劉春汕 杜坤朋 王栢耀 劉威 田允鴻

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科（廣州 510095）

2020年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已成為全球發(fā)病率最高的癌癥［1］。根據(jù)表達(dá)受體分類，乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B 型、表皮生長因子受體-2（epidermal growth factor receptor 2，Her-2）過表達(dá)型以及TNBC 4 種類型［2-3］。在乳腺癌分型中，TNBC 是最為兇險(xiǎn)的一種類型，其發(fā)病率大約占乳腺癌的15%～20%，生長迅速，惡性程度高。且因?yàn)門NBC 不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體以及Her-2，因此缺乏經(jīng)典的治療靶點(diǎn)，目前尚無較好的針對性治療方案［4-5］，所以探索新的治療靶點(diǎn)對TNBC 是至關(guān)重要的。

lncRNA 是存在于真核生物中的一類由大于200 個(gè)核苷酸組成，以不編碼蛋白為特征的RNA 分子，其具有腫瘤類型特異性［6-7］。研究表明lncRNA參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種生物學(xué)過程，與人類疾病發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)［8-9］。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明多種lncRNA 可能成為TNBC 發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)與預(yù)后生物標(biāo)記物［10-12］。SPINT1-AS1 又名絲氨酸肽酶抑制劑Kunitz 1 型反義RNA 1，是位于15q15.1 染色體上，長度為632nt的lncRNA。目前對其研究較少，僅在宮頸癌、結(jié)直腸癌中報(bào)道SPINT1-AS1 高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)［13-14］。但在食管鱗癌、腎母細(xì)胞癌中SPINT1-AS1 高表達(dá)與良好預(yù)后有關(guān)［15-16］。并且僅有1 篇文章報(bào)道SPINT1-AS1 在乳腺癌中促進(jìn)其增殖轉(zhuǎn)移［17］，該文章并沒有對乳腺癌特定分子亞型進(jìn)行闡述。TNBC 作為預(yù)后最差的乳腺癌亞型仍缺乏有效的治療靶點(diǎn)，因此本研究擬探索lncRNA 是否可以作為TNBC 的治療靶點(diǎn)。鑒于本課題組在前期的TNBC 細(xì)胞測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 在經(jīng)典的抑癌分子miR-200c 過表達(dá)組的水平顯著高于空載對照組，由此筆者猜測SPINT1-AS1 可能也具有抑癌作用。因此，本研究擬在TNBC 中探索SPINT1-AS1 的功能作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)MCF-10A、MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-468 細(xì)胞均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，MCF-10A 使用MCF-10A 完全培養(yǎng)基（賽庫生物公司）培養(yǎng)，其余細(xì)胞株使用含有10%FBS 的1640（Gibco 公司）培養(yǎng)，均在37 ℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)生長。

1.2 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)使用Trizol 裂解，氯仿提取，氯丙醇沉淀，含DEPC 水的75%酒精洗滌總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。最后使用2-ΔΔCt法計(jì)算SPINT1-AS1 的表達(dá)量。

1.3 熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)將MDA-MB-231與BT549細(xì)胞接種至放有細(xì)胞爬片的24 孔板中，待細(xì)胞長至80%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照熒光原位雜交試劑盒（吉瑪公司）說明書進(jìn)行，PBS 清洗，4%多聚甲醛固定后PBS 清洗。0.1%Triton X-100 打孔，PBS 清洗。SPINT1-AS1 探針加入雜交緩沖液中，混勻，73 ℃變性5 min，變性結(jié)束37 ℃孵育細(xì)胞過夜。12 h 后PBS清洗，使用DAPI染細(xì)胞核，室溫15 min后清洗。最后用抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡拍攝。

1.4 包裝shSPINT1-AS1 病毒shSPINT1-AS1#1與shSPINT1-AS1#2 質(zhì)粒由擎科生物公司合成。病毒包裝質(zhì)粒以及包膜蛋白質(zhì)粒由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈。將293T 細(xì)胞加入預(yù)先用多聚賴氨酸包被的10 cm 皿中。待細(xì)胞長至80%使用PEI 試劑轉(zhuǎn)染，按照包裝質(zhì)粒：包膜蛋白質(zhì)粒：目的基因=4∶3∶1 的比例把3 者混合。取500 μL opti-MEM 稀釋混合質(zhì)粒。將500 μL opti-MEM 稀釋60 μg 的PEI。隨后把PEI 稀釋液加入混合質(zhì)粒稀釋液中，混勻靜置15 min。隨后將混合液緩緩加入293T 細(xì)胞。18 h 使用完全培養(yǎng)基取代含混合物的培養(yǎng)基，48 h 收集病毒液。收集的病毒液過濾之后可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過表達(dá)SPINT1-AS1病毒由上海和元公司合成，shSPINT1-AS1#1 與shSPINT1-AS1#2 病毒自行包裝。MDA-MB-231 細(xì)胞鋪至24 孔板中，待細(xì)胞長至50%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。分別使用500 μL opti-MEM 稀釋10 μL 對照組以及實(shí)驗(yàn)組病毒液，將含1 μL/mL polybrene 的opti-MEM分別添加500 μL 至已混有病毒的對照與實(shí)驗(yàn)管中，混勻靜置20 min。靜置結(jié)束將混合液置換原來的培養(yǎng)基。24 h 時(shí)使用完全培養(yǎng)基替換混合液，隨后使用嘌呤與G418 篩選得到穩(wěn)定過表達(dá)與干擾SPINT1-AS1 的細(xì)胞株。

1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)將穩(wěn)轉(zhuǎn)株消化成單細(xì)胞懸液，接種于6 孔板中。細(xì)胞接種后使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2 周左右終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基后PBS 清洗，甲醇固定15 min后PBS清洗，結(jié)晶紫染色30 min，棄結(jié)晶紫，流水沖洗染料。最后用照相機(jī)拍攝圖片。使用image J計(jì)數(shù)，GraphPad prim7.0繪制計(jì)量圖。

1.7 CCK-8 檢測增殖活性按日本同仁公司的CCK-8 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，消化細(xì)胞接種于96孔板。分別在6、24、48、72、96 h時(shí)加入CCK-8 溶液，孵育1.5 h 后在酶標(biāo)儀上450 nm 處檢測OD值。最后用GraphPad Prism 7.0 繪制折線圖。

1.8 Annexin V-APC/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)測凋亡按照聯(lián)科生物凋亡試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行染色、孵育、過濾細(xì)胞團(tuán)塊處理，隨后使用流式細(xì)胞儀檢測。最后使用Flow jo 軟件分析流式凋亡數(shù)據(jù)，Graph-Pad prim7.0 繪制凋亡計(jì)量圖。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 7.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析；配對樣本比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPINT1-AS1 在正常乳腺上皮細(xì)胞及3 種TNBC 細(xì)胞中的表達(dá)為了研究SPINT1-AS1 在乳腺癌中的作用，本實(shí)驗(yàn)首先比較其在正常乳腺上皮細(xì)胞以及TNBC 細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 相比，在TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231、BT549 和MDA-MB-468 的SPINT1-AS1 的表達(dá)量均明顯降低（MDA-MB-468：t= 134.90，MDA-MB-231：t= 2 171.00，BT549：t=18 938.00，P＜0.000 1，圖1）。結(jié)果提示，SPINT1-AS1 可能在抑制TNBC 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

圖1 qRT-PCR 檢測SPINT1-AS1 在細(xì)胞株間的表達(dá)Fig.1 qRT-PCR detects the expression of SPINT1-AS1 in various cell lines

2.2 SPINT1-AS1 在TNBC 細(xì)胞株的定位既往研究顯示，lncRNA 的功能與其表達(dá)位置存在相關(guān)性。為了研究lncRNA 的可能機(jī)制，本課題首先檢測了SPINT1-AS1 的細(xì)胞定位。見圖2，使用共聚焦顯微鏡探索SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 以及BT549 細(xì)胞中的定位，發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。說明SPINT1-AS1 作為一個(gè)lncRNA，主要是以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式作用于細(xì)胞，具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖2 SPINT1-AS1 在MDA-MB-231 與BT549 細(xì)胞株的定位Fig.2 The localization of SPINT1-AS1 in MDA-MB-231 and BT549 cell lines

2.3 SPINT1-AS1 對TNBC 細(xì)胞增殖活性的影響為了研究SPINT1-AS1 對乳腺癌細(xì)胞株的影響，本實(shí)驗(yàn)首先檢測SPINT1-AS1 不同表達(dá)水平細(xì)胞株之間的增殖能力差異。在MDA-MB-231 與BT549 細(xì)胞中過表達(dá)SPINT1-AS1，能顯著降低細(xì)胞克隆形成能力（MDA-MB-231：t= 64.00，BT549：t= 10.74，P＜0.01，圖3A）。在MDA-MB-231 細(xì)胞敲減SPINT1-AS1 后，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的克隆形成能力明顯增強(qiáng)（shSPINT1-AS1#1：t= 11.43，shSPINT1-AS1#2：t= 10.01，P＜0.01，圖3B）。進(jìn)一步使用CCK-8 檢測SPINT1-AS1 對TNBC 增殖活性的影響。在MDA-MB-231 與BT549 細(xì)胞過表達(dá)SPINT1-AS1，能顯著降低細(xì)胞增殖能力（MDA-MB-231：96 h，t= 3.63，BT549：96 h，t= 4.30，P＜0.05，圖3C）。在MDA-MB-231 細(xì)胞干擾SPINT1-AS1 后，與對照組相比，增殖能力明顯增強(qiáng)（shSPINT1-AS1#1：t= 3.28，shSPINT1-AS1#2：t= 4.29，P＜0.05，圖3D）。總之，上述結(jié)果提示SPINT1-AS1 抑制TNBC細(xì)胞增殖。

圖3 過表達(dá)與敲低SPINT1-AS1 對TNBC 細(xì)胞株增殖的影響Fig.3 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the proliferation of TNBC cell lines

2.4 SPINT1-AS1 對TNBC 細(xì)胞凋亡的影響使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，當(dāng)在TNBC 細(xì)胞系中過表達(dá)SPINT1-AS1 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）高于對照組，在BT549細(xì)胞中表現(xiàn)尤為明顯（MDA-MB-231：t= 5.24，BT549：t= 10.19，P＜0.05，圖4A）。然而，當(dāng)敲低SPINT1-AS1 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的總凋亡率低于對照組（shSPINT1-AS1#1：t= 6.28，shSPINT1-AS1#2：t=9.70，P＜0.05，圖4B）。上述結(jié)果提示SPINT1-AS1能促進(jìn)TNBC 凋亡。

圖4 過表達(dá)與敲低SPINT1-AS1 對TNBC 細(xì)胞株凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression and knock-down of SPINT1-AS1 on the apoptosis of TNBC cell lines

3 討論

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥、也是導(dǎo)致死亡的重要原因之一［18-19］。與非TNBC 相比，TNBC具有高度異質(zhì)性和更強(qiáng)侵襲性，因?yàn)槠洳槐磉_(dá)雌激素受體、孕激素受體、Her-2 等標(biāo)志物，所以目前缺乏靶向治療TNBC 的方法［20］。因此，探究針對TNBC 的新治療靶點(diǎn)尤為重要。既往研究顯示，lncRNA 可以參與調(diào)控TNBC 細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等病理生理過程［21］。因此lncRNA 成為治療TNBC的潛在靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究了lncRNA SPINT1-AS1在TNBC 中的作用，結(jié)果顯示SPINT1-AS1 能抑制TNBC 細(xì)胞增殖以及促進(jìn)其凋亡。

SPINT1-AS1 是一種lncRNA。目前研究發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 在不同癌癥發(fā)揮不同的功能，研究證明［13］SPINT1-AS1 抑制miR-214 進(jìn)而激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號從而驅(qū)動(dòng)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，驗(yàn)證SPINT1-AS1 水平升高與宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。LI 等［14］在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1在癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且發(fā)現(xiàn)高SPNT1-AS1 表達(dá)患者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及無復(fù)發(fā)生存期顯著縮短。然而，在食管鱗癌中SPINT1-AS1 的表達(dá)與癌旁組織相比明顯下調(diào)，并且通過生存曲線分析發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 表達(dá)高的患者總體生存期更長［15］。同樣在一項(xiàng)透明細(xì)胞腎母細(xì)胞癌的研究中作者從數(shù)據(jù)庫篩選出9 個(gè)差異表達(dá)lncRNA，SPINT1-AS1 就是其中之一，通過LASSO運(yùn)算、COX 回歸與生存分析得出SPINT1-AS1 表達(dá)高的患者預(yù)后更好的結(jié)論［16］。因此，在食管鱗癌、腎母細(xì)胞癌中高表達(dá)的SPINT1-AS1 與預(yù)后良好有關(guān)。不僅如此，高水平的SPINT1-AS1 可能使胃癌細(xì)胞NCL-N87 與乳腺癌細(xì)胞MCF-7 對拉帕替尼治療更敏感［22］。上述截然不同的研究結(jié)果證明SPINT1-AS1 所發(fā)揮功能是具有癌癥特異性的。在乳腺癌中，雖然ZHOU 等［17］已發(fā)表的研究中表明SPINT1-AS1 具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移的作用。但本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)在乳腺正常細(xì)胞中SPINT1-AS1 的表達(dá)水平高于TNBC 細(xì)胞；進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染病毒建立過表達(dá)與敲低SPINT1-AS1 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，當(dāng)SPINT1-AS1 水平增加時(shí)，TNBC 細(xì)胞增殖能力顯著下降，凋亡顯著增加。當(dāng)敲低SPINT1-AS1 時(shí)作用相反?？傊?，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPINT1-AS1 可以顯著抑制TNBC 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。雖然本研究的結(jié)論與周等人的部分研究結(jié)論相反，但這可能與兩個(gè)研究采用不同的SPINT1-AS1 轉(zhuǎn)錄本有關(guān)。本研究是針對SPINT1-AS1 的第2 個(gè)轉(zhuǎn)錄本NR_146467.1 進(jìn)行研究，而周的研究并未明確指出使用具體的轉(zhuǎn)錄本，這證明SPINT1-AS1 不僅具有腫瘤特異性，而且還可能具有轉(zhuǎn)錄本特異性。作為調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的lncRNA，SPINT1-AS1 可能通過不同的下游靶點(diǎn)來發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。因此，SPINT1-AS1 在TNBC 的發(fā)生發(fā)展中的作用仍需要全方位、多維度、多組學(xué)的探索。已有許多研究報(bào)道［12］lncRNA在TNBC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，例如lncRNA MIR503HG 抑制TNBC 細(xì)胞增殖以及促進(jìn)其凋亡，作者從全方位、多維度，多組學(xué)驗(yàn)證了MIR503HG通過miR-224-5p/HOXA9 軸抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)TNBC 細(xì)胞凋亡。與本研究相同的是作者同樣使用CCK-8、克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖與凋亡，但作者不局限于此，不僅驗(yàn)證了MIR503HG在體內(nèi)同樣發(fā)揮抑癌功能，而且進(jìn)一步通過生信分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等探索了lncRNA的下游機(jī)制，這是本實(shí)驗(yàn)所缺少的，有待本課題組進(jìn)一步完善?？傊?，本研究結(jié)果證明了SPINT1-AS1 能夠抑制TNBC 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。并且本研究確認(rèn)了SPINT1-AS1 主要表達(dá)于TNBC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，極大可能是通過轉(zhuǎn)錄后途徑參與細(xì)胞發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SPINT1-AS1 抑制TNBC 細(xì)胞增殖以及促進(jìn)其凋亡。當(dāng)然，本研究還存在一些不足。首先本研究缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證SPINT1-AS1 對腫瘤生長、凋亡的作用，其次我們對SPINT1-AS1 在TNBC 細(xì)胞的抑癌作用的具體作用機(jī)制仍未闡明，我們初步的機(jī)制研究結(jié)果提示，SPINT1-AS1 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，極大可能是通過轉(zhuǎn)錄后途徑參與細(xì)胞發(fā)生發(fā)展。盡管仍需要通過測序或生信分析等方法進(jìn)一步完善對SPINT1-AS1下游機(jī)制的探索，但是這樣的結(jié)果已經(jīng)給出了重要的提示，SPINT1-AS1 可能成為治療TNBC 的一個(gè)新靶點(diǎn)，這為臨床治療TNBC 提供新方向。因此在今后的研究中，將繼續(xù)深入探索SPINT1-AS1 在TNBC 的作用機(jī)制。