程繼業(yè)，周震宇，金偉斌，陳禮峰，姚玲

蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215104

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）又稱(chēng)聚氧乙烯醇，由環(huán)氧乙烷與乙二醇在堿性催化劑催化下聚合而成，分子量在200～35000之間，常見(jiàn)種類(lèi)有PEG 200、PEG 400、PEG 2000、PEG 4000以及PEG 6000等。PEG具有優(yōu)良的潤(rùn)滑性、保濕性、分散性、生物相容性，在制藥以及日用化學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。低分子量PEG（分子量為200～400）常作為軟膠囊劑、注射液、滴眼劑中的溶劑或助溶劑以增加藥用成份的溶解度［1］；中高分子量PEG（分子量為2000～8000）在片劑、栓劑、經(jīng)皮制劑中常作為基質(zhì)、骨架材料，發(fā)揮緩控釋作用［2］。不同分子量的PEG對(duì)臨床療效、制劑的釋藥性能具有重要影響［3-5］。

目前各國(guó)藥典收載的PEG類(lèi)化合物分子量的測(cè)定方法均為酸堿滴定法，通過(guò)測(cè)定分子鏈末端氫氧根數(shù)量，折算平均分子量。該方法操作過(guò)程繁瑣，使用的試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境毒性較大，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素較多，并且不能得到分子量分布信息［6-8］。高效凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）利用體積排阻原理可有效分離PEG化合物，且配合特定的色譜應(yīng)用軟件可對(duì)色譜行為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并測(cè)定重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）、標(biāo)示分子量（Mp）、分布系數(shù)等關(guān)鍵信息，近年來(lái)在多分散化合物研究中應(yīng)用廣泛［9-13］。

本研究以國(guó)內(nèi)市售的3家企業(yè)多批PEG 3350樣品為研究對(duì)象，采用GPC技術(shù)，對(duì)關(guān)鍵的色譜條件及軟件處理參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)考察并探討影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的各種實(shí)驗(yàn)因素，以期為《中國(guó)藥典》（2020版）中收錄的相關(guān)高分子化合物分子量分布測(cè)定的正確實(shí)施提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

硝酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150508，分析純）；ProClinTM（SIGMA-ALDRICH，批號(hào)：MKCH7182）；PEG對(duì)照品（德國(guó)PSS公司，批號(hào)：pegkit-08，分子量范圍 106～11100）；PEG 3350樣品9批（A企業(yè)產(chǎn)品批號(hào)：180810387、180810388、180810389；B企業(yè)產(chǎn)品批號(hào)：35187、35188、35189；C企業(yè)產(chǎn)品批號(hào)：4453325、4447021、4480104；編號(hào)依次為 A1～A3、B1～B3、C1～C3）。

1.2 儀器

e2695-2414高效液相色譜儀、示差折光檢測(cè)器、Empower 3 GPC軟件（美國(guó)Waters公司）；XS205DU電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；0.22μm微孔濾膜（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱（300mm×7.5mm，8μm）；流動(dòng)相為0.1mol/L硝酸鈉溶液（含0.02% ProClinTM）；流速為0.5ml/min；柱溫為35℃；檢測(cè)器溫度為35℃；進(jìn)樣體積為100μl。

2.2 溶液的制備

流動(dòng)相：取8.5g硝酸鈉，用超純水溶解，加入0.2ml ProClinTM，用超純水稀釋至1L，混合均勻，用0.22μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取不同分子量PEG對(duì)照品各50mg，分別用流動(dòng)相完全溶解并稀釋至25ml，搖勻。

供試品溶液：精密稱(chēng)取樣品0.1g，用流動(dòng)相溶解并稀釋至50ml，搖勻。

2.3 測(cè)定方法

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液100μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。其中，對(duì)照品設(shè)定為窄分布標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣，供試品設(shè)定為寬分布樣品進(jìn)樣。對(duì)照品屬性中輸入相應(yīng)PEG的Mp及分布系數(shù)，以主峰保留時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)、以分子量對(duì)數(shù)（logM）為縱坐標(biāo)，擬合三階校正曲線。基于該校正曲線進(jìn)行回歸計(jì)算，得到供試品對(duì)應(yīng)色譜峰的分子量信息（Mn、Mw）及分布系數(shù)。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液（Mp 3450）100μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果PEG 保留時(shí)間的RSD為0.23%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取0.1gA1樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，結(jié)果樣品的Mw分別為3363、3349、3358、3362、3354、3341，RSD 為 0.25%。

2.6 進(jìn)樣濃度

考察樣品稱(chēng)樣量在±20%范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)結(jié)果的影響。取適量A1樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法分別配制濃度為1.6、1.8、2.0、2.2、2.4mg/ml的溶液并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果與“2.5”項(xiàng)下結(jié)果基本一致。由于本實(shí)驗(yàn)以主峰保留時(shí)間作為分子量計(jì)算的依據(jù)，因此進(jìn)樣濃度在小范圍內(nèi)變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。

2.7 線性與范圍

取PEG對(duì)照品（Mp分別為430、1030、2100、3450、5800），按“2.2”項(xiàng)下方法分別制成對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定（色譜圖見(jiàn)圖1），并建立三階校正曲線（圖2A）?；貧w方程為L(zhǎng)ogM=0.00665t3- 0.372t2+6.59t-33.710， 相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，各校正點(diǎn)的殘差均小于2.0%（-0.095%～1.127%），表明分子量在430～5800范圍內(nèi)時(shí)線性關(guān)系良好。

圖1 PEG對(duì)照品（Mp 430、1030、2100、3450、5800）的色譜圖

圖2 PEG對(duì)照品（A：Mp 430～5800；B：Mp 106～11100）的三階校正曲線

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品（Mp 3450）溶液和供試品（A1、B1、C1）溶液，室溫放置，分別于0、4、8、12、24h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果對(duì)照品和供試品的色譜峰形均無(wú)改變，峰高均無(wú)變化，保留時(shí)間的RSD均小于0.53%，表明待測(cè)樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，且色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性也良好。

2.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

與外標(biāo)法不同，GPC法測(cè)定分子量是以主成分峰的保留時(shí)間為計(jì)算基礎(chǔ)，不能用對(duì)照品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，因此本研究設(shè)計(jì)了校正曲線檢查，以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。取Mp為2100、3450和5800的PEG對(duì)照品各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行測(cè)定，用已建立的校正曲線計(jì)算各對(duì)照品的Mw，并與Mp比較，計(jì)算相對(duì)偏差（表1）。3個(gè)分子量水平的PEG平均偏差分別為101.41%，99.05%，100.34%，表明方法準(zhǔn)確度好。

表1 校正曲線的準(zhǔn)確度

2.1 0樣品測(cè)定

取 9 批樣品（A1～A3；B1～B3；C1～C3），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果各批次樣品的分布系數(shù)均低于1.1，各企業(yè)內(nèi)3批樣品間分子量較接近（RSD均低于2%），提示生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。根據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，3家企業(yè)的樣品均符合規(guī)定，但樣品分子量差異明顯，表現(xiàn)為A企業(yè)＞B企業(yè)＞C企業(yè)，見(jiàn)表2。

A企業(yè)樣品均值更接近標(biāo)示值3350，但分析色譜圖發(fā)現(xiàn)B、C企業(yè)樣品色譜峰更對(duì)稱(chēng)平滑，而A企業(yè)樣品色譜峰有小的前沿峰，色譜圖見(jiàn)圖3。根據(jù)體積排阻色譜原理，分子量大的成份應(yīng)更早洗脫出色譜柱，提示A企業(yè)樣品中含有一定比例且分子量集中的高分子組份。本研究對(duì)GPC系統(tǒng)得到的各批樣品累積分布曲線進(jìn)行比較，依據(jù)分子量從高到低，選取10%和90%分位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的分子量，見(jiàn)表2。結(jié)果可見(jiàn)，A企業(yè)3批樣品高分子量區(qū)的10%分位點(diǎn)對(duì)應(yīng)分子量大于B、C企業(yè)樣品，但低分子量區(qū)差別較??；A企業(yè)樣品分子量分布寬度明顯大于B、C企業(yè)樣品，表明B企業(yè)和C企業(yè)樣品的純度更高。以往方法通過(guò)分布系數(shù)（Mw/Mn）來(lái)評(píng)價(jià)樣品的分布寬度，而本研究表明，分布系數(shù)并不能有效評(píng)價(jià)樣品實(shí)際分布情況。因此，建議在分子量分布的測(cè)定方法中，應(yīng)根據(jù)測(cè)得的累積分布曲線增加分布寬度要求以加強(qiáng)對(duì)樣品多分散屬性的控制，例如規(guī)定10%～90%分位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的分子量寬度。

圖3 3家企業(yè)樣品（A1、B1、C1）分子量分布檢測(cè)色譜圖

表2 9批PEG 3350的分子量測(cè)定結(jié)果

續(xù)表

3 討論

3.1 色譜方法的選擇

建立方法時(shí)要對(duì)分析物的分子量進(jìn)行初步判斷并選擇合適的色譜柱［10-11］。本研究對(duì)比了Shodex OHpak SB-803 HQ、Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱，前者適合分子量為200～40000 Da的PEG類(lèi)化合物，后者適合100～20000Da。結(jié)果表明，Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱獲得的PEG峰型對(duì)稱(chēng)、峰寬較小且對(duì)不同分子量PEG的保留區(qū)分適當(dāng)，故選擇Agilent PL aquagel-OH 20色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

流動(dòng)相中加入無(wú)機(jī)鹽可維持溶液的離子濃度，獲得良好色譜峰形。本研究考察了在流動(dòng)相中加入0.01～0.5mol/L硝酸鈉或者氯化鈉時(shí)的色譜峰型、柱效及不同PEG分子量的色譜峰分離度情況。結(jié)果表明，流動(dòng)相中加入硝酸鈉后基線噪音更?。?］；較低濃度（0.01～0.05mol/L）時(shí)PEG色譜峰展寬，且不同分子量的主峰分離度下降，而濃度為0.1mol/L時(shí)較適宜。本研究所采用的ProClinTM是有機(jī)抑菌劑，對(duì)人和動(dòng)物毒性低、對(duì)環(huán)境友好，與傳統(tǒng)分析方法使用的疊氮化鈉相比，可有效避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境的危害。

3.2 校正曲線的選擇

使用GPC 系統(tǒng)測(cè)定化合物分子量時(shí)，首先要確定標(biāo)準(zhǔn)曲線類(lèi)型。本研究比較了一階～五階曲線對(duì)測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的影響，在Mp 2100、3450、5800這3個(gè)分子量對(duì)照品校正點(diǎn)處，三階曲線擬合準(zhǔn)確度最好（均小于2.0%），一階和二階曲線準(zhǔn)確度較低，四階及更高階曲線由于校正點(diǎn)數(shù)少及分子量范圍小而不適合本研究，因此選擇三階曲線進(jìn)行分析。本研究以Mp為430～5800范圍內(nèi)的共5個(gè)對(duì)照品和Mp為106～11100范圍內(nèi)的共8個(gè)對(duì)照品分別建立校正曲線，并進(jìn)行準(zhǔn)確度檢查。結(jié)果表明，圖2A中5個(gè)點(diǎn)殘差均在2.0%以內(nèi)，圖2B中只有Mp 3450處較小，其余各點(diǎn)均大于2.0%，隨著分子量減小有明顯增大的趨勢(shì)。該結(jié)果表明以Mp為430～5800的5個(gè)對(duì)照品建立的曲線范圍是合適的，且建立方法所用對(duì)照品數(shù)量和校正曲線的范圍應(yīng)與特定分子量的待測(cè)物相適合，利用殘差值可對(duì)方法測(cè)定準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估。

3.3 對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂的建議

目前，對(duì)于特定分子量的待測(cè)樣品，如何確定校正曲線的合適范圍以及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的指標(biāo)尚無(wú)相關(guān)論述［9-13］?！吨袊?guó)藥典》（2020版）收載了PEG系列輔料的分子量分布測(cè)定方法，但未對(duì)方法適用性作出具體要求。對(duì)于開(kāi)展這類(lèi)工作較少的實(shí)驗(yàn)室，方法適用性的缺失不利于評(píng)估儀器系統(tǒng)的狀態(tài)和測(cè)試的準(zhǔn)確性?；诒狙芯拷Y(jié)果，建議將校正曲線相關(guān)參數(shù)（如曲線類(lèi)型、回歸系數(shù)、殘差限度）納入PEG系列輔料的分子量分布測(cè)定方法的系統(tǒng)適用性項(xiàng)下，完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、提高可執(zhí)行度。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，建議除規(guī)定Mw數(shù)值和分布系數(shù)以外，必要時(shí)增加分布寬度要求，例如規(guī)定10%～90%分位點(diǎn)處的分布寬度，以加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品多分散屬性的控制。

4 小結(jié)

本研究建立了一種測(cè)定分子量在430～5800范圍內(nèi)PEG的GPC方法。該方法結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，有助于獲得Mw、分布系數(shù)、累積分布寬度等多分散化合物特征信息，可用于PEG樣品的質(zhì)量控制和比對(duì)，在一定程度上為制劑研發(fā)中輔料的篩選以及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了參考。