陳緒才，王 益，紀(jì)雪晴，倪芳芳

(句容市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 句容 212400)

0 引言

帕金森病(PD)是65歲以上成年人中第二常見的神經(jīng)退行性疾病。帕金森病的特征癥狀，如靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)不穩(wěn)和步態(tài)失衡，被認(rèn)為是黑質(zhì)致密部(SNpc)大部分多巴胺(DA)神經(jīng)元進(jìn)行性退化的結(jié)果，導(dǎo)致紋狀體DA信號(hào)的丟失[1]。帕金森病的病理特征是α-突觸核蛋白在路易體包涵體中的顯著積聚[2]。此外，帕金森病的特點(diǎn)是T細(xì)胞的滲透和小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的堆積，以及與膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能的改變有關(guān)[3]。

雖然PD和其他神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的免疫反應(yīng)已被研究多年，但鮮見廣泛研究，尤其是從分子角度的研究。此外，神經(jīng)退行性病變的免疫反應(yīng)，包括PD，通常只被認(rèn)為是次要的和不重要的。然而，有證據(jù)表明，炎癥可能具有比最初認(rèn)為的更大的功能。有證據(jù)表明，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的存在對(duì)DA神經(jīng)元有益，但大多數(shù)研究結(jié)果都得出了神經(jīng)炎癥實(shí)際上對(duì)SNpc神經(jīng)元有害的結(jié)論。研究表明，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生和釋放大量有害化合物，如活性氧、活性氮、促炎前列腺素和細(xì)胞因子[4]。

microRNA(miRNA)作為一種非編碼RNA，通過(guò)翻譯抑制、直接或間接調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后降解來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，miRNA被認(rèn)為是與某些疾病進(jìn)展相關(guān)的潛在治療靶點(diǎn)，包括PD[5]。體外和體內(nèi)證據(jù)都表明，miRNA通路是中腦DA能神經(jīng)元分化所特有的。越來(lái)越多的證據(jù)表明，包括miR-133b，miR-7/miR-153，miR-205，miR-132和miR-494在內(nèi)的多種miRNA參與了PD疾病進(jìn)展的調(diào)節(jié)[6]。

6-羥多巴胺(6-OHDA)是一種能導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元死亡的神經(jīng)毒素，常用來(lái)建立體內(nèi)和體外的帕金森病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7-8]。在本研究中，采用6-OHDA誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)建立PD體外模型，探索miRNA-335是否通過(guò)介導(dǎo)其靶基因組蛋白脫乙酰酶3(HDAC3)的水平影響PD的炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細(xì)胞系購(gòu)自上海賓穗生物科技有限公司，6-OHDA購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)Elisa試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；miRNA-335引物[9]的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；HDAC3和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)一抗購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2 方法

將PC12在含有10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 F-12K 培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。然后，將細(xì)胞分成4組，分別為空白組、模型組(100 μmol/L 6-OHDA)、pre-miRNA-335組(100 μmol/L 6-OHDA+30 nmol/L miRNA-335前體寡核苷酸)和anti-miRNA-335組(100 μmol/L 6-OHDA+30 nmol/L miRNA-335抑制劑)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞活力及炎癥因子的測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書，采用CCK-8法測(cè)定各組的細(xì)胞活力，并按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定各組上清液中IL-1β和TNF-α的水平。

1.4 miRNA-335及HDAC3和NF-κB表達(dá)的測(cè)定

采用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定各組miRNA-335的表達(dá)水平，采用Western blot測(cè)定各組HDAC3和NF-κB的蛋白表達(dá)水平[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(s)表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析和Tukey’s post-hoc檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6-OHDA對(duì)miRNA-335表達(dá)的影響

與空白組相比，6-OHDA處理后，miRNA-335表達(dá)水平顯著降低；且轉(zhuǎn)染miRNA-335前體寡核苷酸組(不用6-OHDA處理)與空白組相比，miRNA-335表達(dá)水平顯著升高，而轉(zhuǎn)染miRNA-335抑制劑組(不用6-OHDA處理)與空白組相比，miRNA-335表達(dá)水平顯著降低，這表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，如圖1所示。

圖1 6-OHDA對(duì)miRNA-335表達(dá)的影響注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±s表示，n=5；與空白組比較，“##”表示P<0.01，“###”表示P<0.001。

2.2 miRNA-335對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞活力及炎癥因子的影響

與空白組相比，模型組細(xì)胞活力顯著下降、IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著升高，而pre-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與模型組相比，細(xì)胞活力顯著升高，而IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著降低，且anti-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與空白組和模型組相比，細(xì)胞活力均顯著下降、IL-1β和TNF-α表達(dá)均顯著升高，如圖2所示。

圖2 miRNA-335對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞活力、IL-1β和TNF-α水平的影響注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±s表示，n=5；與空白組比較，“##”表示P<0.01，“###”表示P<0.001；與模型組比較，“*”表示P <0.05，“**”表示P < 0.01，“***”表示P < 0.001。

2.3 miRNA-335對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)顯著上升，而pre-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與模型組相比，HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低，且anti-miRNA-335組(采用6-OHDA處理)與空白組和模型組相比，HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)均顯著升高，如圖3所示。

圖3 miRNA-335對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)后PC12細(xì)胞HDAC3和NF-κB蛋白表達(dá)的影響注：數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±s表示，n=4；與空白組比較，“##”表示P<0.01，“###”表示P<0.001；與模型組比較，“*”表示P <0.05，“**”表示P < 0.01。

3 討論

miRNA是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)元可塑性、發(fā)育和疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]，作為小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，miRNA在包括PD在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。中腦DA能神經(jīng)元中，miR-133b抑制垂體同源框3轉(zhuǎn)錄因子(Pitx3)的表達(dá)，Pitx3缺乏會(huì)導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體DA的選擇性損失[12]。α-突觸核蛋白在PD發(fā)病機(jī)制中起重要作用，雖然點(diǎn)突變體與PD相關(guān)，但α-突觸核蛋白水平升高也會(huì)導(dǎo)致PD發(fā)展，miR-7調(diào)節(jié)內(nèi)源性α-突觸核蛋白水平，其對(duì)突觸核蛋白表達(dá)的抑制保護(hù)免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[13]。

有研究表明海馬組織中的HDAC3抑制通過(guò)控制小膠質(zhì)細(xì)胞激活、增強(qiáng)樹突棘密度和降低 APP/PS1小鼠的Aβ負(fù)荷有效緩解空間記憶缺陷[14]。在較早的一項(xiàng)研究中對(duì)miRNA表達(dá)譜的調(diào)查顯示，miRNA-335在阿爾茲海默癥(AD)患者的皮質(zhì)灰質(zhì)和白質(zhì)中下調(diào)[15]，且miRNA-335的上調(diào)可減少細(xì)胞凋亡，而miRNA-335的敲低可放大炎癥介質(zhì)(包括IL-1β和TNF-α)的水平[16]。據(jù)報(bào)道，HDAC3通過(guò)調(diào)控NF-κB p65脫乙?；龠M(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[17]。而最近的證據(jù)表明，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠?qū)Npc的DA神經(jīng)元造成自身?yè)p害，主要通過(guò)促炎細(xì)胞因子如IL-1β的上調(diào)和釋放，最終導(dǎo)致NF-κB的激活[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，6-OHDA處理后，PC12細(xì)胞活力、miRNA-335水平顯著下降，而炎癥因子、HDAC3和NF-κB蛋白水平顯著升高，而當(dāng)miRNA-335過(guò)表達(dá)時(shí)，可以顯著改善上述異常表達(dá)的指標(biāo)，而敲低miRNA-335表達(dá)時(shí)，可以加劇上述指標(biāo)的異常。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，miRNA-335可能通過(guò)靶基因HDAC3調(diào)控NF-κB的表達(dá)，從而調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而改善PD的炎癥反應(yīng)。