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        UFLC法測定黃芪桂枝五物湯與桂枝水提物中桂皮酸的含量

        2022-11-10 12:45:20王文正范琢玉湯鑫淼朱鶴云

        崔 悅,王文正,范琢玉,湯鑫淼,馮 波,關(guān) 皎,朱鶴云

        (吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

        黃芪桂枝五物湯出自漢代張仲景所著的《金匱要略》,方中含黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗五味藥材,具有益氣溫經(jīng),補氣通陽,和血通痹等功效?,F(xiàn)代臨床主要是用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、頸椎病、腦血栓以及心絞痛等[1-5]。黃芪桂枝五物湯君臣佐使配伍明確,其中黃芪為君,桂枝為臣,芍藥為佐,生姜、大棗為使。各藥味分工明確,相輔相成,極大地發(fā)揮了各自藥效。在黃芪桂枝五物湯中,桂枝為臣藥,起到了解表和營、通陽散寒的作用。桂枝為樟科植物肉桂Cirmarnomum cassia Presl的干燥嫩枝,其主要化學(xué)成分包括:有機酸類化合物、萜類化合物、黃酮類化合物、糖苷類和苷元化合物等[6]。文獻報道,桂枝具有多種藥理活性,能夠緩和腸胃刺激、強心、抗炎、抗血小板凝集和改善微循環(huán)等。在臨床實踐中桂枝可以用于組成多種中藥經(jīng)典方劑,廣泛應(yīng)用于臨床各科疾病的治療[7-10]。桂皮酸是桂枝中的主要活性成分,研究表明,桂皮酸具有解熱、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化、抗病毒、保護血管、利尿等作用。目前,桂枝中桂皮酸的含量測定方法主要為HPLC法[11-13]。近年來,超快速液相色譜法(ultra-fast liquid chromatography,UFLC)由于具有分離速度快、分析時間短等優(yōu)點,已廣泛地應(yīng)用到了中藥成分的含量測定中[14-15]。本研究建立了一種快速準(zhǔn)確的方法用于對黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸的含量測定,為黃芪桂枝五物湯的質(zhì)量控制和配伍規(guī)律研究提供一定參考。

        1 材料和方法

        1.1 儀器與材料

        超快速液相色譜儀(Prominence UFLC型,日本島津公司);超聲儀(KQ-250DE型,昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(CPA 225D型,德國賽多利斯儀器有限公司);粉碎機(FW80型,天津市泰斯特儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1300型,日本東京理化器械株式會社);渦旋混勻器(Vortex 3型,德國IKA公司)。

        甲醇、乙腈(美國Thermo Fisher),甲酸(天津大茂化學(xué)試劑廠),純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。除甲醇、乙腈、甲酸為色譜級外,其他均為分析純。桂皮酸對照品(>98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司官,批號:18092601)。黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗(吉林大藥房),以上藥材經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院李景華副教授鑒定均為藥材真品。

        1.2 色譜條件

        Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm,2.2 mm,日本島津);色譜柱溫度:35 ℃;檢測波長:290 nm;流速:0.4 mL/min;進樣體積:5 μL;流動相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序如下:0~5 min,10%~25%B;5~10 min,25%~35%B;10~15 min,35%~40%B。桂皮酸對照品、桂枝水提物樣品、黃芪桂枝五物湯樣品及缺少桂枝的陰性樣品色譜圖見圖1。

        1.3 黃芪桂枝五物湯的制備

        取黃芪藥材9 g、桂枝藥材9 g、白芍藥材9 g、生姜藥材18 g、大棗藥材4枚于1 L圓底燒瓶,向其中加入10倍量體積的水加熱回流2次,每次1 h。過濾后合并兩次濾液,并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到50 mL,4 ℃保存待用。

        1.4 桂枝水提物的制備

        取桂枝藥材9 g于1 L圓底燒瓶,其余操作同“1.3”。

        1.5 陰性樣品溶液的制備

        取黃芪藥材9 g、白芍藥材9 g、生姜藥材18 g、大棗藥材4枚于1 L圓底燒瓶,其余操作同“1.3”。

        1.6 溶液的制備

        1.6.1對照品溶液的制備

        取桂皮酸對照品適量于5 mL容量瓶中,以甲醇為溶劑進行溶解并定容至刻度,得1.0 g/L桂皮酸對照品溶液,4 ℃保存待用。

        1.6.2待測溶液的制備

        分別取“1.3”“1.4”“1.5”項下各提取物0.5 mL,于不同50 mL錐形瓶中,向其中加入甲醇溶液25 mL,采用超聲法提取30 min,續(xù)濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,得各待測溶液。

        1.7 分析方法的驗證

        1.7.1線性關(guān)系

        取“1.6.1”項下桂皮酸對照品溶液適量于5 mL量瓶中,以甲醇為溶劑制得桂皮酸對照品溶液,濃度依次為0.5、1、2、4、10、20 mg/L,進樣分析。線性回歸計算時,橫坐標(biāo)X為對照品濃度(mg/L),縱坐標(biāo)Y為峰面積,得回歸方程。

        1.7.2精密度試驗

        取“1.6.1”項下桂皮酸對照品溶液(4 mg/L),按“1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣(n=6)。計算桂皮酸峰面積的RSD。

        1.7.3穩(wěn)定性試驗

        取同一批次黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物,按“1.6.2”項下方法處理,于室溫放置,分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定,計算其峰面積的RSD。

        1.7.4重復(fù)性試驗

        取同一批次的黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物各6份,按“1.6.2”項下制得待測溶液,進樣分析并計算桂皮酸的含量和RSD。

        1.7.5回收率試驗

        精密量取已知含量的黃芪桂枝五物湯樣品(桂皮酸含量為0.132 mg/mL)和桂枝水提物樣品(桂皮酸的含量為0.193 g/L)各9份,每份0.25 mL,分別向各樣品中加入相當(dāng)于樣品中桂皮酸苷含量80%、100%、120%的對照品溶液各3份,按“1.6.2”項下方法制得待測溶液,進樣分析,并計算桂皮酸的回收率和RSD。

        1.8 含量測定

        按“1.6.2”項下方法分別制備6批黃芪桂枝五物湯和黃芪水提物待測溶液,進樣分析并計算桂皮酸含量。

        2 結(jié) 果

        2.1 分析方法驗證

        2.1.1線性關(guān)系

        經(jīng)線性回歸計算桂皮酸的回歸方程為

        Y=8.1×104X-1.6×104(r=0.999 7)

        即桂皮酸在0.5~20 mg/L線性關(guān)系良好。

        2.1.2精密度試驗

        經(jīng)計算桂皮酸峰面積的RSD為0.42%,即儀器具有良好的精密度。

        2.1.3穩(wěn)定性試驗

        經(jīng)計算黃芪桂枝五物湯和黃芪水提物中桂皮酸峰面積的RSD分別為0.19%和1.1%,說明上述樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.1.4重復(fù)性試驗

        經(jīng)計算黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量的平均值分別為0.132 mg/L(RSD=2.1%)、0.183 mg/L(RSD=1.4%),即方法具有良好的重復(fù)性。

        2.1.5桂皮酸的回收率

        黃芪桂枝五物湯樣品中桂皮酸的平均RSD為0.9%,平均回收率為98.1%;桂枝提取液樣品中桂皮酸的平均RSD為0.97%,平均回收率為的98.6%。

        2.2 含量測定

        6批黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量結(jié)果見表1。

        表 1 黃芪桂枝五物湯和桂枝提取液中桂皮酸的含量(%)

        3 討 論

        3.1 流動相的優(yōu)化

        流動相的種類對于待測物的分離和分析具有重要意義。適宜的流動相種類和比例有助于待測物的分析與測定。本研究參考已有文獻,分別考察了甲醇-水、甲醇-0.2%醋酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水共5種流動相體系,結(jié)果表明,乙腈-0.1%磷酸水作為流動相時能夠獲得較好的分離效果,分析時間為15 min,且藥材中無其他色譜峰的干擾。

        3.2 檢測波長的選擇

        實驗中對檢測波長進行了考察,二極管陣列檢測器可進行全波長掃描,并可獲得所測成分的最大吸收波長,有助于待測物的檢測。實驗中發(fā)現(xiàn):桂皮酸的吸收峰位于290 nm,為最大吸收波長。綜合考慮雜質(zhì)色譜峰影響、基線、色譜峰峰形、最大吸收等因素,最終選擇290 nm作為檢測波長。

        3.3 黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量比較

        通過對6批黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸含量進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于桂枝水提物,黃芪桂枝五物湯中桂皮酸的含量減少,即配伍以后合煎液中桂皮酸的含量低于單煎液,也就是說黃芪桂枝五物湯中桂皮酸的提取減弱。課題組前期研究表明,相比于黃芪水提物,黃芪桂枝五物湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量明顯增加,有正向促進作用。綜合本實驗與其他文獻研究結(jié)果可以看出:在某些情況下,配伍可促進有效成分的溶出,也可能抑制有效成分的溶出,具體的機制仍有待進一步研究。

        綜上,本研究建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的UFLC法測定黃芪桂枝五物湯和桂枝水提物中桂皮酸的含量。結(jié)果表明,黃芪桂枝五物湯相比于桂枝水提液中桂皮酸的含量減少,可為黃芪桂枝五物湯的進一步研究與開發(fā)提供參考依據(jù)。

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