梁 芳，劉利娟，李成松，趙煒棟，劉應(yīng)高，楊春琳

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，成都 611130)

病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)是一類在植物體內(nèi)受生物和非生物脅迫而誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的總稱，可通過增厚細(xì)胞壁、增強抗菌活性和參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種方式抵御病害侵染[1]。目前，根據(jù)PR蛋白家族成員的氨基酸序列相似程度、血清學(xué)關(guān)系及生物學(xué)活性等特征，一般將其分為17個家族[2-3]。PR蛋白家族成員在植物自我防御機制中作為可被誘導(dǎo)的組分發(fā)揮作用，包括幾丁質(zhì)酶、葡聚糖苷酶、防御素、蛋白酶抑制劑、內(nèi)肽酶、類甜蛋白、過氧化物酶和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白等組分[4-5]。PR10蛋白為類核糖核酸酶，大多數(shù)PR10蛋白是一類典型的小分子量、呈酸性、無信號肽的胞內(nèi)蛋白[6]。根據(jù)PR10蛋白的氨基酸序列的相似性、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)功能預(yù)測結(jié)果，可將其分為以下兩種類型：一類是具有核糖核酸酶同源性胞內(nèi)病程相關(guān)蛋白(intracellular pathogenesis-related protein, IPR)，另一類是烏藥堿合酶(norcoclaurine synthases, NCS)[6]。經(jīng)研究，PR10蛋白具有體外核糖核酸酶(RNase)活性和抗菌活性，參與植物的次生代謝反應(yīng)，在植物抵御多種生物和非生物脅迫的防御機制中起著重要作用[7-9]。迄今，人們已從不同植物中發(fā)現(xiàn)大量PR10蛋白或者PR10相關(guān)蛋白。PR10蛋白廣泛存在于被子植物中，在水稻(Oryzasativa)[10]、大豆(Glycinemax)[11]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[12]和玉米(Zeamays)[13]等植物中相繼發(fā)現(xiàn)PR10蛋白的存在。此外，在裸子植物中也發(fā)現(xiàn)了PR10蛋白的存在，目前已有西部白松(Pinusmonticola)[14]和北美黃杉(Pseudotsugamenziesii)[15]等裸子植物PR10蛋白的相關(guān)研究。

粗枝云杉(Piceaasperata)是松科(Pinaceae)云杉屬(Picea)植物，為中國特有種，是多年生常綠喬木，適應(yīng)性強，材質(zhì)優(yōu)良，多分布在川西高原、甘肅南部和陜西西南部的亞高山地帶[16]。近年來，西南亞高山地區(qū)人工云杉林落針病害發(fā)生普遍，導(dǎo)致云杉生長緩慢甚至衰敗死亡[17-18]。據(jù)2019年全國有害生物普查結(jié)果顯示，云杉落針病發(fā)生面積已超過6.667萬hm2，極大地威脅著西南及長江中上游地區(qū)的生態(tài)屏障建設(shè)。篩選和發(fā)掘云杉抗落針病基因資源，將為云杉抗病基因工程育種打下基礎(chǔ)。目前，已有部分云杉抗病基因被報道，包括云杉PR3家族的幾丁質(zhì)酶PlCHI基因[19]、PR5家族的類甜蛋白基因[20]和PR12家族的防御素基因[21]等，但對于云杉PR10家族則鮮有報道?；诖耍狙芯恳源种υ粕家荒晟啄坩樔~為材料，通過克隆獲得響應(yīng)云杉落針病菌(Lophodermiumpiceae)侵染的PaPR10基因cDNA全長序列，利用生物信息學(xué)分析其核苷酸和氨基酸序列，然后將該基因?qū)氪竽c桿菌(Escherichiacoli)中進(jìn)行原核表達(dá)，以優(yōu)化條件進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化，并利用底物法測定純化蛋白的核糖核酸酶活性，以期為揭示PaPR10基因在云杉抗病中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試粗枝云杉采自四川省甘孜藏族自治州二郎山林場；植物RNA提取試劑盒購自華越洋生物科技有限公司(北京)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體和pET-32a載體均購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司(大連)；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)；大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)均購自全式金生物技術(shù)有限公司(北京)；BamHⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自NEB有限公司(北京)；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司(上海)；其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方 法

1.2.1PaPR10基因的擴(kuò)增及克隆以粗枝云杉一年生幼嫩針葉為材料，使用植物RNA提取試劑盒提取粗枝云杉總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶完整性，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測其濃度和純度。以檢測合格的總RNA為底物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存。根據(jù)課題組前期的健康和感云杉落針病菌的粗枝云杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選得到一個在感病后顯著上調(diào)的PaPR10基因，以該基因的CDS區(qū)設(shè)計特異性引物PaPR10-F和PaPR10-R(表1)。以粗枝云杉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化回收后連接至pMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于LB/Amp/X-gal平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的克隆菌落送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.2PaPR10基因序列及編碼蛋白序列分析通過在線軟件ORF Finder查找序列的開放閱讀框，利用DNAMAN 6.0軟件將核苷酸序列翻譯為氨基酸序列；使用在線軟件NCBI Blast進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列比對分析；利用ClustalX 1.81軟件將編碼蛋白序列與其他植物PR10蛋白序列進(jìn)行多重對比分析，并通過在線軟件ESPript 3.0將多重比對分析結(jié)果進(jìn)行比對注釋；使用在線軟件ProtParam和TargetP-2.0分別進(jìn)行蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位；在線軟件SignalP-5.0和TMHMM-2.0分別進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測和跨膜域分析；在線軟件NetPhos 3.1 server進(jìn)行蛋白磷酸化位點的預(yù)測；在線軟件ExPASy-Prosite進(jìn)行蛋白質(zhì)功能位點和功能域分析，在線網(wǎng)站PSIPRED進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；在線軟件SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；MEGA 5.05軟件的相鄰連接法(neighbor-joining)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹并利用在線網(wǎng)站Evolview對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行著色分析。相關(guān)在線網(wǎng)站的網(wǎng)址可參考劉利娟[19]和劉裕峰等[20]的生物信息學(xué)分析方法。

1.2.3PaPR10基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定根據(jù)克隆獲得的粗枝云杉PaPR10基因序列，設(shè)計1對含BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位點的特異性引物PaPR10BamH Ⅰ-F和PaPR10Hind Ⅲ-R(表1)。以pMD19T-PaPR10重組質(zhì)粒為模板，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶分別酶切目的片段和pET-32a載體，酶切產(chǎn)物純化回收后利用T4DNA連接酶16 ℃連接12 h。將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp抗性篩選后，再進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定，挑選陽性克隆送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 PaPR10蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析將測序正確的菌液繼續(xù)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及優(yōu)化。IPTG濃度優(yōu)化：將過夜培養(yǎng)的菌液按照1∶100的比例加入到含有100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min活化2.5 h，然后分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)3 h。參照劉利娟等[19]的方法對誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行處理和SDS-PAGE電泳檢測。以最適IPTG濃度進(jìn)行最適誘導(dǎo)時間的優(yōu)化，設(shè)置的時間梯度為2、4、6、8和10 h；然后以最適IPTG誘導(dǎo)濃度和最適誘導(dǎo)時間進(jìn)行最適誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化，設(shè)置的溫度梯度為20、25、30和37 ℃誘導(dǎo)。誘導(dǎo)得到的蛋白均以相同方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。所有SDS-PAGE電泳檢測均以未加IPTG誘導(dǎo)的菌液、IPTG誘導(dǎo)的空載體和未加IPTG誘導(dǎo)的空載體為對照。

1.2.5 PaPR10蛋白的純化及活性檢測以優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)體系表達(dá)PaPR10蛋白，使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。采用底物法[22]檢測PaPR10蛋白的體外核酸酶活性。以5 μL 10 mg/mL酵母RNA為底物，分別加入5 μL PaPR10純化蛋白溶液(實驗組)、5 μL DEPC水(對照組)、5 μL蛋白非變性洗脫液(對照組)、5 μL RNA酶清除劑(對照組)和2.5 μL PaPR10純化蛋白溶液+2.5 μL RNA酶清除劑(對照組)，在37 ℃下反應(yīng)30 min，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酵母RNA的降解結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗枝云杉PaPR10基因全長cDNA擴(kuò)增

以粗枝云杉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約500 bp位置處顯示與預(yù)期目的基因大小相符的單一條帶(圖1)。經(jīng)測序，該核苷酸片段長度為456 bp。將其核苷酸序列通過DNAMAN翻譯為氨基酸序列，并上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為OM743228。

M. DL2000；1.PaPR10

2.2 PaPR10基因核苷酸序列分析

DNAMAN序列分析結(jié)果表明，PaPR10基因的開放閱讀框(ORF)為456 bp，共編碼151個氨基酸(圖2)。Blastn比對結(jié)果表明，該基因序列與松科植物的PR10基因序列相似性均在90%以上，其中與北美云杉(Piceasitchensis)的PR10基因序列相似性最高，達(dá)到98.90%，與白云杉(Piceaglauca)的PR10基因序列相似性達(dá)97.95%，表明PaPR10基因序列在進(jìn)化過程中較為保守。

方框為甘氨酸富集區(qū)；下劃線為預(yù)測的潛在磷酸化位點；*為終止密碼子

2.3 PaPR10蛋白的氨基酸序列分析

ProtParam分析結(jié)果表明，PaPR10蛋白的分子式為C744H1189N191O222S5，相對分子量為16 522.07 Da，理論等電點為5.73，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為19個，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為17個。該蛋白由20種氨基酸組成，不穩(wěn)定指數(shù)為31.95，是穩(wěn)定性蛋白；脂肪族氨基酸指數(shù)為91.06；親水性的總平均值為-0.060，屬親水性蛋白。由SignalP 5.0和TargetP 2.0預(yù)測結(jié)果可知，PaPR10蛋白不含信號肽，且定位于細(xì)胞質(zhì)中，屬于胞內(nèi)蛋白。TMHMM 2.0預(yù)測結(jié)果表明，PaPR10蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域。通過NetPhos 3.1 server分析結(jié)果可知，PaPR10蛋白中存在6個絲氨酸磷酸化位點和7個蘇氨酸磷酸化位點，這些位點可能與生物活性相關(guān)。

應(yīng)用Clustal X 1.81和ESPript 3.0對PaPR10氨基酸序列與其他6種植物的PR10蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比對和注釋，結(jié)果(圖3)顯示，PaPR10氨基酸序列在C端(141～147位氨基酸)具有一個保守序列：K-A-X-E-X-Y-L(X代表任意氨基酸)。PR10蛋白的氨基酸序列通常在N端存在富含甘氨酸的P-Loop的保守結(jié)構(gòu)(G-X-G-G-X-G)，該結(jié)構(gòu)可能與PR10蛋白家族的核酸酶活性相關(guān)[22-23]。而PaPR10蛋白在P-Loop保守結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)了氨基酸代替，結(jié)構(gòu)序列改變?yōu)镚DGNVGTIRR。

PaPR10.粗枝云杉；ABK21878.1.北美云杉；ABC74789.1.辣椒；ABW99634.1.歐洲李；AAL27005.1.水稻； RLN41266.1.黍；AJI77535.1.紫檀；箭頭為β-折疊；大波浪曲線為α-螺旋；字母TT為β-轉(zhuǎn)角；小波浪曲線為η-螺旋

2.4 PaPR10蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

Blastp分析結(jié)果表明，PaPR10蛋白具有病程相關(guān)蛋白Bet_v_1疏水結(jié)構(gòu)域(1～150位氨基酸)，該結(jié)構(gòu)域富含甘氨酸環(huán)(44～52位氨基酸)，且有33個疏水配體結(jié)合位點(圖4)。PaPR10蛋白與樺樹(Betula)花粉過敏原十分相似，隸屬于SRPBCC(Bet_v_1)超家族，推測其可能具有該基因家族的生物學(xué)功能。ScanProsite分析結(jié)果表明，PaPR10蛋白含有1個N-糖基化位點(77～80位氨基酸)、1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(83～86位氨基酸)、3個N-豆蔻?；稽c(46～51位、59～64位和105～110位氨基酸)、4個蛋白激酶C磷酸化位點(分別為50～52位、67～69位、99～101位和110～112位氨基酸)。SOPMA分析結(jié)果表明(圖5)，PaPR10蛋白的二級結(jié)構(gòu)由4部分組成，其中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最大，占39.07%；α-螺旋結(jié)構(gòu)次之，占28.48%；延伸鏈結(jié)構(gòu)占25.17%；β-轉(zhuǎn)角最少，僅占7.28%。SWISS-MODEL三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明(圖6)，PaPR10氨基酸序列的C端包含一個由23個氨基酸組成的α3螺旋，該螺旋被7股反向平行β折疊包圍，其N端結(jié)構(gòu)域的2個短α1和α2螺旋處于折疊片層β1和β2之間螺旋，glycine-rich_loop結(jié)構(gòu)域(G-X-G-X-X-G)位于β2和β3之間。粗枝云杉PaPR10蛋白的三級結(jié)構(gòu)與已報道的其他植物PR10蛋白的三級結(jié)構(gòu)具有高度相似性。

圖4 PaPR10蛋白保守功能域

藍(lán)色表示α-螺旋；紫色表示無規(guī)則卷曲；紅色表示延伸鏈；綠色表示β-轉(zhuǎn)角；標(biāo)尺數(shù)值表示氨基酸位置

圖6 PaPR10蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.5 PaPR10蛋白的同源進(jìn)化分析

利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建PaPR10蛋白和不同植物PR10蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明(圖7)：PR10蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹由雙子葉植物組、單子葉植物組、裸子植物和苔蘚植物組三大分支構(gòu)成。PaPR10蛋白歸屬于IPR類，與北美云杉(P.sitchensis)PR10蛋白聚為一支，親緣關(guān)系最近，有趣的是，PaPR10蛋白與低等植物小立碗苔蘚(Physcomitrellapatens)PR10蛋白的親緣關(guān)系次之，比同科植物的海岸松(Pinuspinaster)、西部白松(P.monticola)、白云杉(P.glauca)PR10蛋白的親緣關(guān)系更為親近。推測粗枝云杉PaPR10蛋白在進(jìn)化過程中是相對緩慢且高度保守的。

藍(lán)色區(qū)域為雙子葉植物；紅色區(qū)域為單子葉植物；黃色區(qū)域為裸子植物；灰色區(qū)域為苔蘚植物；紅色星標(biāo)為粗枝云杉PaPR10蛋白； 1B6F_A、1BTV_A和4A8U_A. 歐洲白樺；ABC41627.1、CAB94732.1.海島棉；AF323973.1.歐榛；AFF59691.1.櫟木；CAA10235.1.山楂；CAD33532.1.紅棗；AET44159.1.草莓；CAK93672.1.蘋果；ABW99634.1、ABW99628.1和ABB78006.1.歐洲李；ADP69174.1.毛白楊；QYD13594.1.海島棉；ABC86747.1.華東葡萄；CAC16166.1.葡萄；AFJ05109.1.丹參；PWA46649.1.黃花蒿；ACY36943.1.人參； ASM46793.1.三七；AEV54114.1.麻風(fēng)樹；ADC31789.1.大豆；AAU81922.1.花生；CAA03926.1.白羽扇豆；AAF77634.1.黃羽扇豆； AAX19889.1.綠豆；AAA90954.1.豌豆；AAB07447.1.黃豌豆；AFD29283.1.蠶豆；ABG85155.1、CAJ43118.1和ACD39391.1.花生； ACM17134.1.海島棉；AAU85527.1.木本棉；AAA03020.1、AAA03019.1.馬鈴薯；AEY11296.1.煙草；AHC08074.1.甘蔗；AAU00066.1.野茄果；ABC74798.1、ABC74797.1和ACB30364.1.辣椒；ACH63224.1.藏邊大黃；AII25439.1.鹽穗木；ADL09408.1.番紅花；ALO77720.1.百合雜交品種；AHG94653.1.岷江百合；ACG68733.1.小麥；AMQ67074.1.甘蔗雜交品種；AAW83208.1、AAW83207.1.高粱；AAL27005.1、AAL74406.1.水稻；ADA68331.1.玉米；RLN41266.1.黍；AJI77535.1.斑茅；AAL49994.1、AAL50001.1.西部白松；ADJ53040.1.松樹； ABA54791.1.白云杉；PaPR10.粗枝云杉；ABK21878.1.北美云杉；PNR42909.1、PNR51400.1.小立碗蘚

2.6 PaPR10基因的原核表達(dá)

使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶分別對帶有酶切位點的PaPR10基因片段和原核表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收后與T4DNA連接酶連接，將獲得的重組質(zhì)粒pET-32a-PaPR10轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，得到與目的基因大小一致的特異性條帶(圖8)，表明pET-32a-PaPR10表達(dá)載體的序列與目的基因序列一致。將構(gòu)建好的pET-32a-PaPR10表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，電泳結(jié)果表明，在500 bp左右位置處得到與目的基因大小一致的條帶(圖9)，經(jīng)公司測序分析后，驗證該序列正確，表明已成功將PaPR10基因連接到原核表達(dá)載體pET-32a上。

M. DL2000; 1. pET-32a-PaPR10-DH5α

M. DL2000; 1. pET32a-PaPR10

2.7 PaPR10蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

將IPTG設(shè)置為終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，在37 ℃下誘導(dǎo)3 h，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示(圖10，A)，不同IPTG濃度梯度均能誘導(dǎo)表達(dá)出一條約為30 kD的融合蛋白(含His-tag標(biāo)簽蛋白)，終濃度為0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)獲得的目的蛋白量最多，且對照組均無融合蛋白表達(dá)。因此，以終濃度為0.8 mmol/L的IPTG作為最優(yōu)誘導(dǎo)濃度進(jìn)行誘導(dǎo)時間的優(yōu)化。

誘導(dǎo)時間的優(yōu)化結(jié)果。以終濃度為0.8 mmol/L的IPTG在37 ℃下誘導(dǎo)2、4、6、8和10 h，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示(圖10，B)，不同誘導(dǎo)時間梯度均能誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，隨誘導(dǎo)時間的延長，目的蛋白的表達(dá)量也在逐漸增加，誘導(dǎo)10 h獲得的目的蛋白量最為豐富，且對照組均無融合蛋白表達(dá)。因此，以誘導(dǎo)10 h作為最優(yōu)誘導(dǎo)時間。

誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化結(jié)果。以終濃度為0.8 mmol/L的IPTG在20、25、30和37 ℃下誘導(dǎo)10 h，分別取上清和沉淀同時檢測表達(dá)的目的蛋白的可溶性。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示(圖10，C)，不同誘導(dǎo)溫度梯度均能誘導(dǎo)表達(dá)大量目的蛋白，在20 ℃下蛋白表達(dá)最為豐富，25 ℃下蛋白表達(dá)量次之，但二者差異不大。蛋白在上清和沉淀中均有明顯存在，以包涵體居多。選擇可溶性蛋白存在量最大的溫度作為最適誘導(dǎo)溫度，即30 ℃。因此，以終濃度為0.8 mmol/L的IPTG在30 ℃下誘導(dǎo)10 h為誘導(dǎo)重組蛋白的最優(yōu)條件。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；A.最適IPTG 誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化：1.未加IPTG誘導(dǎo)的pET-32a空載體；2.0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)pET-32a空載體；3—8. IPTG 誘導(dǎo)終濃度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol /L；B.最適誘導(dǎo)時間的優(yōu)化：1.0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)pET-32a空載體10 h；2.未加IPTG誘導(dǎo)的pET-32a空載體；3.未加IPTG誘導(dǎo)的菌液；4—8. 誘導(dǎo)2、4、6、8和10 h；C.最適誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化及蛋白可溶性檢測：1.誘導(dǎo)全菌液；2—5. 20、25、30和37 ℃誘導(dǎo)上清中蛋白表達(dá)；6—9. 20、25、30和37 ℃誘導(dǎo)沉淀中蛋白表達(dá)

2.8 PaPR10蛋白的純化及核酸酶活性檢測

以最優(yōu)誘導(dǎo)條件，即終濃度為0.8 mmol/L的IPTG在30 ℃下誘導(dǎo)10 h將重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白。SDS-PAGE檢測蛋白濃度，結(jié)果表明(圖11，A)，在30 kD左右處有條帶(含His-tag標(biāo)簽蛋白)，沒有出現(xiàn)雜帶，目的蛋白純度較高。將純化后的目的蛋白進(jìn)行核糖核酸酶(RNase)活性檢測。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖11，B)，PaPR10蛋白同對照一樣，對RNA降解作用不明顯，表明PaPR10蛋白基本不具備RNase活性。

A.SDS-PAGE凝膠檢測PaPR10純化蛋白：M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.PaPR10純化蛋白。B. PaPR10蛋白核酸酶活性分析：1. DEPC H2O；2. 蛋白非變性洗脫液液；3. RNA酶清除劑+PaPR10純化蛋白溶液；4. PaPR10純化蛋白溶液；5. RNA酶清除劑

3 討 論

西南亞高山針葉林和針闊葉混交林區(qū)，是中國第二大天然林區(qū)，組成了長江中上游地區(qū)重要的生態(tài)屏障[24]。作為西南亞高山針葉林區(qū)的主要造林樹種之一，云杉在涵養(yǎng)水源、土壤保育和生物多樣性維持等方面具有重要作用[18]。然而長期以來，云杉林遭受著不同病害威脅，主要包括云杉落針病、云杉銹病和云杉干基白腐病等，極大地威脅著西南及長江中上游地區(qū)的生態(tài)屏障建設(shè)[25-26]。因此，挖掘云杉抗病基因資源，培育抗病云杉品種，才能更為有效地抵御不同病害的侵?jǐn)_。本研究從粗枝云杉中首次克隆得到一個響應(yīng)云杉落針病菌(Lophodermiumpiceae)侵染而顯著上調(diào)的病程相關(guān)蛋白，即第10家族基因PaPR10，對其氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PaPR10蛋白是一類分子量約為16.5 kD、酸性、不含跨膜區(qū)、無信號肽且與RNase同源的胞內(nèi)蛋白，屬于IPR類，符合PR10蛋白的基本特征。高效率的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)是闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的重要前提和基礎(chǔ)[22]，而IPTG濃度、溫度和誘導(dǎo)時間是影響原核表達(dá)的主要因素[4]。因此，本研究利用pET-32a原核表達(dá)載體進(jìn)行PaPR10蛋白表達(dá)，并對IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的濃度、時間和溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在30 ℃下利用0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)10 h能夠獲得較為理想的可溶性蛋白，為后續(xù)核糖核酸酶活性測定提供充足的蛋白底物[4,19,22]。

Liu等[14,27]收集大量的植物PR10蛋白并對其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)不同植物的PR10蛋白起源相同，多數(shù)植物PR10蛋白的氨基酸序列在進(jìn)化過程中是高度保守的。本研究對PaPR10蛋白和不同植物的65個PR10蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同樣也發(fā)現(xiàn)PR10蛋白在進(jìn)化中是相對保守的。另外，研究中還發(fā)現(xiàn)，PR10蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹主要有三大分支，包括雙子葉植物分支、單子葉植物分支和裸子植物與苔蘚植物聚為一支的分支，這與楊濤等[6]和Lebel等[28]的分析結(jié)果一致。從系統(tǒng)發(fā)育樹還可以看出，PaPR10蛋白歸屬于裸子植物分支，且與北美云杉PR10蛋白的親緣關(guān)系最近。不過，更有趣的是，PaPR10蛋白與更為低等的苔蘚植物的PR10蛋白的親緣關(guān)系比同科的海岸松、西部白松和白云杉PR10蛋白親緣關(guān)系更近。以上結(jié)果表明裸子植物的PR10蛋白在進(jìn)化中可能比被子植物更為緩慢。

生物信息學(xué)分析可知，PaPR10蛋白的C端含有保守序列(K-A-X-E-X-Y)，該序列被認(rèn)為是RNase催化作用的反應(yīng)位點，該保守序列中E、Y被認(rèn)為是影響RNase活性的最重要的兩個氨基酸殘基[27]。此外，PR10蛋白的P-Loop的保守結(jié)構(gòu)域(G-X-G-G-X-G)被認(rèn)為是核苷酸結(jié)合位點，其與PR10蛋白的RNase活性密切相關(guān)[29]。對于一些PR10蛋白，如辣椒CaPR10[30]、人參PgPR10[31]和麻風(fēng)樹JcPR-10a[23]等已確認(rèn)其P-Loop結(jié)構(gòu)域完整且具有RNase活性。然而，本實驗中，該結(jié)構(gòu)序列在PaPR10蛋白序列中改變?yōu)椋篏DGNVG，即第3個G堿基突變?yōu)榱薔堿基。對該蛋白的RNase活性進(jìn)一步測定后發(fā)現(xiàn)，該蛋白水解RNA的活性甚微，這與從亞洲棉[28]和馬鈴薯[32]中分離出的同樣存在P-Loop結(jié)構(gòu)堿基突變的PR10蛋白的RNase檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步說明了“P-Loop”結(jié)構(gòu)與RNase活性的相關(guān)性。另外，Liu等[14]對西部白松的PR10蛋白家族的14個成員進(jìn)行克隆表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該家族一員PmPR10-1.10蛋白雖具有完整的“P-Loop”結(jié)構(gòu)域，但卻不具有RNase活性。因此，推測“P-Loop”結(jié)構(gòu)不是決定PR10蛋白RNase活性的唯一因素，而其他影響因素還有待研究。P-Loop保守結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基的缺失、插入、突變可能會導(dǎo)致PR10在進(jìn)化過程中發(fā)生變異，形成新的催化位點，進(jìn)一步提高植物在脅迫條件下的生存能力[33]。但P-Loop保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的變化和作用，以及對RNase活性的影響還有待于今后進(jìn)一步研究。