郭雪艷，藺敏，劉貴生，金燕，閻春英，高淑娟#

1陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710068

2寶雞市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 寶雞 721000

胃癌是消化系統(tǒng)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球新增胃癌患者108.9萬例，病死76.9萬例，亞洲約占50%[1]。胃癌已成為全球腫瘤的第三大死亡原因，中國是胃癌的高發(fā)國家，發(fā)病例數(shù)占全球的44.1%[1]。胃癌發(fā)生發(fā)展及多藥耐藥是非常復(fù)雜的過程，研究表明，多種分子參與了胃癌惡性表型及多藥耐藥網(wǎng)絡(luò)的形成。TWIST作為bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員之一，現(xiàn)已被多種研究證實(shí)為癌基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，TWIST在胃癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)[2]，且在人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中表達(dá)水平更高，可能與胃癌患者的多藥耐藥有關(guān)，參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移過程[3]，但具體的分子機(jī)制不詳。本研究采用基因克隆技術(shù)及基因重組技術(shù)從胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中克隆了人TWIST基因的全長序列，合成可在真核細(xì)胞中高表達(dá)的重組慢病毒載體，構(gòu)建高濃度精確表達(dá)TWIST的慢病毒載體，為后續(xù)研究TWIST在胃癌多藥耐藥、轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞、293T細(xì)胞、GV341慢病毒表達(dá)載體及AgeI/NheI酶切均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR由第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗室聶勇戰(zhàn)教授惠贈。總RNA提取試劑盒、包裝載體純化試劑盒均購自德國Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、Plasmid抽提Kit均購自美國普洛麥格公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，In-Fusion?PCR Cloning Kit購自美國康迪泰克公司，1 kp DNA Ladder Marker購自美國Fermentas公司，250 bp DNA Ladder Marker、Primer均購自上海捷瑞生物工程有限公司，瓊脂糖購自賽百盛公司，Taq polymerase購自北京義翹神州科技股份有限公司，脫氧核糖核苷三磷酸（dexoyribonucleoside triphosphate，dNTP）購自日本Takara公司，限制性內(nèi)切酶購自美國New England Biolabs公司，臺盼藍(lán)購自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、胎牛血清均購自上海微科生化試劑有限公司，DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司，F(xiàn)lag單克隆抗體購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗購自美國Santa Cruzigma公司，ECL-PLUS/Kit購自Amersham公司。

1.2 重組慢病毒表達(dá)載體GV341-TWIST的構(gòu)建

1.2.1 載體酶切 選用高效慢病毒表達(dá)載體GV341，元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin，克隆位點(diǎn)：AgeI/Nhe。

1.2.2 目的基因片段獲取 參考Genbank的TWIST1（BC036704）基因序列設(shè)計一對TWIST全基因擴(kuò)增序列，上游引物5'-CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGATGCAGGACGTGTCCAG-3'，下游引物5'-AATGCCAACTCTGAGCTTGTGGGACGCGGACATGGAC-3'，其中交換配對堿基、酶切位點(diǎn)、用于PCR釣取的目的基因5'端部分序列，由上海吉凱生物化學(xué)公司合成，聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）法純化引物。PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min，55℃30 s，72 ℃ 2 min，再延伸 10 min，共 30個循環(huán)，TWIST PCR產(chǎn)物-20℃保存待檢。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并使用凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶。

1.2.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 將純化后的TWIST PCR產(chǎn)物及酶切后線性載體DNA、In-Fusion交換酶、10×In-Fusion交換酶緩沖液、ddH2O加入反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：25℃水浴30 min，42℃水浴5 min中止反應(yīng)，目的是將TWIST PCR產(chǎn)物交換入線性化表達(dá)載體。以ddH2O為陰性對照，以空載體為空載體自連對照，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為陽性對照。完成后再以上游引物5'-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3'、下游引物 5'-CAACCGAGAAGGCGTAGC-3'序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物，并將其送往上海吉凱生物化學(xué)有限公司進(jìn)行測序以鑒定基因的準(zhǔn)確性。

1.3 重組慢病毒載體GV341-TWIST的表達(dá)及病毒滴度檢測

1.3.1 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選擇生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基；將陽性轉(zhuǎn)化子PCR克隆產(chǎn)物（DNA）與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，將 100 μl脂質(zhì)體 2000 加入至 2.4 ml的Opti-MEM減血清培養(yǎng)基中，在室溫條件下孵育5 min后將兩者的混合液混合，然后靜置20 min形成DNA與脂質(zhì)體2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞；8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，加入20 ml的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混合物，棄去；加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清，4℃、4000 r/min離心10 min，去除細(xì)胞碎片，過濾、離心后收集病毒濃縮液，-80℃貯存。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測TWIST蛋白的表達(dá)水平 分別收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染GV341-TWIST的293T細(xì)胞，離心沉淀后使用超聲破碎，使蛋白變性；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h后，加入Flag一抗（稀釋濃度為1∶3000）4℃孵育過夜。TBST沖洗3次，每次10 min，加入羊抗鼠IgG的二抗（1∶4000稀釋）室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min，加入發(fā)光液，凝膠成像儀成像。

1.3.3 實(shí)時PCR 檢測重組慢病毒載體GV341-TWIST 病毒滴度 收集感染和未感染重組慢病毒載體GV341-TWIST的293T細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），用于擴(kuò)增WRPE（WRPE是慢病毒的元件之一，可以作為實(shí)時PCR檢測的目標(biāo)基因從而進(jìn)行慢病毒感染樣品的檢測）的引物序列：上游引物5'-AATTCCGTGGTGTTGTCG-3'，下游引物 5'-AAGGTCCGCTGGATTGAG-3'，被擴(kuò)增片段位置371～493 bp；對照Actin引物（NM_001101）序列：上游引物5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，下 游 引 物 5'-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3'，被擴(kuò)增片段位置932～1233 bp。PCR反應(yīng)體系為20.0 μl，包括SYBR緩沖液 10 μl，上下游引物各 1.0 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O 7.0 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后建立熔解曲線（反應(yīng)條件：95℃1 min，冷卻至55℃，從55℃開始到95℃，每次增加0.5℃，30 s增加一次）。反轉(zhuǎn)錄得到20 μl cDNA，取1 μl用于實(shí)時定量逐孔稀釋測定Ct值，根據(jù)各組Ct值計算滴度，這一結(jié)果表示1/20樣品的情況，滴度計算時再乘以20。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TWIST 基因片段的獲取

從高表達(dá)TWIST的人胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中克隆，擴(kuò)增TWIST基因編碼區(qū)全序列的DNA片段，其片段大小約為651 bp，酶切后電泳，在651 bp處可見載體酶切產(chǎn)物特異性條帶。（圖 1）

圖1 TWISTPCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 重組慢病毒表達(dá)載體GV341-TWIST的構(gòu)建

將TWIST PCR產(chǎn)物交換入線性化表達(dá)載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳，陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為706 bp（圖2）。陽性克隆測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的TWIST序列與Genbank中的序列完全一致。

圖2 陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 重組慢病毒表達(dá)載體GV341-TWIST轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞

將重組慢病毒表達(dá)載體GV341-TWIST轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞48 h后，可見部分細(xì)胞融合，并出現(xiàn)多核復(fù)合體；熒光顯微鏡下觀察到感染病毒后細(xì)胞內(nèi)大量綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染率＞80%。（圖3）

圖3 重組慢病毒表達(dá)載體GV341-TWIST感染293T細(xì)胞后TWIST的表達(dá)情況（×200）

2.4 Western blot法檢測TWIST蛋白的表達(dá)水平

重組慢病毒表達(dá)載體GV341-TWIST轉(zhuǎn)染細(xì)胞在25 kD附近有大小與TWIST融合蛋白相吻合的特征條帶，而陰性對照細(xì)胞不能檢測到TWIST融合蛋白的表達(dá)。

2.5 實(shí)時PCR 測定病毒滴度

樣品顏色同PCR曲線顏色，在本次滴度檢測中，10-4μl組和對照樣品間Ct值存在差異，認(rèn)為在10-4μl組樣品中存在病毒顆粒（圖4A）。假定該組樣品含有至少1個病毒顆粒，則病毒的滴度為：1/（1.00E-04）×20=2.00E+5 TU/μl=2.00E+8 TU/ml。目的基因溶解曲線及Actin基因溶解曲線分別如圖4B及圖4C，圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰異常增寬，表明實(shí)驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

圖4 實(shí)時PCR測定TWIST 重組慢病毒滴度

3 討論

隨著日常生活環(huán)境的不斷變化，細(xì)胞隨著自身環(huán)境的變化也在不斷更新自身結(jié)構(gòu)功能，以更好適應(yīng)現(xiàn)在所處條件或更好地與人類對抗。人類在不斷研發(fā)胃癌新治療方案的同時，人體細(xì)胞也在不斷偽裝包裝自身，細(xì)胞形式各式各樣，因此，不僅要加緊研發(fā)治療方案，還要時刻監(jiān)測細(xì)胞本身的變化。TWIST作為高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，是于1983年在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，其對果蠅胚胎發(fā)育的細(xì)胞重建及遷移具有重要作用[4]。隨后在水蛭、文昌魚、秀麗隱桿線蟲、非洲蟾蜍、小鼠及人類細(xì)胞中相繼發(fā)現(xiàn)了TWIST基因的同源物[5-10]。脊椎動物有TWIST1和TWIST2（也稱之為dermo-1）2個蛋白[11]。

在正常生理情況下，TWIST主要表達(dá)于胚盤、胚胎中胚層和成年人的某些中胚層來源的未分化組織中。TWIST基因突變可導(dǎo)致Saethre-Chotzen綜合征，是一種過早融合頭骨的遺傳性疾病，這一種遺傳障礙表現(xiàn)為四肢異常、頭和顏面不對稱以及顱縫融合不成熟等[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，TWIST也在乳腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、食管癌、胃癌、膽管癌、骨肉瘤、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[14-15]，并與患者的預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，TWIST在胃癌細(xì)胞及耐藥SGC7901/VCR細(xì)胞中高表達(dá)，在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮原癌基因的作用，其表達(dá)還可促進(jìn)胃癌細(xì)胞耐藥及轉(zhuǎn)移，目前具體分子機(jī)制尚不明確[16-17]。也有研究顯示，TWIST可能通過促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，對胚胎發(fā)育過程中的組織重建和細(xì)胞遷移能力有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[18]。TWIST具有EMT或腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）特征，是EMT和CSC所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[19]。研究顯示，TWIST將成為治療腫瘤耐藥性轉(zhuǎn)移性的有效靶點(diǎn)[20]。Wang等[14]為探索TWIST與MDR基因相關(guān)蛋白之間的關(guān)系，構(gòu)建了hTWIST cDNA的pcDNA5/FRT/TO載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TWIST可能通過調(diào)節(jié)MDR基因相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和組織的耐藥性。

既往本研究組曾構(gòu)建TWIST原核表達(dá)載體，但因其表達(dá)效率較低，影響后期功能實(shí)驗[21]。因此，本研究從胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR中擴(kuò)增出人TWIST基因，與GV341質(zhì)粒酶切后成功構(gòu)建TWIST重組慢病毒表達(dá)載體GV341-TWIST，將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效率＞80%，包裝后獲得滴度為2.00E+8 TU/ml的慢病毒載體；通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TWIST蛋白在293T細(xì)胞中高表達(dá)。高效TWIST慢病毒表達(dá)載體的成功構(gòu)建與成功包裝可為TWIST在胃癌細(xì)胞高表達(dá)提供工具，為后期研究TWIST基因在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)[22-23]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建并包裝了TWIST慢病毒高效表達(dá)載體，為TWIST在腫瘤中的功能研究提供高表達(dá)工具。