郝利國(guó) 佟 旭 李國(guó)華 谷弘謙 李忠濤

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院分子影像學(xué)研究室 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

肺癌是人類發(fā)病率和死亡率都比較高的腫瘤疾病之一，其中早期肺腺癌診斷是最常見(jiàn)的一種肺癌臨床病理學(xué)診斷類型[1]。早期肺腺癌一般生長(zhǎng)緩慢，倍增持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可伴惡性血行細(xì)胞轉(zhuǎn)移,臨床診斷治療初期效果欠佳[2]。近年來(lái)，以早期肺腺癌患者相關(guān)病理分子腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)為治療目標(biāo)的分子檢測(cè)治療方式為早期肺腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、及惡性腫瘤早期監(jiān)測(cè)治療賦予了希望，研究發(fā)現(xiàn)早期惡性肺腺癌的相關(guān)病理因子分型在不同腫瘤發(fā)展周期階段之間存在異質(zhì)性，這對(duì)于早期肺腺癌的早期預(yù)防診斷治療具有重要指導(dǎo)意義[3-4]，而通過(guò)研究高能X射線誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞早衰，分析其分子層面的早衰機(jī)制，將為臨床診治肺癌提供啟示性方向。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌腫瘤A549細(xì)胞；新型人源性肺癌腫瘤h1299細(xì)胞；細(xì)胞在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，連續(xù)進(jìn)行低溫培養(yǎng)，所有試劑均用去離子水配置。

1.1.2 主要儀器設(shè)備：激光粒度定量測(cè)定儀；透射電子顯微鏡；細(xì)胞培養(yǎng)箱；低速臺(tái)式細(xì)胞離心機(jī)；智能熒光酶標(biāo)倒置電子顯微鏡；多功能熒光酶標(biāo)儀

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

取兩個(gè)細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞H1299和細(xì)胞A549細(xì)胞,使用直線加速器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直線照射,SSD=100cm,細(xì)胞吸收的高能量照射濃度為10mV。A549細(xì)胞為貼壁細(xì)胞,瓶底中心點(diǎn)和細(xì)胞中心點(diǎn)吸收劑量分別為0gy、2gy、4gy以及8gy，分為兩個(gè)單數(shù)對(duì)照組和一個(gè)對(duì)照組。每組以105/ml板平鋪于6孔板中，每孔分別加入2ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)照組不需要做染色處理，AG490組分別加入終止總濃度為20μm/ml的AG490抑制藥試劑，RAPA組分別加入終止總濃度為1μm/ml的RAPA抑制藥試劑，于24h、48h及72h分別進(jìn)行兩組β-半胱葡乳糖酸染色計(jì)數(shù)；同時(shí)將4gy組進(jìn)行同劑量照射的3組細(xì)胞提取受體細(xì)胞,4gy組、4gy+AG490組分別進(jìn)行加入終止總藥物濃度為20μm/ml的AG490抑制性抗藥照射試劑、4gy+RAPA組分別進(jìn)行加入終止總藥物濃度為1μm/ml的抑制性抗藥照射試劑，對(duì)照組提取細(xì)胞；0gy組進(jìn)行相同劑量進(jìn)行照射，于72h收取進(jìn)行提取受體細(xì)胞，兩組細(xì)胞提取受體細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，均可應(yīng)用于自體免疫細(xì)胞蛋白質(zhì)和自體免疫細(xì)胞中的印跡特征染色抑制實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞衰老率檢測(cè)

將H1299和A549細(xì)胞培養(yǎng)溶液均勻鋪于24孔板中，加入250μl的β半胱葡乳糖酸核苷酶溶液作為下次染色固定液，室溫固定30min后加入250μl重的染色細(xì)胞工作液，避免反光用白色保鮮膜緊緊封住24孔板隙以防止溶液蒸發(fā)。37℃在保溫箱染色孵育細(xì)胞過(guò)夜后，加入0.5ml的染色PBS，普通的熒光學(xué)者在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)其對(duì)β半胱葡乳糖酸核苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞的染色百分比。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

H1299和細(xì)胞A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后,以106/ml培養(yǎng)方式將其種植于6孔板中,每孔一次后再加入2ml的細(xì)胞培養(yǎng)液,待每次加入后的培養(yǎng)細(xì)胞融合度70%時(shí),進(jìn)行質(zhì)粒蛋白細(xì)胞進(jìn)行遷移接受轉(zhuǎn)移感染,用于檢測(cè)細(xì)胞免疫蛋白表達(dá)，以及檢測(cè)質(zhì)粒細(xì)胞血球蛋白免疫細(xì)胞表達(dá)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡

細(xì)胞中的主要細(xì)胞裂解蛋白上清裂解液主要提取裂解于原細(xì)胞中的H1299和次要裂解細(xì)胞A549細(xì)胞，加入乙酰氨基酸二磷酸酶催化裂解反應(yīng)抑制劑，及其他細(xì)胞上清蛋白酶催化裂解反應(yīng)抑制液試劑，5%濃度室溫分離脫脂奶粉成膜采用濃度室溫高壓加熱方式封閉60min,使用多維激光濃度增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光成像掃描儀方法即可進(jìn)行圖像顯色，以βactina作為主要成像內(nèi)參,imageoc圖像濃度分析效果圖本應(yīng)用軟件進(jìn)行圖像濃度分析主要研究目的也就是測(cè)定血蛋白的各種生物化學(xué)表達(dá)以及濃度測(cè)定水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用兩組差異樣本配對(duì)，比較方法采用t方法進(jìn)行配對(duì)檢驗(yàn),以差異配對(duì)結(jié)果p<0.05為結(jié)果計(jì)算出的差異配對(duì)值具有效的結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)和現(xiàn)實(shí)意義。

2 結(jié)果

加入新的STAT3磷酸化物作為抑制劑后，以及加入AG490同樣均可顯著有效上調(diào)抑制腫瘤細(xì)胞H1299和A549細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)晚期早衰，加入STAT3可顯著抑制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)H1299和其在新的A549細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)早衰。高能活性x光激光細(xì)胞照射在癌細(xì)胞中均可顯著有效抑制上調(diào)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；AG490和新的原有rapa同樣顯著有效抑制了高能活性使用x射線光電子輻射線微波激光細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞H1299和其在新的A549細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)早衰。(如圖1)

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中STAT3、53和P16的表達(dá)情況

成功建立以STAT3為把靶點(diǎn)的探針，分別稱取50mg、100mg、150mg、200mg樣品配制成不同濃度的溶液,置于5ml離心管內(nèi)，靜止72h無(wú)渾濁、分層現(xiàn)象。探針的尺寸分布較窄,表明粒徑分布較為統(tǒng)一(圖1)。

zeta電位穩(wěn)定性良好，隨著成像探針的輻射濃度的逐漸升高，T1信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(如圖2)。靶向?qū)嶒?yàn)結(jié)果良好，探針對(duì)于腫瘤的檢出率高達(dá)90%，且隨STAT3表達(dá)的增加而增加,可以有效實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷。

注：左圖為不同濃度下的探針T1WI成像圖像

注：左圖為探針粒徑分布直方圖

3 討論

STAT3因子是一種介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間遺傳信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子，參與腫瘤細(xì)胞基質(zhì)分化、免疫代謝應(yīng)答、胚胎生長(zhǎng)發(fā)育等多種細(xì)胞生理活化過(guò)程[5]。近年來(lái),大量臨床研究成果顯示,STAT3在多種惡性腫瘤中異常轉(zhuǎn)錄活化，并與惡性腫瘤上皮細(xì)胞的異常增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)生理行為緊密密切相關(guān)[6]。衰老是阻止癌細(xì)胞增殖的腫瘤抑制機(jī)制，氧化損傷、端粒功能障礙、電離輻射引起的DNA損傷反應(yīng)和化療藥物都可引起不可逆的細(xì)胞衰老 。2015年science的一百多篇文章 分別提出目前已知的肺癌細(xì)胞周期早衰相關(guān)通路主要有三條,分別由三條p16、p53、p62介導(dǎo),其中p16、p53通過(guò)誘導(dǎo)影響細(xì)胞周期早衰停滯進(jìn)而誘導(dǎo)引起其他細(xì)胞周期早衰，基于上述相關(guān)研究結(jié)果，提示我們?cè)谑褂脁和放射線因子誘導(dǎo)治療肺腺癌后的細(xì)胞周期早衰中，STAT3和放射線因子誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞周期早衰相關(guān)通路最有可能為三條STAT3-cav1-p53、STAT3-p16等而關(guān)鍵因子為STAT3 。此外，STAT3還與腫瘤細(xì)胞的輻射抗性有關(guān)，抑制STAT3表達(dá)能使一些腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性增強(qiáng) 。其中基于STAT3的介導(dǎo)抗藥性凋亡基因機(jī)制可能是通過(guò)輻射后導(dǎo)致A549細(xì)胞內(nèi)在放射線中抗性濃度增加的重要原因之一，但STAT3介導(dǎo)的輻射影響導(dǎo)致A549細(xì)胞通過(guò)輻射產(chǎn)生抗性的基因機(jī)制目前還不明確。

本文的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)新的STAT3參與H1299和A549細(xì)胞慢性早衰的正常調(diào)控，高能量的x射線細(xì)胞照射技術(shù)可通過(guò)細(xì)胞激活新的STAT3，誘導(dǎo)舊的H1299和新的A549細(xì)胞從而發(fā)生慢性早衰。成功建立以STAT3為把靶點(diǎn)的探針,可以有效實(shí)現(xiàn)肺腺癌的早期診斷。

肺癌前期檢查無(wú)明顯的臨床癥狀，進(jìn)展迅速，因而早期手術(shù)率和切除率低。此外，術(shù)后的局部細(xì)胞復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處細(xì)胞轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其臨床療效不佳，阻斷性的STAT3信號(hào)分子通路發(fā)展可以顯著用于改善惡性胰腺癌腫瘤細(xì)胞的早期生物學(xué)分化行為，因此阻斷STAT3信號(hào)分子通路可能發(fā)展成為目前治療惡性胰腺癌的重要藥物治療方式 。綜上所述，對(duì)Jak/STAT3信號(hào)分子通路技術(shù)進(jìn)行更深入的科學(xué)研究，能夠?yàn)榇龠M(jìn)胰腺癌的早期治療發(fā)展提供新的治療方法。電離輻射因素會(huì)誘發(fā)一些患早期肺癌的干擾體細(xì)胞發(fā)生慢性晚期早熟衰老[13]。但目前的一些臨床醫(yī)學(xué)研究?jī)H限于分別揭示肺癌細(xì)胞慢性早衰現(xiàn)象，而對(duì)其更上游的與慢性早期放射性干細(xì)胞功能損傷早期肺癌細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)密切的相關(guān)聯(lián)的肺癌細(xì)胞基質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制，以及下游的被細(xì)胞激活后的早衰肺癌細(xì)胞對(duì)該蛋白的受體調(diào)節(jié)反應(yīng)機(jī)制研究較少。這也是我們下一步的醫(yī)學(xué)臨床研究中的重點(diǎn)。