孟 鑫 郝利國 谷弘謙 孟凡盛 趙添羽 李金森 王樹鵬 李麗娜

(1 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院MR室 黑龍江 齊齊哈爾 161006 2 齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)學院分子影像學研究室 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

前言

分子影像學[1]是以遺傳學、生物化學、細胞生物學為基礎，從分子水平上對生物體的多種生命現(xiàn)象進行解釋，研究生物大分子之間相互關(guān)系和作用的一門學科[2,3]。近年來隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，實現(xiàn)在分子水平上對腫瘤進行早期的無創(chuàng)檢查成為了可能。納米技術(shù)是指研究顆粒直徑在1-100nm范圍內(nèi)的材料分子[4,5]，實驗人員通過對單個原子、分子或分子基團等納米材料的重新排列組合，從而實現(xiàn)獲得新材料。本實驗成功構(gòu)建cRGD-Gd-Cy7-TPP探針，并實現(xiàn)了基于胰腺癌侵襲新生血管-血管整合素αvβ3的示蹤顯像，綜合報道如下。

1 資料與方法

1.1.1 一般資料

由齊齊哈爾醫(yī)學院動物中心提供SD大鼠30只，成功制備惡性占位模型 (胰腺癌) 30只，模型制備部分在齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學影像與生物醫(yī)學工程實驗室完成。MR分子成像部分在齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院MR室進行，設備為美國GE 750 3.0TMR。

1.1.2 儀器

儀器型號激光粒度測定儀Nicomp380ZLS,美國PSS透射電子顯微鏡HT-7700,日本日立粒度分析儀NICOMP-380ZLS,美國PSS核磁共振造影劑弛豫率分析成像系統(tǒng)EDUMR20-015V,蘇州紐邁電感耦合等離子體質(zhì)譜-質(zhì)譜儀ICP-MS,Agilent 770s,美國超純水系統(tǒng)Millipore Synergy,密斯博熒光倒置顯微鏡AXIO OBSERVER,德國

1.2 研究方法

1.2.1 cRGD-Gd-Cy7-TPP分子探針的合成

使用水域共熱法制備載GaCL3的脂質(zhì)體，為了得到雙模態(tài)納米分子探針cRGD-Gd-Cy7，我們繼續(xù)采用薄膜分散法在其表面負載RGD環(huán)肽和熒光Cy7分子；選取卟啉類第二代光敏劑TPP，與cRGD-Gd-Cy7偶聯(lián)為cRGD-Gd-Cy7-TPP，構(gòu)建診療一體化αVβ3分子探針；

1.2.2 探針表征

通過透射電子顯微鏡檢測該分子探針的粒徑，利用動態(tài)光散射法檢測其水合粒徑及zeta電位，多功能酶標儀檢測熒光耦合效應，通過熒光倒置顯微鏡和磁共振設備檢測熒光特性及磁共振成像能力，將不同濃度的探針混合瓊脂糖后重懸裝入EP管，運用熒光成像系統(tǒng)及3.0TMR成像系統(tǒng)觀察EP管中cRGD-Gd-Cy7-TPP熒光及磁共振成像能力；對EP管內(nèi)的探針行T1WI序列掃描，獲得T1弛豫時間并計算得T1弛豫率。

1.2.3 細胞毒性檢驗

取正處于對數(shù)生長期的AsPc-1細胞進行CCK8增殖實驗。將細胞胰酶消化后制成細胞懸液，并進行細胞計數(shù)，以1x103/孔的密度接種于96孔板，每組設置6個副孔，加入完全培養(yǎng)基200ml，在副孔周圍加入適量PBS，減少培養(yǎng)基的蒸發(fā)。培養(yǎng)1d、3d、5 d、7 d、9 d后，吸取原培養(yǎng)基，在每個孔中加入配置好的含10% CCK8的培養(yǎng)基，避光，置于37°C培養(yǎng)箱，2h后終止培養(yǎng)。用酶標儀檢測在450 nm波長處的每個孔的吸光度值。實驗重復3次。

1.2.4 cRGD-Gd-Cy7-TPP靶向性檢驗

運用激光共聚焦顯微鏡驗證cRGD-Gd-Cy7-TPP的體外細胞靶向性：將PANC-1、BxPC-3細胞株與分子探針共同孵育，洗去多余探針后觀察熒光分布特點并與細胞免疫熒光結(jié)果比較。

將荷瘤鼠隨機分為靶向組及非靶向組，給靶向組荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射RGD-Gd-Cy7-TPP以及給非靶向組經(jīng)尾靜脈注射Gd-DTPA；分別于注射前及注射后1、3、6、24h在3.0T MRI下行T1加權(quán)成像，在獲得的圖像上，將腫瘤及其相鄰的正常組織作為感興趣區(qū)域(ROI)測量信號強度，計算靶向組和非靶向組的磁共振圖像的SNR，并利用軟件比較兩組圖像的SNR；

將荷瘤鼠隨機分為靶向組及封閉組，靶向組大鼠經(jīng)尾靜脈注射cRGD-Gd-Cy7-TPP探針溶液，封閉組先經(jīng)尾靜脈注射過量游離cRGD多肽分子使整合素αVβ3結(jié)合位點封閉，等待5h后經(jīng)尾靜脈注射相同濃度探針溶液，分別在1h、2h、6h、12h、24h時間點進行活體熒光掃描，觀察兩組模型腫瘤部位探針濃聚差異；隨后處死大鼠模型并切取腫瘤組織切片，使用組織免疫熒光法染色，從細胞組織學角度驗證cRGD-Gd-Cy7-TPP對整合素αVβ3的靶向性。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS20.0(美國芝加哥SPSS Inc.)統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，兩組比較采用獨立樣本，每個處理組均與對照組進行比較，采用配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

成功合成了探針cRGD-Gd-Cy7-TPP，分別稱取50mg、100mg、150mg、200mg樣品配制成不同濃度的cRGD-Gd-Cy7-TPP溶液，置于EP管內(nèi)，靜止72h無沉著、分層現(xiàn)象。動態(tài)光散射法顯示探針的尺寸分布較窄，表明粒徑分布較為統(tǒng)一(圖1)；zeta電位較小穩(wěn)定性良好。透射電鏡TEM圖像顯示：單個cRGD-Gd-Cy7-TPP納米顆粒呈圓球形結(jié)構(gòu)，由于顆粒的性質(zhì)，小部分有聚集現(xiàn)象，粒徑分布較為良好。

圖1 動態(tài)光散射法粒徑分布圖 圖3 CCK-8的腫瘤細胞活性檢驗

實驗使用西門子3.0T磁共振掃描儀進行T1WI磁共振成像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著cRGD-Gd-Cy7-TPP納米顆粒的濃度的升高，T1信號強度逐漸增強(如圖2)。靶向?qū)嶒灲Y(jié)果良好，探針cRGD-Gd-Cy7-TPP對于腫瘤的檢出率高達90%。

圖2 不同濃度的cRGD-Gd-Cy7-TPP的T1WI圖像

3 討論

高軟組織分辨率、無電離輻射和無穿透深度限制等特點使磁共振成像(MRI)成為了監(jiān)測腫瘤的最強有力的分子影像學診斷工具之一。近年來為了提高MRI檢查的靈敏度，在磁共振成像中對納米材料的磁共振對比劑的研究越來越深入[6]。目前臨床應用最為廣泛的T1對比劑Gd-DTPA是由德國Schefing公司主導研發(fā)的[7]。最具代表性的T2增強對比劑是超順磁性氧化鐵納米顆粒(Superparamagnetic Iron Oxide)，商品名稱為菲力磁，肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的單核吞噬細胞(kupffer)在其進入血液循環(huán)后迅速將其吞噬[8]。帶有靶向功能的Gd分子探針在應用于MRI時有對比度更佳、選擇性富集靶器官和組織、高組織選擇性和組織特異性、體內(nèi)持續(xù)適當?shù)臅r間(避免了在肝臟中的網(wǎng)狀細胞很容易吞噬超順磁性氧化鐵納米顆粒從而排出體外的情況)等技術(shù)優(yōu)勢。

外科醫(yī)生利用熒光顯像實現(xiàn)手術(shù)的可視化多虧了近紅外熒光成像技術(shù)的作用，并相對準確的描繪腫瘤輪廓和切除腫瘤。近紅外熒光成像具有高靈敏度的特點，但是其探測效果受組織深度影響較大[9]。目前，分子成像領(lǐng)域的三大主要技術(shù)磁共振成像、化學發(fā)光法和放射性核素成像[10]。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤新生血管起到了重要作用在腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的過程中，學者們經(jīng)過更深入研究發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤組織中整合素αVβ3均有高表達，且整合素αVβ3表達量與腫瘤新生血管的形成成正相關(guān)，介導了腫瘤的侵襲及遠處轉(zhuǎn)移[11]。首先，由于整合素αVβ3的引導作用使得金屬蛋白酶2及纖維溶蛋白酶大量聚集并激活，破壞了血管基底膜，腫瘤細胞得以遷徙。有研究表明:腫瘤新生血管的未形成使得瘤體大小只能局限在數(shù)毫米的范圍內(nèi)[12]。同時，整合素αVβ3的粘附作用可以加速血管內(nèi)皮細胞的運動，加快了腫瘤新生血管的生成速率。血管的生成與血管生長因子的分泌密切相關(guān)，整合素αVβ3與多種生長因子緊密相關(guān)已經(jīng)被多項研究證明[13]。其中研究最為廣泛的一種生長因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，其在新生血管生成過程中起到了決定性作用。有學者在針對膠質(zhì)母細胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細胞瘤新生血管生成過程中，一方面檢測到了內(nèi)皮生長因子在血管內(nèi)表達的增高，同時在另一方面也檢測到了整合素αVβ3表達的增高[14]；當研究人員抑制血管內(nèi)皮生長因子表達時，整合素αVβ3的表達水平也同樣受到了抑制 。通過激活非配體依賴的血管內(nèi)皮生長因子信號通路，整合素αVβ3主管可以調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，即使在使用外源性血管生成抑制劑時，整合素αVβ3分子仍能夠發(fā)揮促進腫瘤新生血管的形成作用 。

整合素αVβ3在整合素有著重要地位，其在腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表面高度表達，而且在多種腫瘤細胞表面均有高度表達，但在普通上皮細胞和成熟血管內(nèi)皮細胞表面卻不表達或呈低水平表達的。αvβ6整合素的表達與根植于或與轉(zhuǎn)化生長因子β信號改變相關(guān)的疾病密切相關(guān)。這也是本課題組以后研究項目的重點。

本課題實驗利用新型的納米技術(shù)和生物化學技術(shù)可以實現(xiàn)靶向組件和信號組件的偶聯(lián)，從而實現(xiàn)αVβ3的特異性顯像。本課題實驗采取多模態(tài)相互融合的醫(yī)學影像分子影像技術(shù)，開創(chuàng)性的研發(fā)了一種整合素αVβ3靶向的磁共振/熒光雙模態(tài)分子探針。該分子探針既可以實現(xiàn)在宏觀方面實現(xiàn)對腫瘤解剖層面的精準檢測，同時又可以在分子代謝層面對腫瘤的診斷，治療以及預后進行判斷，為胰腺癌αVβ3表達水平的精準檢測提供一種極為方便的實時動態(tài)觀測的手段。