篩選出黃酮類及糖苷類代謝物。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS 19.0 進行方差分析和LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對茶樹葉片光合作用的影響

如表2所示，胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(E)、葉片總導度 (GTW)、CO2總導度 (gtc) 均以高氮肥處理 (TF、OF) 最高，TF處理下茶樹葉片凈光合速率 (A) 和氣孔導度 (GSW) 顯著高于SF處理，與OF處理無顯著差異。這表明高氮肥促進了茶樹葉片與外界環(huán)境水分和氣體交換，增強了茶樹光合作用。

表2 不同施肥處理茶樹葉片光合生理參數(shù)Table 2 Photosynthesis parameters of tea leaves under different fertilization treatments

2.2 不同施肥處理茶葉主要品質成分含量變化

茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿、水浸出物、可溶性糖、茶氨酸是茶葉的主要品質成分。如表3所示，高氮肥量處理(TF、OF)的茶氨酸含量顯著高于減氮處理(SF)，這三者又顯著高于CK處理，TF、OF、SF處理茶氨酸含量較CK處理增加7.22%～13.40% (P＜0.05)?？Х葔A含量以TF處理最高，顯著高于OF、SF、CK處理，后3個處理之間咖啡堿含量無顯著差異。施肥顯著降低了茶葉可溶性糖含量而顯著增加了游離氨基酸含量，與CK處理相比，TF、OF、SF處理可溶性糖含量降低了8.17%～13.86%，游離氨基酸含量增加了23.15%～25.50%。茶多酚含量以CK處理較高，高氮肥處理TF、OF較CK處理分別降低9.35%、11.49%，氮肥減施處理(SF) 較CK處理降低6.08%，但差異不顯著。水浸出物含量以高氮肥處理(TF、OF)較高，對照(CK)和減氮處理(SF)較低。酚氨比以CK處理較高，TF、OF和SF處理間無顯著差異。

表3 不同施肥處理茶葉主要品質成分含量 (%)Table 3 The contents of main quality components in tea leaves under different fertilization treatments

與高氮肥處理 (TF、OF) 相比，氮肥減量25%并增施鉀肥處理(SF)茶氨酸、咖啡堿含量和水浸出物含量分別降低4.59%～5.45%、5.97% (SF比TF處理)、8.91%～10.33%，而游離氨基酸、可溶性糖、茶多酚含量無顯著變化。與TF處理相比，有機肥氮等量替代25%化肥氮處理 (OF) 咖啡堿含量降低5.73%，茶多酚、茶氨酸、游離氨基酸和水浸出物含量無顯著變化。

2.3 不同施肥處理茶葉中鑒定到的黃酮類及糖苷類代謝物

從圖1可以看出，本試驗檢測條件下，峰形良好，分布相對均勻，數(shù)據(jù)結果可靠。

圖1 質控樣本總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of quality control sample

如表4所示，不同處理茶葉樣品共檢測到黃酮類代謝物65種、糖苷類代謝物31種。黃酮類代謝物包括黃酮苷43種、異黃酮苷6種、黃酮4種、黃烷醇4種和其它黃酮類物質8種。糖苷類代謝物包括萜苷18種、脂酰苷7種、甾體皂甙5種、香豆素糖苷1種。LSD多重比較結果表明，66種代謝物累積水平在不同施肥處理間差異顯著，30種無顯著差異，說明施肥處理引起了茶葉黃酮類及糖苷類代謝物含量的改變。

表4 不同施肥處理茶葉中鑒定到的黃酮類及糖苷類代謝物Table 4 All the flavonoids and glucosides metabolites identified in tea under different fertilization treatments

續(xù)表4 Table 4 continued

續(xù)表4 Table 4 continued

2.4 減氮增鉀對黃酮類及糖苷類代謝物累積水平的影響

表5所示，與TF處理相比，SF處理顯著降低了4種黃酮苷 (楊梅酮-3-O-洋槐糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、查耳酮櫻花素、落新婦苷)，1種黃烷醇(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)，1種萜苷 (肉桂萜醇C1-19-葡萄糖苷)，1種脂酰苷 (1-辛烯-3-桑色素酊)，共7種代謝物累積水平，降幅3.08%～87.21%。其中，肉桂萜醇C1-19-葡萄糖苷降幅較大，為87.21%。SF顯著增加了1種黃酮 (川陳皮素)，2種黃酮苷 (牡荊素-4'-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、Ranupenin 3-rutinoside)和1種脂酰苷的累積水平，其中川陳皮素增幅最大，為414.02%。

表5 減氮增鉀茶葉中累積水平顯著變化的代謝物Table 5 Metabolites with significant accumulative changes in tea leaves under reducing N and increasing K input

2.5 有機肥替代對黃酮類及糖苷類代謝物的影響

表6顯示，與TF處理相比，OF處理顯著增加了飛燕草素-3-(6-對香豆?；肴樘擒?、牡荊素-4'-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、桃皮素-3'-葡萄糖苷等10種黃酮苷，2種黃酮(楊梅酮、川陳皮素)，去氫大豆皂苷Ⅰ、珠子參苷R2、京尼平苷酸等6種萜苷，苦瓜皂苷g、葫蘆素E-2-O-葡萄糖苷、孕甾烷甙等5種甾體皂甙和(S)-橙花叔醇-3-O-[a-L-鼠李糖吡喃醇-(1-＞2)-β-D-吡喃葡萄糖苷]等2種脂酰苷，共25種黃酮類及糖苷類代謝物累積水平。其中，川陳皮素、飛燕草素-3-(6-對香豆?；肴樘擒?增幅分別達2280.20%、1355.11%，其它23種代謝物累積量水平增加10.85%～60.83%。OF處理顯著降低了5種黃酮苷[楊梅酮-3-O-洋槐糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素-3-(3R-葡糖基蕓香苷)、查耳酮櫻花素]，2種黃酮多聚體(二氫黃酮、3'-沒食子酰原飛燕草素B2)，1種異黃酮苷(5,7-二羥基-2',6-二甲氧基異黃酮-7-鼠李糖苷)，1種萜苷(肉桂萜醇 C1-19-葡萄糖苷)，2種脂酰苷(1-辛烯-3-桑色素酊、5-大柱香波龍烷-3,9-二醇-9-[芹糖基-(1-＞6)-葡萄糖苷] )，共11種代謝物累積量水平，降幅為10.35%～68.89%。

表6 有機肥替代25%化肥氮茶葉中累積水平顯著變化的代謝物Table 6 The metabolites with accumulation level significantly varied in tea leaves under replacing 25% of chemical fertilizer N with organic fertilizer

續(xù)表6 Table 6 continued

2.6 不同施肥處理茶葉黃酮類及糖苷類優(yōu)勢代謝物鑒定

表7顯示，根據(jù)同一代謝物在不同施肥處理茶葉中相對豐度多重比較結果，將某處理下相對豐度顯著高于其它任一施肥處理的代謝物定義為該施肥處理的優(yōu)勢代謝物，則CK處理有10種，其中黃酮苷4種、黃烷醇2種、萜苷2種、脂酰苷1種、香豆素糖苷1種；OF處理有15種，其中黃酮1種、黃酮苷7種、萜苷3種、甾體皂甙4種；TF和SF處理未鑒定出黃酮類或糖苷類優(yōu)勢代謝物。OF處理下，川陳皮素和飛燕草素-3-(6-對香豆?；肴樘擒?相對豐度值較其他3種施肥模式的變化倍數(shù)分別達24.89、14.52。表明，不施肥處理和有機肥替代處理均促進了黃酮類及糖苷類物質累積。

3 討論

茶葉品質成分的形成與茶樹碳、氮代謝密切相關[36]。氮是茶樹營養(yǎng)“三要素”之一，在很大程度上決定著茶樹碳、氮代謝的平衡關系[43]，氮養(yǎng)分充足有利于增強茶樹氮代謝[44]，提高氨基酸、咖啡堿含量；缺氮茶樹氮代謝減弱，氨基酸類物質合成受阻，“碳骨架”更多被用于黃酮類及糖類物質合成[45]。本研究結果表明，不同施肥處理顯著影響茶葉主要品質成分含量，在檢測到的96種黃酮類及糖苷類代謝物中，多達66種代謝物的累積量在不同處理間差異顯著。

與CK相比，施肥處理(TF、OF、SF)使茶葉中茶氨酸和游離氨基酸含量顯著增加，茶多酚含量及酚氨比顯著降低，從而有利于提升茶湯“鮮爽”度[9,46]，這與Chen等[44]研究結果一致。同時，高量氮肥處理(TF)顯著增加了咖啡堿和水浸出物含量，表明適量氮肥可提升茶葉生化品質。另一方面，長期施氮會降低茶葉苯甲醇、苯乙醇、橙花叔醇等香氣物質含量，不利于茶葉香氣品質提升[44]，本研究中，TF、OF、SF處理下茶葉中 (S)-橙花叔醇-3-O-[a-L-鼠李糖吡喃醇-(1-＞2)-β-D-吡喃葡萄糖苷] 累積水平均顯著低于CK處理。茶園不施肥會增加茶多酚[20,47]、可溶性糖含量[36]，本研究進一步表明，這可能是簡單兒茶素 (表兒茶素、表沒食子兒茶素)、蕓香苷、槲皮苷、楊梅苷、紫蘇甙A等主要黃酮類及糖苷類物質累積量增加所致 (表7)。然而，不施肥處理(CK)茶樹凈光合速率未見顯著下降，可能與茶樹體內(nèi)的氮養(yǎng)分轉移機制[48]和低氮強烈誘導植物碳同化基因表達有關[49]，有待進一步研究。

在施氮585 kg/hm2水平上氮肥減量25%并大幅度提高鉀肥用量，茶樹凈光合速率、茶葉茶氨酸、咖啡堿、水浸出物含量顯著低于常量化肥氮處理(表2、表3)；同時，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)累積水平降低3.08% (表5)。茶氨酸和咖啡堿含量降低暗示了一定程度的氮養(yǎng)分缺乏。Dong等[35]研究認為，缺氮會導致碳同化能力減弱和碳水化合物合成量降低，進而影響糖苷物質累積。本研究中，SF處理下，楊梅酮-3-O-洋槐糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、落新婦苷和查耳酮櫻花素等4種黃酮苷和1-辛烯-3-桑色素酊、肉桂萜醇C1-19-葡萄糖苷累積水平顯著降低可能與茶樹凈光合速率降低有關。因此，從提高茶樹碳同化能力和茶葉生化品質角度，年施氮585 kg/hm2較440 kg/hm2更適合四川茶區(qū)，這一數(shù)值接近該地區(qū)茶園氮養(yǎng)分年平均用量573 kg/hm2，高于我國茶園氮肥推薦用量450 kg/hm2[50]。這是由四川茶區(qū)茶園以名優(yōu)綠茶原料為目標，密集采摘、蓬面多輪修剪、氮養(yǎng)分需求量大的生產(chǎn)特點所決定。

有機肥替代化肥是我國當前大力推廣的施肥模式。本研究顯示，施氮585 kg/hm2，有機氮替代25%化肥氮處理(OF)與等氮量化肥處理(TF)相比，除咖啡堿外，茶氨酸、游離氨基酸、水浸出物、可溶性糖、茶多酚含量和酚氨比未見顯著變化(表3)，但有36種黃酮類及糖苷類代謝物累積差異明顯(表6)。OF處理下，12種黃酮類和13種糖苷類代謝物累積水平顯著增加，8種黃酮類和3種糖苷類代謝物累積水平顯著降低。飛燕草素-3-(6-對香豆?；肴樘擒?、槲皮素-2''-(6''-對香豆?；咸腔?、山奈酚-3-[4''-(對香豆?；咸腔?鼠李糖苷]、山奈酚-3-(2",6"-二對香豆?；咸烟擒?等黃酮苷累積水平顯著增加表明OF處理促進了茶樹對香豆酸的合成，預示著茶樹苯丙烷類代謝[51]途徑活躍?？傮w來看，OF處理促進了茶樹黃酮類及糖苷類代謝物累積，有15種物質累積水平顯著高于其它處理(表7)。其中，部分物質具有良好的人體保健功能，如川陳皮素[52]、芹黃素[53]、牡荊素[54]、飛燕草素[55]、槲皮素[56]等；部分糖苷物質有助于增強茶樹抗逆性[57-58]，如飛燕草素及其苷能夠增強植物對多種生物和非生物因素脅迫的抗性[59]；同時，糖苷是形成茶葉香氣的主要前體物質，其含量增加利于提高茶葉香氣品質。因此，有機肥部分替代化肥是茶園化肥減施增效的有效途徑。本研究結果顯示，盡管OF處理促進了黃酮類及糖苷類代謝物累積，但茶多酚和可溶性糖含量并未相應增加。因此，有機肥施用下，茶樹體內(nèi)代謝物合成轉化關系尚需進一步研究。

表7 不同施肥處理茶葉黃酮類和糖苷類優(yōu)勢代謝物Table 7 Preponderant metabolites of flavonoids or glycosides in tea leaves under different fertilization treaments

續(xù)表7 Table 7continued

氮養(yǎng)分供應影響黃酮類物質累積已在茶樹和其它多種植物上得到證實[34-35]，減氮或低氮誘導黃酮類物質合成相關基因上調(diào)表達，從而促進黃酮類物質生物合成。本研究中，OF、SF處理較TF處理等量減少速效氮投入，受影響的黃酮類代謝物數(shù)量分別為20種(OF較TF)、8種(SF較TF)，表明SF處理對黃酮類物質的影響明顯小于OF處理，這可能與增施鉀肥提高了茶樹對土壤氮的利用能力有關。同時，前人研究表明，減少氮養(yǎng)分促進可溶性糖和茶多酚累積，抑制氨基酸合成[36,45]，而本研究中，與常規(guī)化肥處理相比，氮肥減量25% (SF)未引起三者含量及酚氨比的顯著變化，進一步證實了增施鉀肥對茶樹吸收利用土壤氮的促進作用。從有差異的黃酮類及糖苷類物質數(shù)量看，OF處理較TF處理有36種，SF處理較TF處理有11種，說明OF處理較SF處理對茶樹次級代謝產(chǎn)物的影響更強烈，這與有機肥養(yǎng)分種類豐富和改善土壤理化性狀能力強有關[21,60]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，與TF處理相比，楊梅酮-3-O-洋槐糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、牡荊素-4'-O-α-L-吡喃鼠李糖苷等9種物質累積水平在OF、SF處理表現(xiàn)出相似增減趨勢，推測茶葉中糖苷物質對氮養(yǎng)分的響應與黃酮類物質相似。

4 結論

茶園施肥顯著影響著茶葉品質成分含量及其組成。與常規(guī)化肥處理相比，以有機肥替代25%化肥氮降低了茶葉咖啡堿含量，提高了川陳皮素、飛燕草素、槲皮素、芹黃素、山奈酚、牡荊素等多種黃酮類代謝物和去氫大豆皂甙Ⅰ、珠子參苷R2、孕甾烷甙等多種糖苷組分累積水平。減施25%氮肥降低了茶氨酸、咖啡堿、水浸出物含量和糖苷類代謝物(如楊梅酮-3-O-洋槐糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、肉桂萜醇C1-19-葡萄糖苷等)累積水平，對茶多酚、可溶性糖、游離氨基酸含量和酚氨比影響較小。