張 蕾，魏愛麗，張曉軍，暢志堅(jiān)，喬麟軼*

(1 太原師范學(xué)院 生物系，山西晉中 030619；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030031)

土壤鹽漬化是威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一。全世界近10億hm2土地受到不同程度的鹽漬化影響，中國鹽漬土面積達(dá)1億hm2，且受災(zāi)面積逐年增加[1-2]。過多的土壤鹽分會(huì)對(duì)農(nóng)作物造成滲透脅迫和離子毒害，引起植株生理干旱和代謝紊亂而導(dǎo)致減產(chǎn)[2]。發(fā)掘耐鹽相關(guān)基因、選育抗逆品種是緩解土壤鹽害和保障糧食安全最為經(jīng)濟(jì)、有效的措施。

近年來，植物中報(bào)道了多種鹽脅迫響應(yīng)基因，并被提出可用于改善作物的耐鹽性[3-5]。其中，脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(dehydration responsive element binding，DREB)是一類響應(yīng)逆境脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子，可通過結(jié)合DRE/CRT順式元件進(jìn)一步調(diào)控RD29(responsive to desiccation)[6]、GLOS(galactinol synthase)[7]和CKX(cytokinin oxidases/dehydrogenases)[8]等下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高對(duì)不良環(huán)境的耐受能力。在擬南芥中，DREB家族包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，并且其第14位和第19位氨基酸分別是纈氨酸(14-V)和谷氨酸(19-E)[9]，部分DREB蛋白可被RING型E3連接酶結(jié)合并移至泛素途徑降解[10]。1999年，擬南芥AtDREB1A最先被證實(shí)受鹽脅迫后上調(diào)，過表達(dá)植株對(duì)NaCl的耐受性增強(qiáng)[11]，其表達(dá)水平還受其他DREB蛋白[12]或MYB[13]等上游轉(zhuǎn)錄因子的抑制。之后，水稻[14]、大豆[15]、玉米[16]等作物中的耐鹽DREB基因也陸續(xù)被鑒定。

小麥?zhǔn)侨蚍N植面積最廣的糧食作物，目前小麥中已有9個(gè)DREB基因被鑒定功能[17-22]，其中3個(gè)基因TaDREB1、Wdreb2和TaDREB3-AI與鹽脅迫相關(guān)。TaDREB1在小麥苗期受NaCl處理后表達(dá)水平上調(diào)[23]，但也有研究顯示TaDREB1的表達(dá)水平與苗期耐鹽表型無關(guān)[24]，而在萌發(fā)期受到鹽脅迫后，小麥種子中只檢測(cè)到TaDREB1-D的表達(dá)水平[25]；Wdreb2的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，并且其轉(zhuǎn)錄水平和可變剪切均受到鹽脅迫的調(diào)控[24,26]；TaDREB3-AI也受鹽脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)TaDREB3-AI的擬南芥植株耐鹽性增強(qiáng)[27]。除此以外，小麥其余DREB基因受鹽脅迫后的響應(yīng)情況暫無報(bào)道。

本研究對(duì)1份小麥耐鹽材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR，分析小麥DREB基因受鹽脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄剪切的變化情況，并對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期發(fā)掘鹽脅迫響應(yīng)基因，為后續(xù)功能驗(yàn)證或耐鹽分子育種提供參考信息。

1 材料和方法

1.1 植物材料

耐鹽小麥材料CH7034由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(原山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)暢志堅(jiān)研究員選育[28]，用于鹽脅迫處理、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及qRT-PCR。

1.2 方 法

1.2.1 鹽脅迫處理將小麥種子用1%的雙氧水消毒后放置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)，待胚根伸長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中的1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液中生長(zhǎng)，參數(shù)設(shè)置為16 h光照/8 h黑暗，24 ℃/16 ℃；待幼苗生長(zhǎng)至3葉期時(shí)更換含250 mmol·L-1NaCl的1/2霍格蘭氏營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫，在0、1、6和24 h時(shí)剪取幼苗根，于-80 ℃保存。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)處理將鹽脅迫處理前后的根組織送北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建cDNA文庫，庫檢合格后用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。將質(zhì)檢過濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)小麥品種‘中國春’參考基因組IWGSCv1.1 (http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)獲得具有基因注釋信息的序列；利用TopHat+Cufflinks+edgeR[29-30]方法獲得上述注釋序列在不同處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平值，并以|log2(FPKMt/FPKMt0)|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，相關(guān)結(jié)果用Circos[31]輸出?；诎龠~客云服務(wù)器工具(https://international.biocloud.net/)獲得上述DEGs的可變剪接情況和GO富集信息；利用PlantCARE工具[32]分析DEGs起始密碼子上游2 000 bp序列中的DRE/CRT等順式作用元件。

1.2.3 序列分離與分析利用AP2超家族的隱馬爾可夫模型文件(編號(hào)PF00847.20，下載自Pfam數(shù)據(jù)庫，http://pfam.xfam.org/)在nhmmer軟件(https://www.mankier.com/1/nhmmer)中檢索普通小麥品種‘中國春’IWGSCv1.1注釋蛋白序列 (下載自URGI數(shù)據(jù)庫，http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)，獲得包含AP2結(jié)構(gòu)域的小麥序列，從結(jié)果中進(jìn)一步篩選包含DREB家族特征(14-V和19-E)的序列作為小麥DREB序列；根據(jù)小麥DREB編碼序列檢索轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中的Mapped Data，獲得對(duì)應(yīng)的表達(dá)水平值、可變剪接情況和起始密碼子上游2 000 bp序列中的順式作用元件信息。利用MEGA6.0[33]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用STRING工具[34]預(yù)測(cè)蛋白互作。

1.2.4 qRT-PCR利用RNA提取試劑盒(北京天漠，TR205-200)提取樣品總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物, RR047A)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)CH7034鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組結(jié)果選擇差異表達(dá)的TaDREB成員，在A/B/D組間的保守序列設(shè)計(jì)定量引物，引物信息列于表1。在ABI QuantStudio5 PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR，使用的酶為Premix Ex TaqⅡ(大連寶生物, RR820A)，內(nèi)參基因?yàn)樾←淕ADPH，每反應(yīng)重復(fù)3次，參考2-ΔΔCT法[35]分析結(jié)果。

表1 用于qRT-PCR的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥DREB基因分布

從‘中國春’小麥蛋白庫中檢索出559條包含AP2結(jié)構(gòu)域的序列，從中進(jìn)一步篩選結(jié)構(gòu)域第14位和第19位氨基酸分別是纈氨酸V和谷氨酸E的序列，最終獲得204條DREB序列，分布于小麥21條染色體。其中，在小麥A、B、D亞基因組中的數(shù)目為65、66和73，在第1至第7同源群分布數(shù)目依次為21、31、12、12、62、41和25。根據(jù)亞基因組同源關(guān)系將其歸為48個(gè)成員，根據(jù)在1～7號(hào)染色體上的物理排列順序?qū)ζ湟来尉幪?hào)(圖1，圖2)，命名為TaDREB1～TaDREB48。分析結(jié)果顯示，TaDREB11、TaDREB12、TaDREB25、TaDREB32、TaDREB41和TaDREB43-D經(jīng)歷過串聯(lián)重復(fù)事件，TaDREB25重復(fù)次數(shù)最多，在A/B/D亞基因組中形成3個(gè)分別包含17、17和20個(gè)DREB序列的基因簇。序列分析表明，TaDREB3是已報(bào)道的小麥耐鹽基因Wdreb2[26]和TaDREB3-AI[27]，TaDREB16是耐鹽基因TaAIDFa[17]、TaDREB1[25]，而成員TaDREB17、TaDREB21、TaDREB24、TaDREB25.9、TaDREB35、TaDREB41和TaDREB42則是已知耐寒、耐旱等其他抗逆基因[17-22](圖1)。

*表示串聯(lián)重復(fù)基因，灰色表示本研究中受NaCl脅迫處理后轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化的基因；小麥中已報(bào)道的耐鹽和其他抗逆DREB基因分別用方框和下劃線表示[17-27]

2.2 鹽脅迫下TaDREBs轉(zhuǎn)錄水平變化

多重序列比對(duì)結(jié)果將TaDREB家族分為14組(G1～G14，圖2)。CH7034轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，位于G2、G5、G10和G14的TaDREB成員受NaCl脅迫1、6和24 h后轉(zhuǎn)錄水平均無顯著變化，其余組中共有25個(gè)TaDREB成員表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫不同程度地響應(yīng)。其中，有8個(gè)成員(TaDREB3、TaDREB6、TaDREB19、TaDREB21、TaDREB23、TaDREB31、TaDREB37和TaDREB41)在鹽脅迫后持續(xù)上調(diào)，而有3個(gè)成員(TaDREB25、TaDREB35和TaDREB44)表現(xiàn)為持續(xù)下調(diào)(圖2)。總體來看，每條染色體上均有響應(yīng)鹽脅迫的DREB基因(圖1)。

基因在0、1和24 h均缺失轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)表示其在取樣時(shí)期不表達(dá)；圓形標(biāo)簽標(biāo)注的基因用于qRT-PCR驗(yàn)證

2.3 鹽脅迫下TaDREB可變剪切變化

對(duì)TaDREB家族受鹽脅迫后的可變剪切情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示，48個(gè)TaDREB成員中有9個(gè)成員的可變剪切數(shù)目受鹽處理后發(fā)生了變化。TaDREB3和TaDREB16的B基因組拷貝可變剪切數(shù)目分別表現(xiàn)出持續(xù)降低和持續(xù)升高的趨勢(shì)，其余亞基因組拷貝的剪切變化則無明顯規(guī)律；TaDREB6、TaDREB19和TaDREB21在脅迫前均無可變剪切，受鹽脅迫后A基因組拷貝均發(fā)生了2次剪切事件；類似的還有TaDREB24和TaDREB25.12，在脅迫后其B/D組和D組拷貝分別產(chǎn)生了可變剪切；剩余的TaDREB43和TaDREB47在脅迫前后的剪切變化無明顯規(guī)律。

圖3 NaCl處理后可變剪切發(fā)生變化的TaDREB成員

2.4 TaDREB鹽脅迫相關(guān)靶基因預(yù)測(cè)

從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選出4 189個(gè)受鹽脅迫后1、6和24 h持續(xù)上調(diào)或下調(diào)的DEGs，從中進(jìn)一步鑒定出2 354個(gè)起始密碼子上游2 000 bp區(qū)含有DRE/CRT元件的DEGs，GO富集結(jié)果將其劃分為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類(圖4，A)。在生物學(xué)過程類別中，屬于刺激響應(yīng)(response to stimulus)和代謝過程(metabolic process)的基因最多，分別富集到203和109個(gè)；在細(xì)胞組分類別中，屬于膜組分(membrane part)和膜(membrane)的基因最多，分別為380和239個(gè)；在分子功能類別中，較多的基因種類有催化活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)、抗氧化活性(antioxidant activity)和轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)，數(shù)目分別為532、349、324和198個(gè)。

A.啟動(dòng)子區(qū)含DRE/CRT元件的DEGs的GO富集結(jié)果；B.3個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的起始密碼子上游2 000 bp序列中DRE/CRT元件以及基因?qū)}脅迫的響應(yīng)。標(biāo)尺為起始密碼子上游序列長(zhǎng)度(5′-3′方向)，圖例為順式作用元件

根據(jù)GO注釋信息，從中選出分別與已報(bào)道RD29、GLOS和CKX編碼結(jié)構(gòu)相似的3類DEGs，每類再選擇響應(yīng)鹽脅迫程度最大、且在A/B/D亞基因組中表達(dá)趨勢(shì)一致的基因(暫命名為TaRD29、TaGLOS和TaCKX)作為TaDREB的候選靶基因(圖4，B)。

2.5 鹽脅迫響應(yīng)TaDREB及其預(yù)測(cè)靶基因的驗(yàn)證

基于上述分析結(jié)果，我們將鹽脅迫后轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)上調(diào)的8個(gè)成員(TaDREB3、TaDREB6、TaDREB19、TaDREB21、TaDREB23、TaDREB31、TaDREB37和TaDREB41)和持續(xù)下調(diào)的3個(gè)成員(TaDREB25、TaDREB35和TaDREB44)，以及TaDREB16(即已知耐鹽基因TaAIDFa/TaDREB1)和3個(gè)預(yù)測(cè)靶基因(TaRD29、TaGLOS和TaCKX)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖5所示，上調(diào)成員中，TaDREB19在鹽處理1 h的表達(dá)量略有下降，之后持續(xù)上升；其余成員以及TaDREB16均表現(xiàn)出持續(xù)上升趨勢(shì)。而在下調(diào)成員中，只有TaDREB25和TaDREB35的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而TaDREB44的表達(dá)水平變化則沒有明顯規(guī)律。3個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)量均持續(xù)上升，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

t檢驗(yàn)用于檢測(cè)基因在1/6/24 h和0 h的表達(dá)量之間的差異程度，*和**分別表示顯著(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)

2.6 鹽脅迫下調(diào)TaDREB成員分析

進(jìn)一步分析了鹽脅迫后下調(diào)成員TaDREB25和TaDREB35的起始密碼子上游2 000 bp序列，該區(qū)段包含DREB和MYB的結(jié)合位點(diǎn)(圖6，A)，猜測(cè)這2個(gè)成員的表達(dá)可能受到轉(zhuǎn)錄因子的抑制。接著對(duì)其編碼蛋白的降解可能性進(jìn)行分析，從轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中調(diào)取了209個(gè)GO注釋為RING型E3泛素連接酶(RE3L)的序列，將這些序列的編碼蛋白與TaDREB25和TaDREB35的編碼蛋白進(jìn)行互作預(yù)測(cè)。結(jié)果未檢測(cè)到TaDREB25的互作蛋白，與TaDREB35可能存在互作則有11個(gè)RE3L序列，屬于4個(gè)基因RE3L1～4的不同亞基因組拷貝(圖6，B)，而RE3L1～4是小麥中與擬南芥DREB降解蛋白AtDRIP1序列相似度最高的蛋白(圖6，C)。其中RE3L1的A/B/D亞基因組拷貝受鹽脅迫后均顯著上調(diào)(圖6，D)，推測(cè)TaDREB35可能會(huì)被RE3L1結(jié)合后經(jīng)泛素途徑降解。

3 討 論

3.1 TaDREB受鹽脅迫后的響應(yīng)模式

基因轉(zhuǎn)錄水平變化是植物受非生物脅迫后發(fā)生的主要響應(yīng)事件之一，并引起一系列植株生理和生化反應(yīng)[36]。本研究分離的48個(gè)TaDREB家族成員在受NaCl處理后，表現(xiàn)出不同的表達(dá)響應(yīng)模式。首先，23個(gè)(48%)TaDREB成員的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化，這種模式常見于成員眾多的基因家族中，部分成員會(huì)逐漸退化或維持低轉(zhuǎn)錄水平，或者只在特定時(shí)空或受到特定脅迫后轉(zhuǎn)錄，以減少功能冗余[37]。本研究中該模式在部分旁系基因?qū)?paralog pair)中也有出現(xiàn)，例如G1中的TaDREB8(不響應(yīng))-TaDREB41(響應(yīng))、TaDREB11(不響應(yīng))-TaDREB34(響應(yīng))和G11中的TaDREB18(不響應(yīng))-TaDREB37(響應(yīng))；其次，結(jié)合qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果，在脅迫后有9個(gè)成員表達(dá)量持續(xù)上升、2個(gè)成員持續(xù)下降。這11個(gè)(23%)成員的亞基因組拷貝表現(xiàn)出一致的轉(zhuǎn)錄變化趨勢(shì)，表明這些拷貝受到共同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制，該比例與六倍體小麥中亞基因組協(xié)同表達(dá)模式基因的總比例(28%)[38]接近；最后，剩余基因成員的不同亞基因組拷貝對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出不同程度的轉(zhuǎn)錄水平變化，最近有研究將這種模式定義為表達(dá)失調(diào)(dysregulation)，基因A/B/D不同拷貝間的這種表達(dá)量差異可能會(huì)對(duì)農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響[39]；其中2個(gè)成員TaDREB12和TaDREB32是經(jīng)歷過串聯(lián)重復(fù)的基因簇，除了顯示鹽脅迫后表達(dá)失調(diào)以外，還發(fā)生了重復(fù)成員表達(dá)沉默和亞基因組拷貝停止響應(yīng)的情況。

3.2 鹽脅迫相關(guān)TaDREB可能的分子機(jī)制

在鑒定出的11個(gè)鹽脅迫響應(yīng)成員中，TaDREB6、TaDREB19和TaDREB21的A基因組拷貝在NaCl處理6 和24 h產(chǎn)生了新的可變剪切，發(fā)生位置均為調(diào)控位點(diǎn)較多的TSS(transcription start site)和TTS(transcription terminal site)。TaDREB3和TaDREB16則發(fā)生了更多的剪切事件，其中TaDREB3與已報(bào)道Wdreb2受鹽脅迫后剪切變化情況類似[26]，這些可變剪切可能是造成上述5個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)的原因。此外，bHLH等轉(zhuǎn)錄因子也會(huì)造成DREB基因的上調(diào)[40]；而某些DREB或MYB則會(huì)抑制DREB的轉(zhuǎn)錄[12-13]，造成基因表達(dá)量降低。本研究中TaDREB25和TaDREB35在鹽脅迫后下調(diào)，可能也受到了上游轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)調(diào)控，其具體的生物學(xué)意義暫時(shí)無法得知，初步猜測(cè)這2個(gè)TaDREB成員與擬南芥AtDREB2A[41]類似，在逆境響應(yīng)通路中起負(fù)調(diào)控作用，或者其調(diào)控的下游生理生化反應(yīng)不利于植株在逆境下生存，因此在受到非生物脅迫后，其表達(dá)被抑制。其中，TaDREB35的編碼產(chǎn)物還可能會(huì)被泛素途徑降解；而TaDREB35即已報(bào)道的耐旱相關(guān)基因TaWXPL2[21]，TaWXPL2在脫水條件下的葉片中上調(diào)，但在某些品種中或受到重度干旱脅迫后也表現(xiàn)為下調(diào)，表明該基因的表達(dá)會(huì)受材料遺傳背景、非生物脅迫種類或脅迫程度等因素的影響。

作為轉(zhuǎn)錄因子，DREB會(huì)調(diào)控下游靶基因進(jìn)而激活一系列抗逆反應(yīng)來應(yīng)對(duì)外界脅迫。本研究篩選出2 354個(gè)啟動(dòng)子區(qū)含有DRE/CRT元件的、與TaDREB共表達(dá)的DEGs作為候選靶基因庫，富集到較多基因的類別有：生物學(xué)過程中的刺激響應(yīng)和代謝過程、細(xì)胞組分中的膜組分、分子功能中的催化活性、結(jié)合、抗氧化活性和轉(zhuǎn)錄因子活性等。該結(jié)果與已知的耐鹽下游通路反應(yīng)一致，如合成大量脯氨酸等有機(jī)物以提高原生質(zhì)滲透壓、強(qiáng)化膜蛋白功能以將過多Na+排出或隔離到液泡、提高細(xì)胞對(duì)過氧化物的清除能力以緩解脅迫造成的損害等[42]。

3.3 鹽脅迫響應(yīng)上調(diào)成員TaDREB21

在TaDREB成員中，TaDREB21在耐鹽品系CH7034受脅迫前后的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著，qRT-PCR結(jié)果證實(shí)TaDREB21在受到NaCl處理1、6、24 h后表達(dá)水平顯著上調(diào)；此外，CH7034的耐鹽性由多個(gè)QTL共同調(diào)控[28]，而TaDREB21的B基因組拷貝 (4B:541.9 Mb)位于耐鹽位點(diǎn)QSI.sxau_4B.2 (4B:445.1～624.5 Mb)區(qū)段內(nèi)，這些結(jié)果表明TaDREB21可能在小麥抗逆信號(hào)通路中發(fā)揮作用。接下來將利用遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)驗(yàn)證TaDREB21的功能，如最終證實(shí)其耐鹽性，可將TaDREB21以及CH7034用于小麥品種改良。

目前在中國鹽堿地區(qū)小麥生產(chǎn)中，除了利用栽培技術(shù)提升產(chǎn)量以外[43]，選育并推廣耐鹽品種已逐漸成為主要措施，展示出廣闊前景。DREB基因已被開始用于小麥耐鹽性改良，轉(zhuǎn)入大豆GmDREB1的小麥品種‘魯麥22’和‘濟(jì)麥19’均表現(xiàn)出很好的耐鹽性[44-45]。本研究鑒定的TaDREB21等11個(gè)小麥鹽脅迫響應(yīng)DREB成員經(jīng)過進(jìn)一步功能驗(yàn)證后，將為小麥抗逆分子育種提供候選基因。