閆修陽(yáng)，毛愛(ài)民，鄭硯超，馮嘉林，韓奇宏，陸宇超，金嘉旻

（1.無(wú)錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫 214174； 2.無(wú)錫市水產(chǎn)畜牧技術(shù)推廣中心，江蘇 無(wú)錫 214026）

小反芻獸疫（ Peste des petits ruminants，PP R）是由小反芻獸疫病毒（ Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊和綿羊。以高熱、口炎、胃炎、腹瀉和肺炎為特征。該病一年四季均可發(fā)生，易感羊群的發(fā)病率和病死率最高可達(dá)90%以上，該病是OIE法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。近年被納入國(guó)家動(dòng)物強(qiáng)制免計(jì)劃，由各級(jí)畜牧獸醫(yī)主管部門具體組織實(shí)施。由于疫苗的種類，羊的個(gè)體差異等疫因素其注射疫苗后產(chǎn)生抗體能否達(dá)到保護(hù)作用濃度，需要進(jìn)行檢測(cè)；目前檢測(cè)手段為Elisa方法；本文對(duì)一種快速檢測(cè)試紙條的制備，及其性能與Elisa試劑盒進(jìn)行了比對(duì)。

1 材料與方法

1.1 試紙條制備

1.1.1 試紙條制備所用試劑

小反芻獸疫蛋白、金標(biāo)復(fù)溶液：中德生物自產(chǎn)；羊抗兔二抗、兔抗：南京梓軒生物；氯金酸（HAuCl4）：分析純，美國(guó)Sigma公司；檸檬酸三鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)；牛血清白蛋白（BSA）：分析純，賽寶生物；其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PVC底板、NC膜、金標(biāo)墊、樣品墊、吸水墊：上海捷寧生物科技有限公司。

1.1.2 膠體金制備

稱取1.0 g氯金酸（HAuCl4），用超純水溶解后定容成1%的水溶液，0.45μm過(guò)濾后于4℃避光存放備用。稱取1.0g檸檬酸三鈉，用超純水溶解后定容成1%的水溶液，0.45μm過(guò)濾后于4℃避光存放備用。在磁力攪拌下，將2ml 1%氯金酸加入200ml的蒸餾水中加熱至沸騰，再向溶液中迅速加入2.7 ml檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱5min待溶液變?yōu)榫萍t色[1]。將溶液放置室溫使其自然冷卻，用分光光度計(jì)、電鏡掃描等，計(jì)算金膠體金顆粒直徑。

1.1.3 膠體金偶聯(lián)蛋白

用上述制備的膠體金分別偶聯(lián)兔抗、小反芻獸疫蛋白，其過(guò)程包括：最適pH、最佳蛋白偶聯(lián)濃度的確定；將制備好的金標(biāo)偶聯(lián)物以合適的噴金量，用噴金儀進(jìn)行噴金于金標(biāo)墊上，37℃干燥2h備用。

1.1.4 NC膜制備

以小反芻獸疫抗原作為NC膜上的檢測(cè)線（T線），羊抗兔二抗作為質(zhì)控線（C線），用PBS緩沖液（pH7.4，0.01mol/L，1% 甲醇）稀釋20倍（濃度為1.0 mg/ml），用噴膜儀以噴量1.0μl/cm噴于NC膜上；在檢測(cè)線上5mm處以噴量1.0μl/cm噴涂羊抗兔二抗（0.07mg/ml），將包被好的NC膜置于37℃干燥2h備用。

1.1.5 樣本墊、金墊制備

將樣品墊置于含1%BSA、2%葡萄糖、pH8.0、0.1mol/L 的Tris緩沖液中浸泡2分鐘，取出后50 ℃干燥2 h備用；將金標(biāo)墊置于含3%蔗糖、0.5%BSA、pH7.4、0.2mol/L的PBS緩沖液中均勻浸濕5分鐘，50℃干燥2h后備用。

1.1.6 試紙條制備

把NC膜、金標(biāo)墊、樣品墊、吸水墊貼在PVC底板上，使樣品墊與金標(biāo)墊重合0.2cm（長(zhǎng)度方向上），金標(biāo)墊與NC膜重合0.2cm（長(zhǎng)度方向上），NC 膜與吸水墊重合0.3cm（長(zhǎng)度方向上），組裝并切割成條。

1.1.7 試紙條靈敏度評(píng)價(jià)

將上述制備好的試紙條進(jìn)行性能測(cè)試，性能需達(dá)到檢測(cè)稀釋液時(shí)，只出現(xiàn)C線；檢測(cè)陰性樣本時(shí)，只出現(xiàn)C線；檢測(cè)陽(yáng)性樣本（疫苗免疫成功，抗體達(dá)到一定濃度）出兩條線。

1.1.8 試紙條批內(nèi)差異

取同個(gè)批號(hào)的試紙條，取不同塊大板的前、中、后各10條卡，測(cè)試同一個(gè)陽(yáng)性樣本，肉眼觀察檢測(cè)卡T、C線顯色均勻且一致，用掃描儀對(duì)色度進(jìn)行量化，T、C的CV值分別在5.8%、6.2%；批內(nèi)差異較小。

1.1.9 試紙條批間差異

取3個(gè)批號(hào)的試紙條，每批號(hào)各取10卡平行，測(cè)試同一個(gè)陽(yáng)性樣本，檢測(cè)結(jié)果，30卡T、C線顯色均勻且無(wú)明顯差異，用掃描儀對(duì)色度進(jìn)行量化，T、C的CV值分別在6.0%、6.5%；批間差異較小。

1.1.10 試紙條穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

穩(wěn)定性對(duì)于任何一種試紙條而言都是重要的性能參數(shù)，為了更好地測(cè)定實(shí)驗(yàn)研制試紙條的穩(wěn)定性，采用將試紙條保存于室內(nèi)常溫25℃、烘箱50℃加速老化，每隔5d進(jìn)行一次檢測(cè)，監(jiān)控一個(gè)月，同時(shí)將不同時(shí)間測(cè)試的數(shù)據(jù)進(jìn)行保存比較，觀察性能變化情況；一個(gè)月后對(duì)檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，其性能可以達(dá)到第一天的效果，測(cè)試與第0天相同樣本，T線有8.7%下降，C線有9.2%下降。穩(wěn)定性能穩(wěn)定。

2 Elisa試劑盒信息

小反芻試劑盒：廠家ID.VET 批號(hào)：2021.06.10

3 血清樣品信息

血清樣本由無(wú)錫動(dòng)衛(wèi)所提供。

4 結(jié)果及分析

用制備的膠體金檢測(cè)卡，測(cè)試動(dòng)衛(wèi)所收集的91份血清；同時(shí)用ID.VET小反芻ELISA試劑盒對(duì)這91份血清進(jìn)行測(cè)試；將兩者測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，觀察吻合效果；膠體金測(cè)試結(jié)果，陰性為只有C線，陽(yáng)性有T、C兩條線，結(jié)果如圖1、圖2、圖3；Elisa測(cè)試結(jié)果如表1。

表1 Elisa測(cè)試結(jié)果

圖1 膠體金測(cè)試結(jié)果1

圖2 膠體金測(cè)試結(jié)果2

圖3 膠體金結(jié)果3

結(jié)果：共測(cè)試了91份樣本，膠體金的結(jié)果與小反芻ID.VET ELISA試劑盒結(jié)果吻合度較高可以達(dá)到98.9%（90/91），其中一份判讀不吻合的樣本，ELisa結(jié)果為疑似樣本，膠體金檢測(cè)卡判讀陰性。

5 結(jié)論

膠體金檢測(cè)卡與ELisa結(jié)果吻合度較高，可初步替代ELisa進(jìn)行測(cè)試；性能基本吻合的情況下，膠體金可體現(xiàn)出，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，不需要儀器設(shè)備等較多優(yōu)點(diǎn)，后續(xù)可以繼續(xù)增加大量樣本測(cè)試。

鑒于Elisa試劑盒測(cè)試出的可疑樣本，膠體金測(cè)試出的弱陽(yáng)性樣本，對(duì)此類樣本建議重復(fù)測(cè)試，一旦結(jié)果依舊為疑似樣本，或者弱陽(yáng)性樣本，建議加強(qiáng)免疫等增加免疫抗體。