孟克巴依爾，朱莉仙*，其其格，聶 慧，艾爾青薩仁高娃，烏力吉，朝克圖

（1.阿拉善盟畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 阿拉善 750300； 2.阿拉善左旗吉蘭泰鎮(zhèn)綜合保障和技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 阿拉善 750333）

蒙古牛是我國北方優(yōu)良牛種之一。蒙古牛具有乳、肉、役多種用途，適應(yīng)性和抗逆性強，是我國珍貴的遺傳資源。近年來，由于草原牧區(qū)家畜牛雜交改良，純種蒙古牛數(shù)量和品質(zhì)大幅下降。目前純種蒙古牛主要分布在阿拉善盟，錫林郭勒盟和呼倫貝爾市有少量分布，其余地區(qū)已不復(fù)存在。蒙古牛數(shù)量的減少使品種內(nèi)的遺傳距離變得越來越窄，近親繁殖已經(jīng)不可避免，甚至出現(xiàn)退化現(xiàn)象，蒙古牛已經(jīng)處于瀕危維持狀態(tài)，應(yīng)當(dāng)大力加強保護和發(fā)展。2021年4月阿拉善左旗綠森種牛場通過國家級保種場的現(xiàn)場驗收。

目前，阿拉善蒙古牛保種最經(jīng)濟有效的方法是建立阿拉善蒙古牛的胚胎基因庫，關(guān)鍵技術(shù)是胚胎冷凍保存，但有關(guān)阿拉善蒙古牛胚胎冷凍的相關(guān)研究鮮見報道。為了有效保護好阿拉善地方蒙古牛品種優(yōu)質(zhì)資源，我們嘗試通過在阿拉善盟內(nèi)選擇優(yōu)秀的蒙古牛公牛和母牛，采集精液，利用現(xiàn)代胚胎技術(shù)，通過供體母牛超數(shù)排卵、采集胚胎等一系列生物技術(shù)而達到生物基因保種的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體牛的選擇

在阿拉善盟內(nèi)養(yǎng)殖蒙古牛的牧戶家，選擇阿拉善蒙古牛7頭（編號200002，200004，200010，200016，200022，200024，200026）和2頭優(yōu)質(zhì)成年種公牛（200001，200003）作為供體牛。選擇的2頭種公牛，年齡均超過4歲，體格健壯，性能力正常。所有供體牛體格健壯，無傳染性疾病、生殖系統(tǒng)疾病等，經(jīng)產(chǎn)母牛沒有空胎史，繁殖機能正常。

1.1.2 實驗藥品與器材

（1）實驗藥品

黃體酮陰道緩釋劑（CIDR），新西蘭DEC進口，規(guī)格黃體酮1.38g；

垂體促卵泡素（FSH），國產(chǎn)寧波三生，規(guī)格500單位；

氯前列醇注射液（PG），國產(chǎn)上海計勝，規(guī)格2ml：0.2mg；

促黃體素釋放激素A3，國產(chǎn)寧波第二激素廠，規(guī)格25μg/支；

沖胚液，美國ICP進口，規(guī)格1L；

保存液（Holding Solution），美國ICP進口，規(guī)格100ml；

冷凍液（乙二醇 1.5M），美國ICP進口，規(guī)格20ml；

鹽酸利多卡因注射液，國產(chǎn)山東華魯制藥，規(guī)格5ml：0.1g。

（2）實驗器材

顯微鏡，OLYMPUS；

胚胎冷凍儀，澳大利亞 CRYOLOGIC；

保定架、移植槍、滅菌塑料硬外套及軟外套、三通導(dǎo)管、剪毛推子、沖胚器（50ml注射器）、集卵杯等。

1.2 方法

1.2.1 母牛干乳

供體母牛產(chǎn)犢后，7d后斷乳，干乳，具體干乳時間見表1 。

表1 供體母牛干乳

1.2.2 超排處理

7頭母牛超排處理使用CIDR+FSH+PG方法，見表2。

表2 母牛超排處理方法（FSH是7頭母牛平均超排注射量）

1.2.3 母牛人工授精

母牛與公牛采取隔離狀態(tài)，觀察確定母牛的發(fā)情時間。選擇200001號種公牛人工授精。采用電刺激法采集精液，精液采集完鏡檢合格后裝0.5ml細管7支，避光。一般情況下，每隔12h授精一次，每次輸精一支，共授精3次。

1.2.4 胚胎采集

供體母牛受精日計0d，輸精第7d采集胚胎，沖胚之前，所用的儀器、器皿等經(jīng)過嚴(yán)格的消毒滅菌處理，采用二路沖卵管法進行非手術(shù)沖卵。

首先將牛保定，用2%的利多卡因?qū)嵭形沧涤材ね饴樽恚嗫ㄒ蛴昧?～10ml，直至尾部無知覺。麻醉后將牛尾固定，清除糞便，清洗、消毒會陰部及外陰。

用擴宮棒擴張子宮頸，然后插入宮頸粘液器將粘液抽出，隨后把帶剛芯的沖卵管慢慢插入陰門，達到子宮角前端。沖卵管先沖一定氣量10～20ml，最后抽出內(nèi)芯。

連接沖胚和三通導(dǎo)管。用50ml注射器吸取沖胚液從輸入管注入子宮角，然后吸回，一般情況下一側(cè)子宮角需沖6～8次，用300～400ml沖胚液。沖卵完成后，將氣囊空氣放出，沖卵管抽至子宮體，灌注青霉素、鏈霉素藥物預(yù)防子宮炎。

1.2.5 胚胎處理及冷凍保存

胚胎處理：將回收液緩慢倒入集卵杯內(nèi)，用帶針頭的一次性注射器抽取沖胚液，沖洗集卵杯濾網(wǎng)3～4次，最后保留10ml左右液體倒入Ф100mm培養(yǎng)皿中，進行鏡檢。劃分區(qū)域檢查、避免遺漏。用移液器將檢出胚胎移至盛有保存液的Ф35mm培養(yǎng)皿中。同一供體牛的胚胎放于同一培養(yǎng)皿液滴中，然后用移液器先吸入少量第二滴保存液到第一液滴，吸入全部胚胎，防止吸入黏液、雜質(zhì)，移至第二滴中，一次沖洗胚6～8次。

胚胎裝管：即五段液體、四個氣泡。細管塞上需記錄好胚胎明細：供體牛號、胚胎數(shù)量、質(zhì)量、日期等。裝管后平衡10min左右。

胚胎冷凍：先將冷凍室內(nèi)加少許液氮預(yù)冷，預(yù)冷后加入足量液氮，將裝有胚胎的細管放入冷凍室，至制冰溫度時，平衡，進行植冰，70min后，將胚胎細管投入液氮保存。

2 結(jié)果

2.1 超排效果

選擇7頭阿拉善蒙古牛母牛進行超排，共采卵7頭次，采集卵數(shù)12枚，其中4枚可用胚胎，具體見表3。

表3 阿拉善蒙古牛母牛超排效果

2.2 胚胎形態(tài)學(xué)

3頭供體母牛的胚胎形態(tài)如圖1，經(jīng)鑒定，胚胎等級見表2。

圖1 供體母牛胚胎形態(tài)

3 討論

3.1 影響超排效果可能的因素

影響超數(shù)排卵效果因素很多[1]。供體牛的營養(yǎng)情況也是影響超排反應(yīng)的一種重要因素，因為營養(yǎng)狀態(tài)優(yōu)良的供體牛，其卵巢功能好，排卵多，而營養(yǎng)狀態(tài)較差的牛排卵較少影響超排反應(yīng)[2]。Prakash 等[3]研究表明，供體體況對于超排反應(yīng)具有重要的影響，體況差的牛導(dǎo)致并加劇黃體的早期退化（發(fā)情后 6～8 h），嚴(yán)重影響超排效果，退化嚴(yán)重時，甚至無法得到胚胎。

研究表明，季節(jié)和環(huán)境的變化會顯著影響超排效果[4]。即使在同一季節(jié)、氣候條件、營養(yǎng)水平不同，動物的感受刺激也不盡相同，它們影響動物的超排效果[4]。一般的說，嚴(yán)寒、酷熱均對家畜造成應(yīng)激，這些極端刺激對生理的不良影響會作用于生殖內(nèi)分泌軸，繼而影響到發(fā)情和排卵[5]。

在生產(chǎn)實踐中，如用經(jīng)產(chǎn)母牛作為供體，一定要嚴(yán)格選擇并了解經(jīng)產(chǎn)牛的產(chǎn)犢歷史、胎衣排出情況及產(chǎn)犢時間，同時了解經(jīng)產(chǎn)牛的胎次及年齡，調(diào)整FSH的劑量，這在超排實踐中非常重要[6]。實踐證明，產(chǎn)犢后3個月的母牛超排才能達到理想的效果[6]。

與吳柱月等報道[7]：“（包括西門塔爾、短角牛、Lowlone 牛）的超排效果：頭均可用胚胎數(shù)：青年牛為5.9～7.2枚，經(jīng)產(chǎn)牛為5.8～7.5枚，”相比之下，阿拉善蒙古牛的超排效果很差，這是否與蒙古牛品種有關(guān)還是使用的藥品原因？以及種公牛人工授精的效果有差異？阿拉善蒙古牛母牛的超排尚未見有報道。牛的超數(shù)排卵是一個復(fù)雜的生理過程，受很多因素的影響：包括品種、生物學(xué)特性、年齡、季節(jié)、時間、FSH品牌及劑量、卵巢狀態(tài)、超排方法及飼養(yǎng)管理水平等等因素的影響[8]。阿拉善蒙古牛的超排效果是否就是現(xiàn)在試驗的效果，有待進一步的實驗研究。