何 丹，周慶安，楊銘芬，梁勇俊，張 兵*

（1.南寧市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001； 2.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001）

0 引言

在很多動物中，都會出現(xiàn)無漿體病。該病會嚴重危害動物的健康狀況，甚至導(dǎo)致動物的死亡[1]。因此，無漿體感染的危害極大。對于廣大養(yǎng)殖戶而言，需要高度重視這一疾病，以避免動物死亡所致的經(jīng)濟損失。

1 無漿體病原學(xué)概況

1.1 致病機理

在無漿體感染之后，動物體內(nèi)的中性粒細胞會受到感染，并受到無漿體剪應(yīng)力的影響，在穿過內(nèi)皮細胞時出現(xiàn)異常改變，無法正?；罨c分化[2]。同時，嗜吞噬細胞無漿體還可以對動物體內(nèi)肌動蛋白磷酸化產(chǎn)生影響，導(dǎo)致多種癥狀的出現(xiàn)。

1.2 臨床癥狀

在患病之后，無漿體感染山羊大多會表現(xiàn)出黃疸、貧血、發(fā)熱等癥狀。受到疾病的影響，動物會表現(xiàn)出精神狀態(tài)不佳，不愛活動，采食量下降等情況，體型不斷消瘦[3-4]。這一情況下，也嚴重影響到動物的生長發(fā)育，給養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟收益造成嚴重損害。

1.3 病理變化

感染無漿體病原之后，患病動物kene出現(xiàn)消瘦、貧血等情況，經(jīng)剖檢可以觀察到組織呈現(xiàn)出蒼白、黃疸等情況[5]。同時，患病動物的多個臟器會出現(xiàn)異常改變[6]。例如，動物心臟會出現(xiàn)腫大現(xiàn)象，心肌色但且質(zhì)地較軟。脾臟也會呈現(xiàn)出腫大狀態(tài)，被膜下還會出現(xiàn)分散分布的點狀出血。

2 南寧市石漠化地區(qū)山羊無漿體感染情況調(diào)查

2.1 材料

2.1.1 樣品來源

2019～2021年間在南寧市石漠化地區(qū)四個縣區(qū)采集到的山羊血液樣品1610份。其中武鳴區(qū)：700份，上林縣：350份，隆安縣：260份，馬山縣：300份。飼養(yǎng)模式包括舍飼和放牧兩種，品種有黑山羊和雜交山羊。所采集到的血液樣品，均置于EDTA—K抗凝管（2ml）中，并將其置冰箱中保存待檢，冰箱溫度設(shè)置為4℃。

2.1.2 試劑及儀器

此次調(diào)查所應(yīng)用的主要試劑與實驗儀器類型及其來源情況如表1所示：

表1 主要試劑與實驗儀器類型及其來源情況

2.1.3 引物

主要表面蛋白4（major surfaceprotein4，MSP4）是無漿體屬和種鑒定的重要基因[7]。本次檢測參考自參考de la Fuente等[8]報道合成檢測的山羊無漿體 MSP4基因的引物，上游引物 SF：5′－CCGGATCCTTAGCT GAACAGGAATCTTGC－3′；下游引物SR：5′－GGGAGCTCCTATGAATTACAGA GAATTGTTTAC－3′，預(yù)計擴增片段長度為870bp左右。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取

使用磁珠法核酸提取試劑盒提取DNA，所有操作均按照試劑盒說明書步驟：

（1）預(yù)封裝深孔板準備：取出預(yù)封裝深孔板，顛倒混勻數(shù)次使磁珠重懸，輕甩孔板使試劑及磁珠均集中到孔板底部（也可使用孔板離心機，500rpm×1min 進行離心），使用前小心撕去鋁箔封口膜，避免孔板振動，防止液體濺出。

（2）在試劑盒96孔板的第1、7列中分別加入20ul Protein K 和200ul全血樣品（樣品需平衡至室溫），放入全自動核酸提取儀中自動運行程序：①裂解，混合時間2min，磁吸時間0s；②移磁珠，混合時間1min，磁吸時間60s；③結(jié)合，混合時間10min，磁吸時間20s；④洗滌3次，混合時間各5min，磁吸時間各20s；⑤洗脫，等待時間5min，混合時間10min，磁吸時間120s，裂解加熱75℃；⑥棄磁珠，混合時間1min，磁吸時間0s。

（3）自動化程序結(jié)束后，將5、11列的DNA樣品轉(zhuǎn)移至干凈的無核酸酶離心管中。

2.2.2 PCR擴增

取200μlPCR專用管，連同陽性對照管和陰性對照管，每管加上述 5.0 μl DNA模板，8.0μl RNase Free dH20，10.0μl 2×1 step Buffer，1.0μl PrimeScript 1 step Enzyme Mix，上、下游引物各 0.5μl，PCR體系為 25μl；置PCR儀，94℃預(yù)變性3min，PCR循環(huán)條件為95℃ 50s，56℃ 50s，72℃50s，共35個循環(huán)，72℃延伸 10min。

2.2.3 電泳及結(jié)果判定

取PCR產(chǎn)物7μl，于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中含0.5μl /ml核酸替代染料，電泳緩沖液為0.5×TBE，80V 30分鐘，電泳完后于長波紫外燈下觀察拍照。陽性對照管和樣品檢測管出現(xiàn)870bp的特異性條帶判為陽性。

2.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

完整收集實驗獲得的各項數(shù)據(jù)結(jié)果，整理無誤后導(dǎo)入到統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0中進行處理。具體的陽性率均以百分比形式表示，數(shù)據(jù)組間比較實施卡方檢驗，差異顯著的標準為P＜0.05。

2.3 結(jié)果

2.3.1 PCR擴增結(jié)果

此次調(diào)查1610份山羊血液樣品檢出無漿體陽性30份，部分電泳圖如下。

圖1 山羊無漿體PCR擴增部分結(jié)果

2.3.2 放牧與舍飼模式下的山羊無漿體陽新率統(tǒng)計比較

統(tǒng)計并比較不同飼養(yǎng)模式下的山羊無漿體陽性率，可得放牧模式下的陽性率顯著高于舍飼模式，（P＜0.05）。詳細結(jié)果見表2：

表2 放牧與舍飼模式下的山羊無漿體陽新率統(tǒng)計比較

2.3.3 黑山羊與雜交山羊的無漿體感染陽率比較

黑山羊的陽性率顯著高于雜交山羊血液無漿體陽性率，（P＜0.05）。見表3：

表3 黑山羊與雜交山羊的無漿體感染陽率比較

2.3.4 山羊無漿體感染情況

此次研究中，一共采集到1610份山羊血液樣品，經(jīng)檢測，一共出現(xiàn)陽性樣品數(shù)量為30份，總陽性率為1.86%，具體如下表4所示：

表4 山羊無漿體感染情況統(tǒng)計

3 討論分析

3.1 無漿體感染在南寧市石漠化地區(qū)山羊中普遍存在，感染率較低

通過對所采集到的1610份山羊血液樣品進行檢測，共檢30份無漿體陽性，總陽性率為1.86%，總體來看，處于相對較低的水平，但仍然存在一定的危害，需要予以關(guān)注。同時，武鳴區(qū)、上林縣、隆安縣、馬山縣的樣品中均存在一定的陽性樣本。這一情況表明，無漿體感染在南寧市石漠化地區(qū)山羊中普遍存在。

3.2 放牧山羊血液中無漿體陽性率顯著高于舍飼羊

山羊的飼養(yǎng)方式方面，包括了舍飼和放牧兩種類型。通過此次研究發(fā)現(xiàn)，統(tǒng)計并比較不同飼養(yǎng)模式下的山羊無漿體陽性率，可得放牧模式下的陽性率為6.00%，明顯高于舍飼模式下的2.50%。分析相關(guān)原因，可能是因為無漿體感染的出現(xiàn)與硬蜱之間存在十分密切的聯(lián)系。在養(yǎng)殖過程中，如果通過放牧方式進行喂養(yǎng)，山羊在采食和活動的過程中，更容易被硬蜱叮咬。同時，在放牧過程中，動物極易對各種病原進行傳播，導(dǎo)致更多動物患病[9]。這一結(jié)果也提示，養(yǎng)殖戶們應(yīng)注意在放牧飼養(yǎng)的過程中，強化對環(huán)境的觀察以及對山羊的管理，積極做好硬蜱防控工作，以有效控制無漿體感染[10]。

3.3 不同品種山羊無漿體感染率存在差異

目前，在南寧市石漠化地區(qū)所飼養(yǎng)的山羊中包含了不同類型的山羊品種，在此次研究中，選擇對當?shù)貎煞N常見的山羊品種的血液樣本進行檢測。結(jié)果顯示，黑山羊陽性率明顯高于雜交山羊，可能與不同品種山羊在無漿體感染方面的易感性存在一定的差異等因素相關(guān)。

4 結(jié)語

在本次研究對南寧市石漠化地區(qū)山羊的無漿體感染情況開展了調(diào)查，初步掌握了南寧市石漠化地區(qū)的山羊無漿體感染現(xiàn)狀，無漿體感染在南寧市石漠化地區(qū)山羊中普遍存在，感染率較低；放牧山羊血液中無漿體陽性率顯著高于舍飼羊；不同品種山羊無漿體感染率存在差異?？傊?，無漿體感染對山羊養(yǎng)殖存在較大危害性，在山羊養(yǎng)殖過程中，還應(yīng)當高度重視無漿體病這一疾病。并積極地開展相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查和分析等工作，全面掌握本地區(qū)的無漿體感染情況，有針對性地開展相應(yīng)的預(yù)防和控制、治療等工作，切實提升本地區(qū)的山羊養(yǎng)殖水平。