吳新華 顧曉荔 胡濱

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（鄭州 450000）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是致死率最高的婦科惡性腫瘤［1-2］。由于缺乏明顯臨床癥狀和診斷生物標(biāo)志物，大多數(shù)卵巢癌患者在確診時(shí)就已處于疾病晚期，導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后不佳［3-4］。因此，鑒定新的生物標(biāo)志物并闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。微小RNA-216a（microRNA-216a，miR-216a）是一種與癌癥相關(guān)的miRNA，已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌［5］、胃癌［6］中下調(diào)，表明miR-216a具有腫瘤抑制作用。然而，有研究證實(shí)，miR-216a在卵巢癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，在卵巢癌中具有致癌作用［7］，與其他癌細(xì)胞中研究不同。因此，有必要對(duì)miR-216a 在卵巢癌中的具體生物學(xué)功能及其潛在的機(jī)制進(jìn)行探究。據(jù)報(bào)道，Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在多種癌癥中發(fā)揮重要作用，該通路的激活可增加腫瘤的轉(zhuǎn)移能力和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［8］。LIU 等［9］研究表明，抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路可抑制EMT 減弱卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。EMT 作為腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，參與腫瘤侵襲、擴(kuò)散等過(guò)程［10］。然而，在卵巢癌中miR-216a 是否可通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和EMT 仍不明晰。本研究通過(guò)表達(dá)miR-216a，探索其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響以及潛在的作用機(jī)制，為卵巢癌的臨床治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人體組織樣本和細(xì)胞收集2019年1月至2021年1月期間來(lái)本院就診的20 例卵巢癌患者卵巢癌組織和癌旁正常組織（距離癌組織至少5 cm）樣本，術(shù)中采集組織后迅速于液氮中冷凍后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780（YS018C）、OVCAR3（YS3615C）、SKOV3（YS3110C）、3AO（YS908C）以及人卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC（YS1695C）均購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器DMEM 培養(yǎng)基、青/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco；TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；TaqManTMmicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqManTMmicroRNA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo；RIPA 裂解緩沖液、BCA 試劑盒購(gòu)自江蘇Beyotime；一抗E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、JAK2、STAT3、Snalil、Twist、GAPDH 均購(gòu)自英國(guó)Abcam；ECL 發(fā)光液購(gòu)自北京BIOSIC；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技。

Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo；LightCycler 480 熒光定量PCR 儀購(gòu)自上海Roche；Gel Doc XR 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；EclipseTi-E 激光共聚焦熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Nikon；CX43 顯微鏡購(gòu)自美國(guó)OLYMPUS。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組卵巢癌細(xì)胞系（A2780、OVCAR3、SKOV3、3AO）以及人卵巢上皮細(xì)胞HOSEpiC 在補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞維持在37 ℃、5%CO2的濕潤(rùn)氣氛中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度至70%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)期且生長(zhǎng)良好的第三代后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SKOV3 細(xì)胞，依次分為：正常對(duì)照（Control）組，miR-NC 對(duì)照（miR-NC）組、miR-216a 過(guò)表達(dá)（miR-216a）組、miR-216a 過(guò)表達(dá)和JAK2 過(guò)表達(dá)空載對(duì)照（miR-216a+EV）組、miR-216a 和JAK2 過(guò)表達(dá)（miR-216a+JAK2）組。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒方法轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒和寡核苷酸。miR-216a 模擬物（miR-216a）及其陰性對(duì)照miR-NC、JAK2 過(guò)表達(dá)（JAK2）及其空載對(duì)照（EV）均購(gòu)自廣州Genecopoeia 設(shè)計(jì)合成。

1.2.2 QRT-PCR 檢測(cè)組織和細(xì)胞中miR-216a 表達(dá)水平根據(jù)TRIzol 試劑制造商說(shuō)明書(shū)提取組織和細(xì)胞總RNA。遵循逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)方法制備cDNA，使用microRNA檢測(cè)試劑盒對(duì)miR-216a進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和定量。U6 作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔct計(jì)算miR-216a 的相對(duì)表達(dá)水平。

miR-216a 引物序列：5'-ACACACUUACCCGUA-GAGAUUCUA-3'，反向引物使用試劑盒中通用的引物。U6 引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SKOV3 細(xì)胞的遷移和侵襲能力在實(shí)驗(yàn)前，先使用Matrigel 包被Transwell 小室底部膜的上室面，干燥備用。將按照上述方法培養(yǎng)的各組SKOV3 細(xì)胞使用無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸，形成5 × 105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸浮液，吸取200 mL 懸浮液于含Matrigel 的Transwell 小室上室中，下室中添加600 mL 正常培養(yǎng)基。按常規(guī)方法培養(yǎng)48 h 后，使用甲醇固定30 min 后，添加0.1%結(jié)晶紫染色20 min，同時(shí)使用棉簽輕輕拭去上層未遷移細(xì)胞，使用PBS 輕洗3 遍后在倒置顯微鏡中拍照記錄，隨機(jī)選擇五個(gè)視野，計(jì)數(shù)。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)需使用無(wú)Matrigel 包被Transwell 小室，其余步驟同上。

1.2.4 免疫印跡（Western blot）檢測(cè)各組SKOV3細(xì)胞中EMT 和JAK2/STAT3 通路相關(guān)的蛋白水平變化使用RIPA 裂解緩沖液裂解按上述方法培養(yǎng)的各組SKOV3 細(xì)胞以獲得總蛋白提取物，并使用BCA 試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDSPAGE 電泳分離總蛋白提取物（600 mg/泳道）后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，添加5%牛血清白蛋白封閉2 h，將蛋白質(zhì)與一抗（稀釋濃度1∶1 000）：E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、JAK2、STAT3、Slug、Twist 和GAPDH 在4 ℃下過(guò)夜孵育，隔天使用HRP 標(biāo)記的二抗孵育2 h。使用增強(qiáng)型的ECL 發(fā)光液將蛋白可視化。并使用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)并拍照記錄，通過(guò)Image J 軟件分析各組蛋白灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)各組SKOV3 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 表達(dá)水平將按照上述方法培養(yǎng)的各組SKOV3 細(xì)胞接種在細(xì)胞爬片上，待爬滿細(xì)胞后，使用PBS 浸洗3 次。在室溫下使用4%多聚甲醛固定后使用0.1% triton X-100 透化，添加山羊血清室溫封閉30 min，吸去封閉液后將細(xì)胞與一抗（稀釋比例1∶500）：E-cadherin、Ncadherin 和Vinmentin 在4 ℃下過(guò)夜孵育。后將爬片與FITC 熒光二抗在室溫下孵育1 h，細(xì)胞核在室溫下使用DAPI 染色10 min。使用激光掃描顯微鏡捕獲共聚焦熒光圖像。

1.2.6 雙熒光素酶檢測(cè)miR-216a 與JAK2 靶向關(guān)系經(jīng)TargetScan 網(wǎng)站預(yù)測(cè)，miR-216a 與JAK2 3'-UTR 存在相互作用位點(diǎn)，將JAK2 3'-UTR 野生型（WT）或突變型（MUT）連接到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告載體上，構(gòu)成JAK2 WT 或JAK2 MUT。將JAK2 WT 或JAK2 MUT 與miR-NC 或miR-216a 共同轉(zhuǎn)染至SKOV3 細(xì)胞，共同孵育48 h 后，經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有研究均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)。使用SPSS 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用t檢驗(yàn)分析兩組差異，使用單因素方差分析多組間差異。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-216a 在卵巢癌組織和SKOV3 細(xì)胞中的表達(dá)情況圖1A 結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，miR-216a 表達(dá)水平在卵巢癌組織中的表達(dá)降低（t=80.63，P＜0.05）。圖1B 結(jié)果顯示，與HOSEpiC細(xì)胞相比，卵巢癌細(xì)胞系中miR-216a 表達(dá)均明顯降低（F= 142.089，P＜0.05）；且在SKOV3 細(xì)胞中表達(dá)最低，故后續(xù)選擇SKOV3 細(xì)胞作為研究對(duì)象。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)miR-216a 在卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.1 qRT-PCR detection of miR-216a expression in OC tissues and cells

2.2 miR-216a 過(guò)表達(dá)促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞遷移和侵襲5 組SKOV3 細(xì)胞中miR-216a 表達(dá)、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 93.172、199.616、185.908，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細(xì)胞中miR-216a 表達(dá)升高，遷移和侵襲數(shù)量減少（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細(xì)胞中表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而遷移和侵襲數(shù)量增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-216a 過(guò)表達(dá)對(duì)SKOV3 細(xì)胞遷移和侵襲的影響Fig.2 Effects of miR-216a overexpression on migration and invasion of SKOV3 cells

2.3 miR-216a 過(guò)表達(dá)抑制SKOV3 細(xì)胞的EMT5 組SKOV3 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.612、66.773、102.396，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白水平增高，N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平降低（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組相比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白水平降低，N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平增高（P＜0.05）。免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)了以上各組SKOV3 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白水平變化結(jié)果（圖3）。

圖3 miR-216a 過(guò)表達(dá)對(duì)SKOV3 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 水平的影響Fig.3 Effects of miR-216a overexpression on the levels of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin in SKOV3 cells

2.4 miR-216a 過(guò)表達(dá)抑制SKOV3 細(xì)胞中JAK2/STAT3通路激活5組SKOV3細(xì)胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=113.889、63.837、89.688、74.773，均P＜0.05）。與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細(xì)胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平均降低（P＜0.05）；與miR-216a+EV 組比，miR-216a+JAK2 組SKOV3 細(xì)胞中JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平均增高（P＜0.05，圖4）。

圖4 miR-216a 過(guò)表達(dá)對(duì)JAK2、STAT3、Slug 和Twist 蛋白水平的影響Fig.4 Effects of miR-216a overexpression on the protein levels of JAK2，STAT3，Slug and Twist

2.5 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3 細(xì)胞中miR-216a 與JAK2 靶向關(guān)系生物學(xué)預(yù)測(cè)，JAK2 3'-UTR 存在與miR-216a 相互作用的靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖5A），經(jīng)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與miR-NC 組相比，miR-216a 組SKOV3 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染JAK2 WT 可顯著降低熒光素酶活性（t= 16.333，P＜0.05），而轉(zhuǎn)染JAK2 MUT 則對(duì)熒光素酶活性的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.333，P=0.332，圖5B）。

圖5 miR-216a 與JAK2 靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.5 Validation of the targeting relationship between miR-216a and JAK2

3 討論

miRNAs 是一組長(zhǎng)度為20-22 個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)，并在調(diào)節(jié)組織特異性蛋白表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用［11］。越來(lái)越多的研究證實(shí)，異常miRNA 表達(dá)通過(guò)充當(dāng)致癌基因或腫瘤抑制因子而與人類(lèi)癌癥的發(fā)展和進(jìn)展直接相關(guān)。此外，miRNAs 已被公認(rèn)為是最有潛力的生物標(biāo)志物和包括卵巢癌在內(nèi)的人類(lèi)癌癥的治療靶點(diǎn)［12-13］。miR-216a 已被發(fā)現(xiàn)是人類(lèi)惡性腫瘤的積極參與者［14-15］。本研究結(jié)果顯示，miR-216a 在卵巢癌組織和細(xì)胞中顯著低表達(dá)，且在SKOV3 細(xì)胞中表達(dá)最低，表明miR-216a 在卵巢癌中具有抑癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a 的表達(dá)在胃癌組織和細(xì)胞系中受到抑制，低表達(dá)的miR-216a 與胃癌患者的惡性臨床特征和不良預(yù)后相關(guān)，且miR-216a 可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3 通路的激活來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT 過(guò)程［16］。然而，在肝細(xì)胞癌中，A1BG-AS1 通過(guò)直接吸附競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性miR-216a 表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，而過(guò)表達(dá)miR-216a 可逆轉(zhuǎn)A1BG-AS1 對(duì)癌細(xì)胞的影響，說(shuō)明miR-216a 在肝細(xì)胞癌中具有致癌作用［17］。本結(jié)果與之相一致。為了進(jìn)一步明確miR-216a在卵巢癌細(xì)胞中的具體生物學(xué)功能，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-216a 抑制遷移、侵襲，且表現(xiàn)出高E-cadherin 蛋白水平，低N-cadherin 和Vinmentin蛋白水平。有研究表明，EMT 是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征從而獲得轉(zhuǎn)移能力的過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及治療抵抗有關(guān)［18］。以往研究發(fā)現(xiàn)，EMT過(guò)程發(fā)生的標(biāo)志是高N-cadherin 和Vinmentin 水平，低E-cadherin 水平［19-20］。結(jié)合本研究結(jié)果表明miR-216a 過(guò)表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT 過(guò)程，暗示miR-216a 很有可能作為治療卵巢癌的潛在生物標(biāo)志物。然而，本研究中發(fā)現(xiàn)的miR-216a 在卵巢癌中的功能與現(xiàn)有研究結(jié)果并不相同［7］，推測(cè)其可能有多方面原因，其一：選用的卵巢癌患者組織具有差異，循環(huán)中的miRNA 水平不僅與腫瘤類(lèi)型有關(guān)，還可能受到慢性疾病、炎癥等的影響；其二，單個(gè)miRNA 可以靶向調(diào)控上百個(gè)mRNA，根據(jù)不同靶基因的能力其表達(dá)趨勢(shì)可能不同；其三，miRNA 即使靶向相同的基因，在不同的轉(zhuǎn)移階段也會(huì)具有不同的結(jié)果。綜上，有必要對(duì)miR-216a 在卵巢癌中的作用機(jī)制進(jìn)行深入探究。

本研究經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，JAK2 可能是miR-216a 的靶標(biāo)基因。經(jīng)雙熒光素酶結(jié)果證實(shí)，miR-216a 與JAK2 存在相互作用。另外，上調(diào)miR-216a 可顯著降低JAK2 蛋白水平，表明miR-216a 對(duì)JAK2 具有負(fù)向調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道，JAK2 是蛋白酪氨酸激酶JAK 家族的成員之一，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著多種功能［21］。先前的研究表明，JAK2 在各種類(lèi)型的癌癥中通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3 發(fā)揮致癌基因的作用［22］。有研究表明，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，JAK2/STAT3 信號(hào)被激活后，癌細(xì)胞的增殖能力提高［23］；在食管鱗狀癌細(xì)胞中阻斷JAK2/STAT3 信號(hào)，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［24］。此外，已有研究證實(shí)，JAK2/STAT3 通路在卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和EMT中起著關(guān)鍵作用［25］。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-216a表達(dá)可抑制JAK2、STAT3 蛋白水平及其下游靶標(biāo)Slug 和Twist 蛋白表達(dá)。研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子Slug和Twist 是人類(lèi)卵巢癌中EMT 過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［26］。因此，筆者假設(shè)miR-216a 通過(guò)抑制JAK2 表達(dá)抑制JAK2/STAT3 通路激活進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的EMT 過(guò)程和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究表明，JAK2 過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-216a 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移作用，具有增強(qiáng)遷移、侵襲和EMT 進(jìn)展的作用，這些數(shù)據(jù)有利地支持了上述假設(shè)。

綜上，本研究證明了miR-216a 的表達(dá)在卵巢癌組織中下調(diào)，miR-216a 可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3 通路抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT。這些發(fā)現(xiàn)為卵巢癌的靶向治療提供了新的觀點(diǎn)。但本研究未在其他卵巢癌細(xì)胞系和動(dòng)物模型中進(jìn)行同步驗(yàn)證，后續(xù)仍需更全面的探究以完善miR-216a 在卵巢癌中的作用機(jī)制，以期為卵巢癌的治療提供新的思路。