李想，尼瑪吉宗，巴羅，鐘兵，徐小東，謝立鋒,4，杜進濤

(1.西藏大學，西藏 拉薩 850000; 2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，西藏 拉薩 850099; 3.四川大學華西醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，四川 成都 610041；4.北京大學第三醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100191)

慢性鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)是慢性鼻竇炎的一個亞型，是一種鼻腔及鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病，在鼻科學中高發(fā)，在普通人中發(fā)病率約在1%～4.3%[1]。以持續(xù)性鼻塞、流膿涕、頭痛、嗅覺減退甚至喪失為主要癥狀，嚴重影響患者的日常生活及正常工作[2-3]。近年來許多研究表明，根據(jù)嗜酸性粒細胞在鼻息肉中的浸潤程度，CRSwNP可分為嗜酸性慢性鼻竇炎伴鼻息肉(eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps,eosCRSwNP)與非嗜酸性慢性鼻竇炎伴鼻息肉(non-eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps,non-eosCRSwNP)[4]，且具有較為明顯的地域、種族及環(huán)境差異，西方國家CRSwNP患者主要以大量嗜酸性粒細胞浸潤為表現(xiàn)，伴隨嗜堿性粒細胞及肥大細胞的增多，通常伴有哮喘等變應(yīng)性疾病，且以Th2炎癥模式為主[5]。而亞洲人群中則以非嗜酸性粒細胞(如中性粒細胞)浸潤為主要特征，且以Th1或Th17炎癥模式為主[6]。就治療而言，伴鼻息肉的慢性鼻竇炎首選手術(shù)治療[7]，解除機械阻塞、重建結(jié)構(gòu)和通暢引流。有研究表明，超過50%的CRSwNP患者術(shù)后有復(fù)發(fā)情況[8]，但目前引起CRSwNP復(fù)發(fā)的因素較多且具體機制不明，鼻腔及鼻竇黏膜上皮細胞的屏障破壞，機體免疫系統(tǒng)失調(diào)以及定植菌和致病菌等在CRSwNP的復(fù)發(fā)中發(fā)揮作用[9]。已有研究證明核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptors, NLRP3)炎癥小體在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中都起到了關(guān)鍵作用，包括CRSwNP。NLRP3作為機體固有免疫的一部分，主要識別體內(nèi)的危險相關(guān)分子模式或病原相關(guān)分子模式，且主要于單核細胞、巨噬細胞、T細胞及上皮細胞等細胞胞漿內(nèi)表達[10]。NLRP3炎性小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1組成[11]。

白介素-1β(IL-1β)又被稱為稱促炎反應(yīng)細胞因子，IL-1β可以促進嗜酸性粒細胞的脫顆粒，進而增強細胞毒作用。IL-1β還參與多種黏附因子及細胞因子的合成和表達，包括 IL-18、血管細胞黏附分子、細胞間黏附分子[12]等。并在局部組織纖維化的過程發(fā)揮重要作用。

有研究表明NLRP3-(IL-1β)通路的過度激活可促進生成大量炎性因子，引起疾病的發(fā)生[12]。研究表明NLRP3炎性小體在自身免疫病、代謝性疾病、腫瘤性疾病以及多種慢性炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。本文將對eosCRSwNP中的NLRP3炎性小體及IL-1β的表達水平進行具體分析，并分析non-eosCRSwNP的復(fù)發(fā)與NLRP3及術(shù)前評分的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2019年12月—2021年6月在西藏自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科擬行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的62例患者作為研究對象，其中CRSwNP患者44例(根據(jù)組織HE染色將其分為22例non-eosCRSwNP患者，22例eosCRSsNP患者)和鼻中隔偏曲患者18例(對照組)。所有患者術(shù)前3個月及1個月均停用口服糖皮質(zhì)激素和鼻用內(nèi)類固醇。CRSwNP的標本均來自術(shù)中切除息肉。對照組為患有鼻中隔偏曲且無鼻腔炎癥性疾病患者的下鼻甲黏膜，因納入與排除標準嚴格、患者均有鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大，進行了下鼻甲的部分切除，遂選用下鼻甲黏膜。所有選取的標本分別凍存于液氮并轉(zhuǎn)存-80 ℃冰箱。研究均獲取了患者書面知情同意。兩種不用亞型CRSwNP與對照組比較癥狀評分有顯著差異(P<0.05)，但亞型間比較無顯著出差異。具體數(shù)據(jù)見表1。

納入標準：①符合CRSwNP臨床診斷標準[14];②經(jīng)CT確診；③接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療；④患者簽署該項研究的知情同意書；⑤臨床資料齊全。

排除標準：①鼻竇炎合并囊腫、血管瘤、乳頭狀瘤等疾病者；②合并變應(yīng)性鼻炎、哮喘等其他炎癥性疾病及自身免疫疾病者；③囊性纖維化、真菌性鼻竇炎、原發(fā)性纖毛運動障礙和胃食管反流疾病患者；④嚴重心、腎等臟器功能障礙或衰竭；⑤合并惡性腫瘤、鼻咽部腫瘤者；⑥合并高血壓、糖尿病等慢性疾病者；⑦臨床資料有缺失。

表1 患者臨床資料及術(shù)前評分 (分，

1.2 研究方法

1.2.1 組織學分析 CRSwNP和對照組標本石蠟包埋切片4 mm進行HE染色。在65 ℃烘干玻片2～3 h后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為3杯相同的二甲苯溶液)各浸泡5 min，100%(Ⅰ、Ⅱ)，90%，80%，70%乙醇各1 min，然后自來水沖洗3次，每次5 min。蘇木素染12 s后流水沖洗10 min；伊紅染8 s后水洗5 min。70%和95%乙醇各30 s，100%乙醇1 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3 min，然后樹膠封片，吹干1晚。隨后檢測嗜酸性粒細胞浸潤情況。檢查了5個隨機選擇的高倍視野并計數(shù)嗜酸性粒細胞。

1.2.2 免疫組化 在65 ℃烘干玻片2～3 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，100%(Ⅰ、Ⅱ)，90%，80%，70%乙醇各1 min。抗原修復(fù)：加熱抗原修復(fù)液，在95 ℃左右放入玻片10 min，降至室溫后，回收抗原修復(fù)液，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗玻片3次，然后加0.1% Tritonx-100室溫孵育10 min。在PBS洗玻片3次后擦干后加10%胎牛血清室溫孵育30 min。甩掉血清，加一抗后4°過夜。PBS 洗玻片3次后加二抗, 室溫避光孵育1 h。PBS洗玻片3次后擦干玻片, 滴1滴DAPI 染細胞核，蓋上玻片。通過顯微鏡檢測NLRP3在eosCRSwNP和non-eosCRSwNP中的分布。隨機抽取5例高倍視野，計數(shù)陽性細胞。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析 將提取的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，用對應(yīng)的引物進行定量 RT-PCR。將cDNA，2xReal PCR EasyTMMix-SYBR，正向引物，反向引物和 ddH2O 配置到總計 20 mL 的溶液中。使用合適的引物和 SYBR Premix Ex Taq 試劑盒在光學循環(huán)系統(tǒng)上進行定量PCR。具體引物序列見表2。

表2 引物列表

1.3 Non-eosCRSwNP復(fù)發(fā)判斷標準[15]

患者癥狀改善不明顯，或者癥狀如閉塞、流涕、嗅覺減退、頭痛等未改善，同時在內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)竇腔黏膜充血水腫、結(jié)締組織增生或者息肉組織生成、存在廣泛粘連現(xiàn)象、竇口發(fā)生狹窄或者關(guān)閉、存在黏膿性分泌物，則定義為復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 NLRP3和IL-1β在mRNA表達non-eosCRSwNP中升高

HE染色后利用顯微鏡計數(shù)將CRSwNP分為eosCRSwNP和non-eosCRSwNP。NLRP3炎性小體的mRNA水平：對照組(0.68±0.51)分；eosCRSwNP組(3.76±3.17)分；non-eosCRSwNP組(7.98±7.57)分。 IL-1β的mRNA水平：對照組(0.96±0.53)分；eosCRSwNP組(4.84±4.35)分；non-eosCRSwNP組(7.53±6.73)分。Non-eosCRSwNP組NLRP3和IL-1β的mRNA水平明顯高于eosCRSwNP組及對照組。見圖1。

圖1 EosCRSwNP和non-eosCRSwNP中NLRP3炎性小體和IL-1β的mRNA水平 注：*<0.05；**<0.01；***<0.001。

2.2 NLRP3的mRNA水平與術(shù)前癥狀評分正相關(guān)

術(shù)前VAS評分、Land-Mackay評分及Lund-Kennedy評分與NLRP3的mRNA水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見圖2。

2.3 免疫組化eosCRSwNP和non-eosCRSwNP中NLRP3蛋白表達水平

免疫組化結(jié)果顯示，non-eosCRSwNP和eosCRSwNP中NLRP3染色的表達顯著增加。免疫組化NLRP3染色數(shù)量：對照組(0.39±0.59)分；eosCRSwNP組(8.45±5.78)分；non-eosCRSwNP組(18.05±7.47)分。得知NLRP3染色數(shù)量在non-eosCRSwNP和eosCRSwNP表達增高，在non-eosCRSwNP中最為顯著(P<0.05)。見圖3。

2.4 NLRP3與non-eosCRSwNP患者預(yù)后的關(guān)系

通過分析相關(guān)性，我們觀察到non-eosCRSwNP患者術(shù)前VAS評分、Land-Mackay評分及Lund-Kennedy評分與免疫組化的NLRP3數(shù)量呈正相關(guān)。見圖4。

圖2 Spearman法分析NLRP3的mRNA水平與術(shù)前VAS評分、Land-Mackay評分及Lund-Kennedy評分的相關(guān)性

圖3 在每個高倍鏡視野下，免疫組化結(jié)果(×400)顯示，non-eosCRSwNP組中NLRP3水平高于eosCRSwNP組及對照組 注：*< 0.05；***< 0.01；****<0.001。

圖4 Spearman法免疫組化NLRP3與術(shù)前VAS評分、Land-Mackay評分及Lund-Kennedy評分的相關(guān)性

2.5 Non-eosCRSwNP復(fù)發(fā)相關(guān)性

NLRP3表達程度、術(shù)前VAS評分、Land-Mackay評分、Lund-Kennedy評分均在復(fù)發(fā)組鼻息肉中顯著增高，并相互具有正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表3可提示，就預(yù)測復(fù)發(fā)而言，免疫組化NLRP3表達程度、術(shù)前Lund-Kennedy評分均有意義。

3 討論

眾所周知，CRSwNP可分為non-eosCRSwNP和eosCRSwNP。研究顯示，超過一半的中國CRSwNP患者在組織學上表現(xiàn)出非嗜酸性炎癥。中國嗜酸性和非嗜酸性CRSwNP患者的中性粒細胞數(shù)量均有所增加，且non-eosCRSwNP中國患者的中性粒細胞數(shù)量高于eosCRSwNP患者，表明中國CRSwNP患者的中性粒和嗜酸性粒細胞炎癥存在差異[6]。

在嚴重的2型CRSwNP患者中，已發(fā)現(xiàn)中性粒細胞浸潤升高。在嚴重的2型免疫反應(yīng)中，嗜中性粒細胞浸潤增加，其調(diào)控作用超過了IL-17。雖然成熟中性粒細胞在CRSwNP患者的血液中占主導地位，但在CRSwNP組織中觀察到活化中性粒細胞的顯著變化，表明中性粒細胞一旦進入CRSwNP微環(huán)境就被激活[16]。有研究表明在難以治療的CRS患者中，重度或中度中性粒細胞炎癥標志物升高，鼻息肉上皮下區(qū)域中性粒細胞存在增加與CRS的頑固性相關(guān)[17]。

張沈華等[18]研究表明，Nod1蛋白在鼻息肉組織中的表達增強。也有研究表明在non-eosCRSwNP中，缺氧誘導因子可誘導M1巨噬細胞表達NLRP3 炎性小體[19]。機體受到外界刺激后激活免疫系統(tǒng)，從而引起NLRP3炎性小體的活化[20]，其可切割白介素的前體pro-IL-1β和pro-IL-18等因子，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问讲⑨尫牛瑥亩鴮е卵装Y的發(fā)生[21]。而IL-1β可以調(diào)節(jié)巨噬細胞和Th2等細胞的免疫功能，使其聚集于局部組織當中[22]，并可促進Th17的細胞分化和產(chǎn)生相關(guān)因子[23]，從而在CRSwNP的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

大量數(shù)據(jù)表明，NLRP3的激活與caspase-1結(jié)合后被激活，然后IL-1β和IL-18成熟，在細胞生長、增殖和存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本研究中，RT-PCR檢測和免疫組化結(jié)果顯示eosCRSwNP組和non-eosCRSwNP組中NLRP3及IL-1β的表達水平和NLRP3的染色表達明顯高于對照組，這與已發(fā)表的報道一致[24]，且non-eosCRSwNP組要高于eosCRSwNP組。此外相對于對照組而言NLRP3染色數(shù)量在non-eosCRSwNP和eosCRSwNP中表達增高。相關(guān)性分析表明，NLRP3的RNA水平及其免疫組化蛋白表達程度與術(shù)前的VAS、Land-Mackay、Lund-Kennedy等評分呈線性相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)了non-eosCRSwNP的復(fù)發(fā)與Lund-Kennedy評分及免疫組化的NLRP3表達程度的相關(guān)性，且均有統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示NLRP3在促進CRSwNP中上皮細胞生長和炎癥細胞浸潤方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，且NLRP3在non-eosCRSwNP中的作用更為明顯。這些結(jié)果表明，在對抗空氣中微生物的過程中，NLRP3炎癥小體作為模式識別受體被激活廣泛的病原體相關(guān)分子模式，可能觸發(fā)caspase-1的激活，導致成熟的IL-1β和IL-18，發(fā)揮促炎作用增強鼻息肉發(fā)生。

本研究的一些局限性需要闡述。首先，本研究納入的樣本量相對較小，需要大樣本量和具有代表性的研究來進一步闡明這一發(fā)現(xiàn)。其次，我們只研究了NLRP3在CRSwNP中的表達，還需要對NLRP3在無鼻息肉的慢性鼻竇炎和慢性鼻竇炎各種表型中的表達及作用進行全面詳細的研究，以進一步闡明 NLRP3在慢性鼻竇炎發(fā)病機制中的作用。

綜上，NLRP3及IL-1β在non-eosCRSwNP中相比在CRSwNP及正常鼻黏膜中有較高表達并與臨床癥狀體征存在相關(guān)性，因此，NLRP3可作為預(yù)測non-eosCRSwNP病情嚴重程度及復(fù)發(fā)的重要指標之一。為深入研究NLRP3及IL-1β在non-eosCRSwNP中的作用機制提供先前理論依據(jù)，也為預(yù)測non-eosCRSwNP的復(fù)發(fā)提供新的視野。最終為non-eosCRSwNP的干預(yù)研究提供新靶點。

表3 Non-eosCRSwNP患者的基本信息與復(fù)發(fā)的關(guān)系 (分，