翟潤，張海洋，厲冰，門中俊，劉赟，梅孝臣，侯瀟峰，孫萬日

南陽市中心醫(yī)院普通外科，河南 南陽 473000

肝癌是起源于肝臟上皮或間葉組織的惡性腫瘤，是中國乃至全球性高發(fā)疾病，據(jù)統(tǒng)計，2018年肝癌發(fā)病率為4.7%，居所有惡性腫瘤第7位，病死率為8.2%，僅次于肺癌和胃癌，嚴重威脅著全球居民的生命健康[1-3]。手術(shù)切除病灶是治療肝癌的主要手段，近年來肝切除術(shù)得到了較大發(fā)展，使眾多的患者從中獲益，然而由于多數(shù)肝癌患者確診較晚，術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)，較大比例的患者因術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良[4]。降低術(shù)后復(fù)發(fā)率、延長患者的生存期是包括肝癌在內(nèi)的所有惡性腫瘤治療的重心之一，為此臨床著重研究肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)標志物篩查[5]。其中跨膜蛋白（transmembrane protein，TMEM）家族是目前研究較多的生物標志物，與機體免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，該家族成員眾多，每個成員在腫瘤中功能作用各異，既往研究發(fā)現(xiàn)TMEM14A、TMEM48、TMEM106、TMEM206等對腫瘤的發(fā)展具有促進作用，TMEM7、TMEM25則發(fā)揮著抑癌作用，而TMEM97、TMEM176等具有異質(zhì)性作用，在不同的腫瘤中作用不同[6-7]。為此，本研究探討TMEM97表達情況與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年8月至2019年8月南陽市中心醫(yī)院收治的100例肝癌患者為研究對象。納入標準：①符合肝癌的診斷標準[8]，經(jīng)病理檢查確診為肝癌；②接受手術(shù)治療，且術(shù)前無其他部位轉(zhuǎn)移；③病理標本保存完好；④病歷資料完整。排除標準：①合并其他腫瘤；②非手術(shù)患者；③圍手術(shù)期死亡及非腫瘤復(fù)發(fā)死亡；④隨訪失訪。將100例肝癌患者按照術(shù)后是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組（n=37）和未復(fù)發(fā)組（n=63）。復(fù)發(fā)組中，男性24例，女性13例；年齡51～74歲，平均（62.35±6.24）歲；腫瘤直徑2～8 cm，平均（5.03±1.51）cm；病理類型均為肝細胞肝癌；分化程度：高分化8例，中分化10例，低分化19例；TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期23例。未復(fù)發(fā)組中，男性35例，女性28例；年齡52～73歲，平均（62.08±6.07）歲；腫瘤直徑 2～8 cm，平均（5.05±1.58）cm；病理類型均為肝細胞肝癌；分化程度：高分化34例，中分化24例，低分化5例；TNM分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期24例，Ⅲ期3例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

所有患者均接受手術(shù)切除治療，保存腫瘤組織標本。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測TMEM97表達情況。取患者適量病理組織標本，磷酸鹽緩沖液漂洗后放入勻漿器中冰上充分碾磨，加入組織裂解液后冰上作用20～30 min，吸取組織液4℃離心（12 000 r/min，離心15 min）后取上清蛋白樣品，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，使用5%脫脂奶粉和含0.05%Tween-20的TBS室溫下封閉1 h。加入兔抗人TMEM97單克隆抗體（稀釋濃度1∶100）與PVDF膜雜交，4℃過夜，加入二抗室溫反應(yīng)1 h。增強型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，使用Image J軟件分析條帶的灰度值，記錄TMEM97表達水平。

1.3 隨訪方法

術(shù)后第1年每3個月復(fù)查隨訪一次，其后每6個月復(fù)查隨訪一次，隨訪截至2021年4月，復(fù)查時行影像學(xué)檢查，觀察是否出現(xiàn)新的病灶，并對可疑病灶進行病理檢查，確認腫瘤是否復(fù)發(fā)。

1.4 資料收集與錄入

由南陽市中心醫(yī)院專業(yè)人員采集患者的基本信息和TMEM97檢測數(shù)據(jù)，采用雙人雙錄入的形式將采集的數(shù)據(jù)錄入系統(tǒng)，并對數(shù)據(jù)進行核對、修訂。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)性分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，分析TMEM97表達對腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測價值；采用Logistic回歸模型分析腫瘤復(fù)發(fā)的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM97表達水平的比較

復(fù)發(fā)組患者TMEM97表達水平為（1.97±0.50），高于未復(fù)發(fā)組患者的（1.43±0.38），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.084，P＜0.05）。

2.2 TMEM97表達與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，TMEM97表達與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)呈正相關(guān)（r=0.515，P＜0.05）。

2.3 TMEM97表達對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值分析

ROC曲線顯示，TMEM97表達預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的曲線下面積為 0.808（95%CI：0.717～0.898），最佳截斷值為1.770，靈敏度為0.676，特異度為0.841。（圖 1）

圖1 TMEM97表達預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

2.4 肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的單因素分析

單因素分析顯示，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)與分化程度、TNM分期和TMEM97表達情況可能有關(guān)（P＜0.01）。（表1）

表1 肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的單因素分析

2.5 肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的多因素分析

多因素分析顯示，低分化、TNM分期為Ⅲ期、TMEM97表達≥1.770均是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素（P＜0.05）。（表2）

表2 肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素的Logistic多因素回歸分析

2.6 各指標單獨及聯(lián)合檢測預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的效能分析

分化程度、TNM分期、TMEM97表達情況聯(lián)合檢測預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的靈敏度高于各指標單獨檢測，而特異度和準確度也較高，均在0.800以上。（表 3、表 4）

表3 分化程度、TNM分期、TMEM97表達情況單獨及聯(lián)合檢測預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)與病理結(jié)果的對照

表4 分化程度、TNM分期、TMEM97表達情況單獨及聯(lián)合檢測預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的效能

3 討論

近年來肝癌的發(fā)病率呈增高趨勢，外科手術(shù)切除和肝移植在肝癌的治療中取得了良好的效果，由于患者早期篩查意識不強，疾病確診較晚，因此目前臨床面臨著手術(shù)切除率低、術(shù)后復(fù)發(fā)率高等難點。有研究指出，即使行肝癌根治性切除，患者5年復(fù)發(fā)率也高達70%，因此術(shù)后患者多需要接受放化療、靶向治療等多種方案治療，以期降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，延長患者生存期[9-11]。針對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)進行危險因素篩查，有助于采取對應(yīng)的措施降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，既往研究多聚焦于病理類型、分期、包膜完整性、手術(shù)方式等，而隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，臨床已將腫瘤生物標志物納入肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的研究中，并取得了較大的進步[12-13]。TMEM是一類膜蛋白，分布于各種細胞和細胞器的包膜上，與其相關(guān)的離子通道、蛋白酶、酪氨酸激酶受體等是目前研究較充分的領(lǐng)域，證實其具有重要的調(diào)節(jié)和代謝作用，在細胞間及其與外界的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[14]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，TMEM與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系，其家族內(nèi)各成員存在著不同作用，其中TMEM97是一種異質(zhì)性膜蛋白，可調(diào)節(jié)機體細胞的形態(tài)、生長和分化，且在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用，其在非小細胞肺癌和乳腺癌中呈高表達，其表達下調(diào)可抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）、WNT/β連環(huán)蛋白信號通路，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；同時研究指出葡萄膜黑色素瘤中TMEM97可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和自噬，而選擇性TMEM97及其配體激動劑可抑制腫瘤細胞增殖，增強其他抗腫瘤藥物的作用[15-16]。郭玉霖等[17]研究表明，TMEM97在結(jié)腸癌組織中的表達高于癌旁組織、正常結(jié)腸組織，腫瘤侵犯的邊緣區(qū)域組織內(nèi)TMEM97表達高于病灶內(nèi)部區(qū)域，轉(zhuǎn)移性病灶中TMEM97表達高于原發(fā)病灶，且提示患者多預(yù)后較差，這充分說明TMEM97高表達是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的高風險因素。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌復(fù)發(fā)患者病灶組織中TMEM97呈高表達，且高于未復(fù)發(fā)患者，與術(shù)后復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，這說明其表達水平越高術(shù)后復(fù)發(fā)的風險越大。池閩輝等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TMEM97主要表達于肝癌細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，隨著其表達量增加，術(shù)后復(fù)發(fā)的相對危險度隨之增加，是術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的危險因素，且隨著術(shù)后復(fù)發(fā)時間的不同而存在差異。本研究行Logistic多因素回歸分析也發(fā)現(xiàn)TMEM97高表達是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素，這與其研究結(jié)果一致。由此可以明確TMEM97表達與肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)存在密切聯(lián)系，那么TMEM97高表達對術(shù)后復(fù)發(fā)是否具有一定的預(yù)測價值？本研究行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)曲線下面積為0.808，最佳截斷值為1.770，靈敏度為0.676，特異度為0.841，這提示TMEM97表達高于1.770時，術(shù)后復(fù)發(fā)的相對風險較高，臨床可針對此類患者給予重視和關(guān)注，通過采取合理措施給予治療，以降低其術(shù)后復(fù)發(fā)率。由于TMEM97診斷的靈敏度較低，可能會降低其在臨床診斷評估中的價值，為此本研究將分化程度、TNM分期和TMEM97表達聯(lián)合檢測，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的靈敏度為0.838，而特異度和準確度也均較高，說明在檢測TMEM97表達情況的同時聯(lián)合腫瘤的分化程度和TNM分期有助于提高肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值，減少錯誤評估的風險。對不同的分期間TMEM97表達是否存在診斷差異，本文未進行研究，以期在以后的研究中進行分析報道。

綜上所述，TMEM97在肝癌患者腫瘤組織中呈高表達，其表達水平與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)存在密切的關(guān)系，是術(shù)后復(fù)發(fā)的危險因素，其表達水平越高術(shù)后復(fù)發(fā)的相對風險也隨之增加。