司少艷，申玉龍，秦亞亞，吳瑩瑩，王宗燁，宋淑軍#

戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心1綜合基礎(chǔ)研究室，2放療科，北京 100101

肺癌目前是世界上也是中國腫瘤死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%以上[1]。目前肺癌的治療以綜合治療為主，其中放療是重要的治療手段之一。然而，射線殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，導(dǎo)致并發(fā)癥，此外，腫瘤細(xì)胞的放射抵抗或不敏感是影響放療效果的重要因素。因此，為了提高療效，減少并發(fā)癥及射線的抗性，開發(fā)具有放療增效作用的藥物，提高輻射對NSCLC細(xì)胞的毒性，減少不良反應(yīng)，增加放射敏感性，對改善腫瘤患者的臨床預(yù)后具有非常重要的意義。理想情況下，無毒而且能夠增強(qiáng)輻射對腫瘤細(xì)胞殺傷作用的化合物為首選，因此，無毒副作用的天然產(chǎn)物逐漸得到人們的關(guān)注。維生素是維持人體正常功能所必需的營養(yǎng)素，在新陳代謝過程中發(fā)揮著重要作用。維生素B6（vitamin B6，VB6）是一種水溶性維生素，由含有2-甲基-3-羥基吡啶結(jié)構(gòu)的6種化合物組成，分別為吡哆醇（PN）、吡哆胺（PM）、吡哆醛（PL）及磷酸化衍生物5'-磷酸吡哆醇（PNP）、5'-磷酸吡哆胺（PMP）和5'-磷酸吡哆醛（PLP），這6種化合物可相互轉(zhuǎn)換。PLP是VB6的活性形式，作為一種輔酶，在體內(nèi)參與160多種不同的生化反應(yīng)，對維持人體正常生理機(jī)能具有重要意義，VB6的缺乏或代謝異常與包括腫瘤在內(nèi)的多種臨床疾病有關(guān)[2]。越來越多的研究顯示，VB6缺乏與腫瘤之間存在一定的關(guān)聯(lián)，VB6攝入量和血液PLP水平與結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均呈負(fù)相關(guān)[3]。有學(xué)者報(bào)道，VB6攝入和高血漿PLP水平可以作為胰腺癌的保護(hù)因子[4]。VB6缺乏還與肺部腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[5]，膳食VB6可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，減少氧化應(yīng)激、一氧化氮生成和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡以及增強(qiáng)免疫反應(yīng)來抑制腫瘤的發(fā)生[6-7]。盡管關(guān)于VB6的抗腫瘤效應(yīng)的報(bào)道較多，但VB6是否具有放療增效以及增敏作用尚不清楚。本研究通過觀察VB6與X線聯(lián)合使用對肺癌A549細(xì)胞存活作用的影響，了解VB6與X線對NSCLC細(xì)胞的協(xié)同殺傷效應(yīng)及放療增效作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC細(xì)胞A549由美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫提供。RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國GE醫(yī)療生命科學(xué)公司，胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司，瑞氏-姬姆薩染液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。VB6購自河南潤弘制藥股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用改良的RPMI1640培養(yǎng)液，含有10%胎牛血清以及青霉素和鏈霉素各100 U/ml，在37℃、5% CO2空氣中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每2～3天換液一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞照射 采用AXESSE直線加速器，6 MV X線照射，照射源軸距為100 cm。單次照射劑量分別為0、2、4、6 Gy，劑量率為4 Gy/min。

1.2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞稀釋成單細(xì)胞懸液，然后接種于6孔板中，每孔200個(gè)細(xì)胞，待4～6 h細(xì)胞貼壁后，用含有不同濃度的VB6培養(yǎng)基處理細(xì)胞，分別設(shè)置為低濃度組（125 μg/ml）、中濃度組（250 μg/ml）、高濃度（500 μg/ml）以及對照組（0 μg/ml），藥物處理8天后，用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，瑞氏-姬姆薩染液進(jìn)行染色。部分細(xì)胞待VB（60、250 μg/ml）處理細(xì)胞1天后，進(jìn)行X線照射，然后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用含原相同濃度的VB6培養(yǎng)基每2～3天換液一次，藥物處理8天，于照射后第8天（照射后滿7天），將細(xì)胞固定并染色，然后在顯微鏡下觀察，對細(xì)胞克?。ā?0個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)）進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成效率和存活分?jǐn)?shù)，克隆形成效率=每孔的克隆數(shù)/每孔接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)=處理組的克隆數(shù)（/該組每孔接種細(xì)胞數(shù)×對照組的克隆形成效率）×100%。

1.2.4 藥物增敏作用 藥物的輻射增敏作用可以通過輻射增強(qiáng)比值（radiation enhancement ratio，RER）來判定。RER（xGy）=單獨(dú)X線處理細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)/VB6聯(lián)合X線處理細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，RER大于1表示藥物有放射增敏作用[8]，該比值越大說明VB6對射線的增效作用越強(qiáng)。

1.2.5 藥物相互作用評價(jià) 兩種藥物或治療方法合并使用時(shí)，可產(chǎn)生不同的效果，相互作用結(jié)果可以通過相互作用系數(shù)（coefficient of drug interaction，CDI）進(jìn)行判斷，根據(jù)Cohen等[9]介紹的方法，CDI=AB（/A×B）。A為單獨(dú)VB6處理細(xì)胞后的存活率，B為X線單獨(dú)作用于細(xì)胞后的存活率，AB為VB6與X線聯(lián)合作用于細(xì)胞后的存活率。CDI=1為兩者作用相加，即聯(lián)合治療所得療效為兩種藥物或療法的療效之和；CDI＞1為拮抗作用，即聯(lián)合治療所得療效比兩種藥物或療法的療效之和?。籆DI＜1為協(xié)同作用，即聯(lián)合治療所得療效比兩種藥物或療法的療效之和大，CDI＜0.7為顯著的協(xié)同作用。為了減少偏差，CDI相加作用的判斷可擴(kuò)展至0.9～1.1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以-例數(shù)及率（%）表示；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)；VB6與X線的交互作用采用析因分析法；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VB6對A549細(xì)胞克隆形成能力的影響

VB6呈劑量依賴性地抑制A549細(xì)胞克隆形成，隨著VB6濃度升高，細(xì)胞克隆數(shù)逐漸減少，克隆形成效率及存活分?jǐn)?shù)均逐漸降低（P＜0.05）。中濃度組、高濃度組A549細(xì)胞克隆數(shù)、克隆形成效率及存活分?jǐn)?shù)均低于對照組，中濃度組、高濃度組A549細(xì)胞克隆數(shù)、克隆形成效率及存活分?jǐn)?shù)均低于低濃度組，高濃度組A549細(xì)胞克隆數(shù)、克隆形成效率及存活分?jǐn)?shù)均低于中濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 VB6對A549細(xì)胞克隆形成能力的影響（±s）

表1 VB6對A549細(xì)胞克隆形成能力的影響（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與低濃度組比較，P＜0.05；c與中濃度組比較，P＜0.05

組別對照組低濃度組中濃度組高濃度組F值P值1 3 0.3±9.6 1 2 4.0±5.0 1 0 6.7±6.5 a b 8 0.3±7.5 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5 6 5.2±4.8 6 2.0±2.5 5 3.3±3.3 a b 4 0.2±3.8 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5 1 0 0.0±7.4 9 5.1±3.8 8 1.8±5.0 a b 6 1.3±5.7 a b c 2 7.7 8 2＜0.0 5克隆數(shù)克隆形成效率（%）存活分?jǐn)?shù)（%）

2.2 VB6對放療的增效作用

X線照射后A549細(xì)胞克隆形成數(shù)量減少，克隆形成效率降低，X線呈劑量依賴性地抑制細(xì)胞克隆形成，2、4、6 Gy照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別較未照射組細(xì)胞下降了49.1%、78.0%和97.2%（F=487.410，P＜0.01）。VB6與X線聯(lián)合處理細(xì)胞，可使X線照射對細(xì)胞存活的抑制作用更為明顯，VB6（250 μg/ml）與2、4、6 Gy的射線聯(lián)合處理細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)進(jìn)一步下降，與未照射組比較，分別下降了63.2%、87.0%和99.0%（F=3.997，P＜0.01）。雖然250 μg/ml的VB6單獨(dú)處理細(xì)胞使A549細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)只下降18.2%，但其與2 Gy的射線聯(lián)合處理細(xì)胞則可使細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)較單獨(dú)照射組進(jìn)一步下降14.1%。X線×VB6析因分析發(fā)現(xiàn)，VB6和X線均能降低細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，且兩者有明顯的交互作用。（表 2）

表2 X線單獨(dú)-及與VB6聯(lián)合治療對A549細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響（%，±s）

表2 X線單獨(dú)-及與VB6聯(lián)合治療對A549細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響（%，±s）

注：a與0 Gy比較，P＜0.05；b與2 Gy比較，P＜0.05；c與4 Gy比較，P＜0.05

方法X線X線+V B 6 1 0 0.0±7.4 8 1.8±5.0 5 0.9±5.0 a 3 6.8±4.7 a 2 2.0±4.2 a b 1 3.0±2.3 a b 2.8±0.4 a b c 1.0±0.4 a b c 0 G y 2 G y 4 G y 6 G y

2.3 藥物相互作用

VB6與2、4、6 Gy X線相互作用的CDI分別為0.88、0.72和 0.44，均小于 1，說明 VB6和 X 線對A549細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，而非簡單的相加作用，而且射線劑量為4 Gy和6 Gy時(shí)協(xié)同作用比2 Gy時(shí)更顯著。此外，VB6（250 μg/ml）對2、4、6 Gy劑量射線的RER分別為1.38、1.69和2.75，均大于1，說明VB6對X線抑制細(xì)胞存活效應(yīng)有明顯增效作用，具有輻射增敏作用。

3 討論

VB6作為人體必需的一種維生素，在體內(nèi)參與多種物質(zhì)的代謝，對維持人體正常的生理機(jī)能具有重要意義。VB6的缺乏或代謝異常與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生有關(guān)[2]。盡管研究結(jié)果不一致，但越來越多的研究顯示VB6可能與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如胃腸道癌[3]、胰腺癌[4]、乳腺癌[10]和前列腺癌[11]等。對于全球腫瘤死亡人數(shù)最多的肺癌，與VB6同樣存在著一定的關(guān)聯(lián)，一項(xiàng)包括8000多例肺癌患者的薈萃分析研究顯示，VB6缺乏與肺部腫瘤的增加有關(guān)[12]。另外一項(xiàng)大規(guī)模人群研究結(jié)果表明，血清VB6水平與NSCLC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[13]。然而，調(diào)查研究結(jié)果并不完全一致，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)VB6只與歐洲和亞洲吸煙的男性肺癌患者具有微弱關(guān)聯(lián)[14]。而前瞻性隊(duì)列研究并未發(fā)現(xiàn)血清VB6與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)[15]，因此，有關(guān)VB6與肺癌之間的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果顯示，VB6在體外呈劑量依賴性地抑制A549細(xì)胞克隆形成，500 μg/ml的 VB6可以使細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)下降近40%，說明VB6使該細(xì)胞的存活能力受到明顯抑制，該研究結(jié)果支持VB6對NSCLC具有抑制作用。NSCLC患者的紅細(xì)胞VB6水平降低[16]，吡哆醛激酶（一種將VB6前體轉(zhuǎn)化為PLP的酶）的水平升高已被證明是NSCLC患者良好的、獨(dú)立于治療的預(yù)后標(biāo)志物[17]，這些研究結(jié)果表明VB6可能是NSCLC的保護(hù)因子。

VB6除了本身具有一定的抗腫瘤活性外，與化療藥物聯(lián)合使用具有增強(qiáng)藥物對腫瘤細(xì)胞毒性的作用，體外實(shí)驗(yàn)顯示PN在多種腫瘤細(xì)胞系（NSCLC、卵巢癌、宮頸癌、骨肉瘤、間皮瘤、結(jié)直腸癌以及多個(gè)不同的順鉑耐藥細(xì)胞系）中可增強(qiáng)順鉑對細(xì)胞的毒性作用[17]。在NSCLC小鼠模型中，進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射PN同樣可以增強(qiáng)化療藥物順鉑的抗腫瘤作用，VB6可以增強(qiáng)順鉑對A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，加劇順鉑導(dǎo)致的DNA損傷[17]。有報(bào)道使用一種昆蟲源性中藥斑蝥酸鈉和VB6的組合，與鉑類化療藥物聯(lián)合使用，能提高NSCLC的治療效果，減少腫瘤復(fù)發(fā)和化療不良反應(yīng)，改善患者的生活質(zhì)量和免疫功能[18]。然而，目前有關(guān)VB6對放療增效作用的報(bào)道很少，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PN可以使A549細(xì)胞對高劑量（50 Gy）γ-射線的敏感性增強(qiáng)[17]，然而，射線的種類及放射劑量不同，藥物的影響會(huì)有很大差異[19]。本研究結(jié)果顯示，在X線照射劑量為2、4、6 Gy時(shí)，VB6可以增強(qiáng)X線對A549細(xì)胞的抑制作用，不同劑量射線與VB6聯(lián)合使用均較兩者單獨(dú)使用的抑制作用增強(qiáng)，CDI均小于0.9，說明VB6與X線聯(lián)合使用對A549細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，而非單純的疊加效應(yīng)，特別是在4 Gy和6 Gy時(shí)CDI更低，說明協(xié)同抑制作用更顯著，聯(lián)合治療顯示出比單一治療更大的細(xì)胞效應(yīng)。因此，NSCLC放療過程中適當(dāng)補(bǔ)充VB6有可能對增強(qiáng)NSCLC的放療效果具有一定的幫助。

此外，本研究結(jié)果還顯示VB6（250 μg/ml）對2、4、6 Gy劑量射線的RER均大于1，說明VB6具有一定的放療增效作用。放射抵抗是影響腫瘤放療效果的直接因素，提高腫瘤的放療敏感性是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)課題，放療增敏劑能夠增強(qiáng)射線對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性，提高腫瘤的放療效果，因此，VB6的放療增效作用值得進(jìn)一步探討。

VB6不僅可以直接抑制NSCLC細(xì)胞的存活，而且與X線聯(lián)合應(yīng)用起到協(xié)同抑制以及輻射增敏作用，VB6的這些特性有可能使其成為NSCLC放療過程中聯(lián)合治療的候選化合物。