程繼業(yè)，周震宇，金偉斌，陳禮峰，姚玲

蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）又稱聚氧乙烯醇，由環(huán)氧乙烷與乙二醇在堿性催化劑催化下聚合而成，分子量在200～35000之間，常見種類有PEG 200、PEG 400、PEG 2000、PEG 4000以及PEG 6000等。PEG具有優(yōu)良的潤滑性、保濕性、分散性、生物相容性，在制藥以及日用化學等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。低分子量PEG（分子量為200～400）常作為軟膠囊劑、注射液、滴眼劑中的溶劑或助溶劑以增加藥用成份的溶解度［1］；中高分子量PEG（分子量為2000～8000）在片劑、栓劑、經(jīng)皮制劑中常作為基質(zhì)、骨架材料，發(fā)揮緩控釋作用［2］。不同分子量的PEG對臨床療效、制劑的釋藥性能具有重要影響［3-5］。

目前各國藥典收載的PEG類化合物分子量的測定方法均為酸堿滴定法，通過測定分子鏈末端氫氧根數(shù)量，折算平均分子量。該方法操作過程繁瑣，使用的試劑對實驗人員和環(huán)境毒性較大，影響實驗結(jié)果的因素較多，并且不能得到分子量分布信息［6-8］。高效凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）利用體積排阻原理可有效分離PEG化合物，且配合特定的色譜應(yīng)用軟件可對色譜行為進行統(tǒng)計分析并測定重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）、標示分子量（Mp）、分布系數(shù)等關(guān)鍵信息，近年來在多分散化合物研究中應(yīng)用廣泛［9-13］。

本研究以國內(nèi)市售的3家企業(yè)多批PEG 3350樣品為研究對象，采用GPC技術(shù)，對關(guān)鍵的色譜條件及軟件處理參數(shù)進行系統(tǒng)考察并探討影響測定結(jié)果準確度的各種實驗因素，以期為《中國藥典》（2020版）中收錄的相關(guān)高分子化合物分子量分布測定的正確實施提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

硝酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150508，分析純）；ProClinTM（SIGMA-ALDRICH，批號：MKCH7182）；PEG對照品（德國PSS公司，批號：pegkit-08，分子量范圍 106～11100）；PEG 3350樣品9批（A企業(yè)產(chǎn)品批號：180810387、180810388、180810389；B企業(yè)產(chǎn)品批號：35187、35188、35189；C企業(yè)產(chǎn)品批號：4453325、4447021、4480104；編號依次為 A1～A3、B1～B3、C1～C3）。

1.2 儀器

e2695-2414高效液相色譜儀、示差折光檢測器、Empower 3 GPC軟件（美國Waters公司）；XS205DU電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；0.22μm微孔濾膜（國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱（300mm×7.5mm，8μm）；流動相為0.1mol/L硝酸鈉溶液（含0.02% ProClinTM）；流速為0.5ml/min；柱溫為35℃；檢測器溫度為35℃；進樣體積為100μl。

2.2 溶液的制備

流動相：取8.5g硝酸鈉，用超純水溶解，加入0.2ml ProClinTM，用超純水稀釋至1L，混合均勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

對照品溶液：精密稱取不同分子量PEG對照品各50mg，分別用流動相完全溶解并稀釋至25ml，搖勻。

供試品溶液：精密稱取樣品0.1g，用流動相溶解并稀釋至50ml，搖勻。

2.3 測定方法

分別取對照品溶液和供試品溶液100μl，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。其中，對照品設(shè)定為窄分布標準進樣，供試品設(shè)定為寬分布樣品進樣。對照品屬性中輸入相應(yīng)PEG的Mp及分布系數(shù)，以主峰保留時間（t）為橫坐標、以分子量對數(shù)（logM）為縱坐標，擬合三階校正曲線?；谠撔Ｕ€進行回歸計算，得到供試品對應(yīng)色譜峰的分子量信息（Mn、Mw）及分布系數(shù)。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液（Mp 3450）100μl，連續(xù)進樣5次，結(jié)果PEG 保留時間的RSD為0.23%。

2.5 重復(fù)性試驗

精密稱取0.1gA1樣品，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，結(jié)果樣品的Mw分別為3363、3349、3358、3362、3354、3341，RSD 為 0.25%。

2.6 進樣濃度

考察樣品稱樣量在±20%范圍內(nèi)變化時對結(jié)果的影響。取適量A1樣品，按“2.2”項下方法分別配制濃度為1.6、1.8、2.0、2.2、2.4mg/ml的溶液并進行測定，結(jié)果與“2.5”項下結(jié)果基本一致。由于本實驗以主峰保留時間作為分子量計算的依據(jù)，因此進樣濃度在小范圍內(nèi)變化對實驗結(jié)果無影響。

2.7 線性與范圍

取PEG對照品（Mp分別為430、1030、2100、3450、5800），按“2.2”項下方法分別制成對照品溶液，按“2.3”項下方法進行測定（色譜圖見圖1），并建立三階校正曲線（圖2A）?；貧w方程為LogM=0.00665t3- 0.372t2+6.59t-33.710， 相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，各校正點的殘差均小于2.0%（-0.095%～1.127%），表明分子量在430～5800范圍內(nèi)時線性關(guān)系良好。

圖1 PEG對照品（Mp 430、1030、2100、3450、5800）的色譜圖

圖2 PEG對照品（A：Mp 430～5800；B：Mp 106～11100）的三階校正曲線

2.8 穩(wěn)定性試驗

取對照品（Mp 3450）溶液和供試品（A1、B1、C1）溶液，室溫放置，分別于0、4、8、12、24h進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果對照品和供試品的色譜峰形均無改變，峰高均無變化，保留時間的RSD均小于0.53%，表明待測樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，且色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性也良好。

2.9 準確度試驗

與外標法不同，GPC法測定分子量是以主成分峰的保留時間為計算基礎(chǔ)，不能用對照品進行回收率試驗，因此本研究設(shè)計了校正曲線檢查，以驗證方法的準確性。取Mp為2100、3450和5800的PEG對照品各3份，按“2.3”項下方法分別進行測定，用已建立的校正曲線計算各對照品的Mw，并與Mp比較，計算相對偏差（表1）。3個分子量水平的PEG平均偏差分別為101.41%，99.05%，100.34%，表明方法準確度好。

表1 校正曲線的準確度

2.1 0樣品測定

取 9 批樣品（A1～A3；B1～B3；C1～C3），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并進樣測定。結(jié)果各批次樣品的分布系數(shù)均低于1.1，各企業(yè)內(nèi)3批樣品間分子量較接近（RSD均低于2%），提示生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。根據(jù)產(chǎn)品標準，3家企業(yè)的樣品均符合規(guī)定，但樣品分子量差異明顯，表現(xiàn)為A企業(yè)＞B企業(yè)＞C企業(yè)，見表2。

A企業(yè)樣品均值更接近標示值3350，但分析色譜圖發(fā)現(xiàn)B、C企業(yè)樣品色譜峰更對稱平滑，而A企業(yè)樣品色譜峰有小的前沿峰，色譜圖見圖3。根據(jù)體積排阻色譜原理，分子量大的成份應(yīng)更早洗脫出色譜柱，提示A企業(yè)樣品中含有一定比例且分子量集中的高分子組份。本研究對GPC系統(tǒng)得到的各批樣品累積分布曲線進行比較，依據(jù)分子量從高到低，選取10%和90%分位點所對應(yīng)的分子量，見表2。結(jié)果可見，A企業(yè)3批樣品高分子量區(qū)的10%分位點對應(yīng)分子量大于B、C企業(yè)樣品，但低分子量區(qū)差別較小；A企業(yè)樣品分子量分布寬度明顯大于B、C企業(yè)樣品，表明B企業(yè)和C企業(yè)樣品的純度更高。以往方法通過分布系數(shù)（Mw/Mn）來評價樣品的分布寬度，而本研究表明，分布系數(shù)并不能有效評價樣品實際分布情況。因此，建議在分子量分布的測定方法中，應(yīng)根據(jù)測得的累積分布曲線增加分布寬度要求以加強對樣品多分散屬性的控制，例如規(guī)定10%～90%分位點對應(yīng)的分子量寬度。

圖3 3家企業(yè)樣品（A1、B1、C1）分子量分布檢測色譜圖

表2 9批PEG 3350的分子量測定結(jié)果

續(xù)表

3 討論

3.1 色譜方法的選擇

建立方法時要對分析物的分子量進行初步判斷并選擇合適的色譜柱［10-11］。本研究對比了Shodex OHpak SB-803 HQ、Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱，前者適合分子量為200～40000 Da的PEG類化合物，后者適合100～20000Da。結(jié)果表明，Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱獲得的PEG峰型對稱、峰寬較小且對不同分子量PEG的保留區(qū)分適當，故選擇Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱進行實驗。

流動相中加入無機鹽可維持溶液的離子濃度，獲得良好色譜峰形。本研究考察了在流動相中加入0.01～0.5mol/L硝酸鈉或者氯化鈉時的色譜峰型、柱效及不同PEG分子量的色譜峰分離度情況。結(jié)果表明，流動相中加入硝酸鈉后基線噪音更?。?］；較低濃度（0.01～0.05mol/L）時PEG色譜峰展寬，且不同分子量的主峰分離度下降，而濃度為0.1mol/L時較適宜。本研究所采用的ProClinTM是有機抑菌劑，對人和動物毒性低、對環(huán)境友好，與傳統(tǒng)分析方法使用的疊氮化鈉相比，可有效避免實驗過程中對實驗人員和環(huán)境的危害。

3.2 校正曲線的選擇

使用GPC 系統(tǒng)測定化合物分子量時，首先要確定標準曲線類型。本研究比較了一階～五階曲線對測定結(jié)果準確度的影響，在Mp 2100、3450、5800這3個分子量對照品校正點處，三階曲線擬合準確度最好（均小于2.0%），一階和二階曲線準確度較低，四階及更高階曲線由于校正點數(shù)少及分子量范圍小而不適合本研究，因此選擇三階曲線進行分析。本研究以Mp為430～5800范圍內(nèi)的共5個對照品和Mp為106～11100范圍內(nèi)的共8個對照品分別建立校正曲線，并進行準確度檢查。結(jié)果表明，圖2A中5個點殘差均在2.0%以內(nèi)，圖2B中只有Mp 3450處較小，其余各點均大于2.0%，隨著分子量減小有明顯增大的趨勢。該結(jié)果表明以Mp為430～5800的5個對照品建立的曲線范圍是合適的，且建立方法所用對照品數(shù)量和校正曲線的范圍應(yīng)與特定分子量的待測物相適合，利用殘差值可對方法測定準確性進行評估。

3.3 對質(zhì)量標準修訂的建議

目前，對于特定分子量的待測樣品，如何確定校正曲線的合適范圍以及系統(tǒng)適用性試驗的指標尚無相關(guān)論述［9-13］?！吨袊幍洹罚?020版）收載了PEG系列輔料的分子量分布測定方法，但未對方法適用性作出具體要求。對于開展這類工作較少的實驗室，方法適用性的缺失不利于評估儀器系統(tǒng)的狀態(tài)和測試的準確性?；诒狙芯拷Y(jié)果，建議將校正曲線相關(guān)參數(shù)（如曲線類型、回歸系數(shù)、殘差限度）納入PEG系列輔料的分子量分布測定方法的系統(tǒng)適用性項下，完善質(zhì)量標準、提高可執(zhí)行度。在質(zhì)量標準中，建議除規(guī)定Mw數(shù)值和分布系數(shù)以外，必要時增加分布寬度要求，例如規(guī)定10%～90%分位點處的分布寬度，以加強對產(chǎn)品多分散屬性的控制。

4 小結(jié)

本研究建立了一種測定分子量在430～5800范圍內(nèi)PEG的GPC方法。該方法結(jié)果準確、重現(xiàn)性好，有助于獲得Mw、分布系數(shù)、累積分布寬度等多分散化合物特征信息，可用于PEG樣品的質(zhì)量控制和比對，在一定程度上為制劑研發(fā)中輔料的篩選以及國家標準的提高提供了參考。