張 瑜，呂小燕

（山西省中醫(yī)院，山西 太原 030012）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥疾病，主要臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量下降、嘔吐腹瀉、黏液便血等[1]。UC的發(fā)病機制暫不明確，大量研究認(rèn)為是由感染、免疫及遺傳等多種因素引起腸黏膜屏障功能受損，造成潰瘍[2]，且黏膜損傷不易治愈，反復(fù)發(fā)作，給人們?nèi)粘Ｉ钆c健康帶來了嚴(yán)重威脅[3]。目前臨床上治療UC多使用糖皮質(zhì)激素類生物制劑，雖然這類藥物治療UC效果顯著，但其不良反應(yīng)大且復(fù)發(fā)率較高[4]。研究表明，中醫(yī)藥可以修復(fù)受損腸黏膜[5-6]。蒼耳亭是存在于多刺菊科蒼耳屬植物的一種倍半萜內(nèi)酯化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗?jié)兊淖饔肹7]。MAPK家族成員細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）參與調(diào)控機體炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)激等多種病理過程，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化[8]。本研究通過建立UC大鼠模型，探究蒼耳亭對UC大鼠腸道黏膜的保護作用以及對ERK/JNK信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量200～220 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2019-0003。實驗過程符合“3R”原則，并得到動物倫理委員會批準(zhǔn)，動物倫理審查號：AWE-2019-004。實驗前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境條件為溫度22～25 ℃，相對濕度40%～50%，晝夜時長12 h:12 h。

1.2 藥物與試劑 2,4,6-三硝基甲苯磺酸（TNBS）（批號：146817）購自臨沂艾科化學(xué)試劑有限公司；柳氮磺胺吡啶（批號：S0883）購自美國Sigma公司；蒼耳亭（批號：C-033）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；IL-6檢測試劑盒（批號：SNDR734）、TNF-α檢測試劑盒（批號：SND-R635）、IL-10檢測試劑盒（批號：SND-R793）均購自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司；咬合蛋白（Occludin）（批號：91131S）、緊密連接蛋白1（Claudin-1）（批號：4933S）、Caspase-3（批號：9662S）、p-ERK抗體（批號：5726S）、ERK抗體（批號：4696S）、p-JNK抗體（批號：4668S）、JNK抗體（批號：9252S）、羊抗兔二抗（批號：7074S）、羊抗小鼠二抗（批號：7076S）均購自美國CST公司；HE染色試劑盒（批號：G1120）、DAB顯色試劑盒（批號：DA1016）、高效RIPA裂解液（批號：R0010）、BCA蛋白檢測試劑盒（批號：PC0020）、ECL發(fā)光試劑盒（批號：SW2040）均購自北京索萊寶生物技術(shù)公司。

1.3 主要儀器 Contour Elite三維光學(xué)顯微鏡（美國布魯克公司）；JXFSTPRP-24/32全自動樣品快速研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；Mini P-4小型垂直電泳系統(tǒng)（北京凱元信瑞儀器有限公司）；SIM凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Best公司）。

1.4 模型建立與分組 90只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽性藥物組、蒼耳亭低劑量組、蒼耳亭中劑量組、蒼耳亭高劑量組，每組15只。參照文獻(xiàn)[9]建立大鼠UC模型：采用5%TNBS與50%乙醇等比例混合配制造模劑混合液。6組大鼠禁食不禁水36 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，采用灌胃針從大鼠肛門插入約8 cm，正常組大鼠給予生理鹽水1 mL，其余5組大鼠給予造模劑1 mL。造模完成后，觀察大鼠狀態(tài)變化，出現(xiàn)血便、消瘦、少食、精神沉郁、反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，提示造模成功[10]。

1.5 實驗給藥 造模成功后24 h進(jìn)行給藥，陽性藥物組大鼠灌胃給予柳氮磺胺吡啶溶液，300 mg/kg[11]；根據(jù)《實驗動物和動物實驗技術(shù)》進(jìn)行給藥量計算，參照大鼠與人體表面積等效劑量比值折算，蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予蒼耳亭溶液100、200、400 mg/kg，正常組與模型組大鼠給予等體積蒸餾水。1次/d，2 mL/次，連續(xù)給藥2周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 疾病活動指數(shù)（disease activity index,DAI）與結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosa damage index,CMDI）的評估 記錄各組大鼠排出的糞便性狀、便血情況和體質(zhì)量變化，取3項得分的平均數(shù)作為DAI評分。治療結(jié)束后處死大鼠，取出完整結(jié)腸，進(jìn)行CMDI評分。DAI與CMDI評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI 與CMDI 評分標(biāo)準(zhǔn)[12-13]

1.6.2 HE染色觀察大鼠結(jié)腸黏膜病理變化 評分結(jié)束后清洗結(jié)腸黏膜組織，每組隨機取5只大鼠結(jié)腸黏膜組織置于多聚甲醛中固定，制備常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜病理變化。

1.6.3 ELISA法檢測結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α、IL-10含量 評分結(jié)束后，每組隨機取5只大鼠結(jié)腸黏膜組織，按照與PBS溶液1∶9的比例，進(jìn)行勻漿，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α、IL-10含量。

1.6.4 免疫組化檢測結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1、Caspase-3蛋白表達(dá) 取制備好的大鼠結(jié)腸黏膜組織切片，進(jìn)行脫蠟水合，采用枸櫞酸溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，H2O2孵育后，加入山羊血清封閉，清洗后加入Occludin、Claudin-1、Caspase-3一抗，4 ℃孵育，次日加入二抗，室溫孵育，采用DAB法顯色，再進(jìn)行沖洗，蘇木精復(fù)染，封片，顯微鏡下拍照，采用Image 7.0圖像分析軟件測定Occludin、Claudin-1、Caspase-3積分光密度值。

1.6.5 Western blotting法檢測ERK/JNK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取剩余大鼠結(jié)腸黏膜組織，加入蛋白裂解液，勻漿后提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入稀釋好的p-ERK、ERK、p-JNK、JNK一抗，4 ℃孵育過夜，加入稀釋好的二抗，室溫孵育1.5 h，采用ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像并分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算p-ERK/ERK、p-JNK/JNK。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠DAI與CMDI評分比較 與正常組比較，模型組大鼠DAI與CMDI評分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組與蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠DAI與CMDI評分均明顯降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，蒼耳亭低、中劑量組大鼠DAI與CMDI評分均明顯升高（P＜0.05）；蒼耳亭高劑量組大鼠DAI與CMDI評分與陽性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。蒼耳亭各劑量組間存在劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠DAI 與CMDI 評分比較（）

表2 各組大鼠DAI 與CMDI 評分比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05；與蒼耳亭低劑量組比較，dP＜0.05；與蒼耳亭中劑量組比較，eP＜0.05

2.2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理變化 正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮組織整齊，細(xì)胞排列密集，可見杯狀隱窩，無病變；模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見隱窩消失，大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層也出現(xiàn)炎癥現(xiàn)象；蒼耳亭低劑量組大鼠結(jié)腸黏膜上皮組織仍可見一些炎癥細(xì)胞浸潤，未見隱窩；蒼耳亭中劑量組大鼠結(jié)腸黏膜病變情況減輕，可見隱窩結(jié)構(gòu)，少量炎癥細(xì)胞浸潤；蒼耳亭高劑量組與陽性藥物組大鼠結(jié)腸黏膜組織逐漸趨于正常，可見明顯隱窩，未見炎癥細(xì)胞浸潤。（見圖1）

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜病理切片圖（HE，×200）

2.3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α、IL-10含量比較 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α含量均明顯升高（P＜0.05），IL-10含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α含量均明顯降低（P＜0.05），IL-10含量明顯升高（P＜0.05），且蒼耳亭各劑量組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，蒼耳亭低、中劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α含量均明顯升高（P＜0.05），IL-10含量明顯降低（P＜0.05）；蒼耳亭高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α、IL-10含量與陽性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α、IL-10含量比較（）

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-6、TNF-α、IL-10含量比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05；與蒼耳亭低劑量組比較，dP＜0.05；與蒼耳亭中劑量組比較，eP＜0.05

2.4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1、Caspase-3表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1表達(dá)明顯降低（P＜0.05），Caspase-3表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和蒼耳亭低、中高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1表達(dá)明顯升高（P＜0.05），Caspase-3表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，蒼耳亭低、中劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1表達(dá)明顯降低（P＜0.05），Caspase-3表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；蒼耳亭高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1、Caspase-3表達(dá)與陽性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。蒼耳亭各劑量組間大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1、Caspase-3表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖2、表4）

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1、Caspase-3 的表達(dá)情況（免疫組化，×400）

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1、Caspase-3 表達(dá)水平比較（）

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Occludin、Claudin-1、Caspase-3 表達(dá)水平比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05；與蒼耳亭低劑量組比較，dP＜0.05；與蒼耳亭中劑量組比較，eP＜0.05

2.5 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中ERK/JNK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK均明顯降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，蒼耳亭低、中劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK均明顯升高（P＜0.05）；蒼耳亭高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK與陽性藥物組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；蒼耳亭各劑量組間結(jié)腸黏膜組織p-ERK/ERK、p-JNK/JNK比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖3、表5）

圖3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表5 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 的比較（）

表5 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 的比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05；與蒼耳亭低劑量組比較，dP＜0.05；與蒼耳亭中劑量組比較，eP＜0.05

3 討論

UC是一種嚴(yán)重的腸道炎癥性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，以結(jié)腸黏膜充血、糜爛為主要病理特征[14]。研究[15-16]證實UC的發(fā)生與免疫應(yīng)答紊亂、炎癥反應(yīng)以及腸道黏膜屏障受損有關(guān)。研究[17]表明，UC發(fā)生時，結(jié)腸黏膜組織中炎癥反應(yīng)被持續(xù)激活，大量炎癥因子如TNF-α、IL-18等分泌，引起腸道黏膜屏障功能被破壞，腸黏膜組織受損。Claudin-1蛋白是一種緊密連接蛋白，能夠維護結(jié)腸黏膜屏障的完整性和通透性[18]。Occludin蛋白是緊密連接中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與緊密連接信號調(diào)節(jié)[19]。研究[20]表明，Occludin、Claudin-1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜組織通透性增加，結(jié)腸黏膜屏障功能受阻，導(dǎo)致UC發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，UC模型大鼠DAI與CMDI評分均明顯升高，結(jié)腸黏膜組織病變嚴(yán)重，結(jié)腸黏膜組織中炎癥因子IL-6、TNF-α含量明顯升高，IL-10含量明顯降低，且Occludin、Claudin-1表達(dá)明顯下調(diào)，提示結(jié)腸黏膜組織中炎癥反應(yīng)被激活，結(jié)腸黏膜屏障功能被破壞，結(jié)腸黏膜組織受損，提示UC模型建立成功。

蒼耳亭作為一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[21]。有研究[22]表明，蒼耳亭能夠通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡起到抗腫瘤的作用。本研究結(jié)果表明，低、中、高劑量蒼耳亭干預(yù)后的UC大鼠結(jié)腸黏膜組織中炎癥因子IL-6、TNF-α含量均明顯降低，IL-10含量明顯升高，Occludin、Claudin-1表達(dá)明顯上調(diào)，結(jié)腸黏膜組織損傷減輕，提示蒼耳亭能夠減輕炎癥反應(yīng)，對UC大鼠結(jié)腸黏膜屏障功能和組織損傷具有保護作用。

ERK、JNK是絲氨酸蛋白酶家族的兩種代表性蛋白酶，可參與腸道損傷，介導(dǎo)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、蛋白的表達(dá)[23-24]。ERK、JNK在UC的發(fā)生中參與炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞中分泌的促炎因子能夠激活JNK參與炎癥反應(yīng)[25]。ERK受到炎癥因子刺激被激活，磷酸化的ERK參與調(diào)節(jié)細(xì)胞纖維化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。使用藥物干預(yù)后，ERK/JNK信號通路被抑制，能夠有效緩解DSS誘導(dǎo)的UC小鼠炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡[27]。本研究結(jié)果顯示，UC大鼠結(jié)腸黏膜組織中Caspase-3表達(dá)與p-ERK/ERK、p-JNK/JNK上調(diào)，提示結(jié)腸黏膜組織中細(xì)胞凋亡增加，ERK/JNK信號通路被激活。而蒼耳亭干預(yù)后的UC大鼠結(jié)腸黏膜組織中Caspase-3表達(dá)與p-ERK/ERK、p-JNK/JNK下調(diào)，提示蒼耳亭可能通過下調(diào)ERK、JNK磷酸化表達(dá)，抑制UC大鼠炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡，并上調(diào)Occludin、Claudin-1表達(dá)，改善結(jié)腸黏膜屏障功能，減輕UC大鼠結(jié)腸黏膜組織損傷。

綜上所述，蒼耳亭能夠下調(diào)UC大鼠促炎因子IL-6、TNF-α和Caspase-3的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)抑炎因子IL-10和Occludin、Claudin-1表達(dá)，改善結(jié)腸黏膜屏障功能，減輕結(jié)腸黏膜組織損傷，其機制可能與抑制ERK/JNK信號通路表達(dá)有關(guān)，這為中醫(yī)藥治療UC提供了新的理論依據(jù)。