ERDENEBAYAR Ochirkhand，劉定邦，楊 麗，程建勇，李青旺

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

精子的超低溫保存為利用人工授精技術(shù)保存遺傳資源和改進(jìn)育種方案提供了特殊的機(jī)遇。Lee等[1]認(rèn)為，超低溫保存技術(shù)可以不受空間和時(shí)間的限制提供可受精的精子，并有助于改進(jìn)人工授精技術(shù)。由于豬精子的細(xì)胞膜含有更多的不飽和脂肪酸，因此與其他家畜相比，豬精子特別容易發(fā)生冷休克，而且易受到氧化損傷的影響。其中公豬的精子對冷休克最敏感，公牛、公羊和種馬次之，而冷休克對狗和貓的精液影響較小，兔子、人類和公雞對冷休克幾乎不敏感。目前，牛[2]、小鼠[3]、犬[4]、兔[5]、人[6]精子冷凍保存技術(shù)較為成熟，并分別建立了商業(yè)精子庫。然而，豬[7]和大鼠[8]的低溫保存精液質(zhì)量仍然較差，其低溫保存技術(shù)亟待開發(fā)。

熊果酸(Ursolic acid，UA；C30H48O3和3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic酸)是一種天然五環(huán)三萜羧酸化合物[9]，廣泛存在于枇杷、花、薰衣草葉子、蔬菜、水果(蘋果、梨、李子和藍(lán)莓[10-12])和迷迭香等草藥中[13-14]。UA具有廣泛的生物活性，包括抗微生物[15]、消炎[14]鎮(zhèn)痛、抗癌[16-17]和抗過敏、抗腫瘤[18]、促毛發(fā)生長、促黑素細(xì)胞增殖和黑色素合成、抗糖尿病、抗肥胖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抵抗肝脂肪變性和纖維化、抗焦慮、抗抑郁、抗肌肉萎縮、抗疲勞、抗骨質(zhì)疏松、改善學(xué)習(xí)和記憶及其他神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)等藥理作用[19]。最近，在嚙齒類動(dòng)物的飲食代謝疾病模型中，UA營養(yǎng)補(bǔ)充劑已被證明可以改善血糖控制和脂質(zhì)分布，減少肝臟脂質(zhì)積累，并增加抗氧化酶活性[11]。

熊果酸作為天然的抗氧化劑，目前尚未發(fā)現(xiàn)其對豬精子冷凍保存效果的研究。本試驗(yàn)將不同濃度的熊果酸作為外源性抗氧化劑添加到冷凍稀釋液中，通過檢測解凍后的豬精子的活力、活率，相關(guān)運(yùn)動(dòng)參數(shù)以及質(zhì)膜完整性、線粒體活性和頂體完整性，以探索熊果酸對豬精子冷凍保存效果的影響。

1 材料與方法

1.1 道德聲明

試驗(yàn)取樣按照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[20]進(jìn)行。所有的動(dòng)物手術(shù)都是根據(jù)西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.2 精液收集

用手握法從5個(gè)成熟的長白公豬(年齡在1.5至3歲)收集精液，每周1次，通過雙層無菌棉紗布過濾以除去凝膠顆粒，然后取富含精子的部分。經(jīng)鏡檢選擇乳白色、無異味、形態(tài)正常、活力大于75%、密度高的精液樣品進(jìn)行試驗(yàn)研究。

1.3 化學(xué)品和擴(kuò)展劑

熊果酸購自成都德賽特生物技術(shù)有限公司(中國成都)。除另有說明外，其他化學(xué)品購自Sigma公司(美國)。所用試劑均為分析純級(jí)。制備的解決方案,純凈水(18.2 mΩcm；ELGA Purelab Classic，英國)被使用。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別向稀釋劑中加入0、1.0、1.4、1.6、1.8和2.0 mg/mL熊果酸。以不含熊果酸的TCG稀釋液為對照，檢測解凍后精子活力，活率，質(zhì)膜完整性，頂體完整性和線粒體膜完整性。

1.5 精液稀釋劑的制備和平衡

用于精子稀釋的基本擴(kuò)展劑為Johnson、Aalbers和Grooten(1988)所描述的Beltsville Thawing Solution(BTS)，并對其進(jìn)行了一些修改[21]。將合格的精液樣品加到相同量的BTS溶液中進(jìn)行稀釋，用紗布包好并放入保溫瓶(32～35 ℃)中，送回實(shí)驗(yàn)室。在室溫下平衡1 h，然后每30 min搖動(dòng)精液幾次，以防止精液進(jìn)入假死狀態(tài)。將平衡的精液分裝到10 mL離心管，在室溫下離心，以1000 r/min的速度離心10 min，棄上清液。

用于精子冷凍保存的冷凍延長劑由77%的三檸檬酸葡萄糖溶液(TCG)組成[22]。精液通過兩步稀釋法進(jìn)行稀釋：將預(yù)先預(yù)冷的I液體(80%TCG+20%蛋黃)緩慢加入離心的沉淀物中，以1∶2的比例稀釋，用紗布包裹，然后放入4 ℃冰箱中1.5～2 h，使其緩慢降至4 ℃。然后緩慢加入等體積的預(yù)冷II溶液(在稀釋液I基礎(chǔ)上加入3%甘油)，用紗布包裹，并在4 ℃下繼續(xù)平衡1.5～2 h。平衡后，檢查精子活力，冷凍精子活力應(yīng)為0.6或更高。

1.6 精液冷凍保存

將一小段軟橡膠管與1 mL注射器的前端連接，將0.25 mL包含聚乙烯粉末的冷凍細(xì)管插入軟橡膠管中，將細(xì)管的另一端浸入平衡的精液樣品中，然后使用注射器將稀釋的精液吸入細(xì)管。然后將其用聚乙烯粉末密封并標(biāo)記，由于聚乙烯粉末的溶脹，將細(xì)管的另一端密封。

將填充的管子放入程序冷凍室，并控制其以1 ℃/min的速度從4 ℃降到-5 ℃。當(dāng)溫度恒定在-5 ℃時(shí)，取出試管，將其放在自制的冷凍室中，使其在距液氮表面3 cm處排煙10 min，以便在溫度下降時(shí)迅速冷卻。降到-120 ℃，將試管放入液氮中儲(chǔ)存。

1.7 精液解凍

冷凍的精液管應(yīng)在液氮罐中保存至少1周。解凍過程中，小心地從液氮中取出細(xì)管，迅速放入37 ℃恒溫水浴中保溫45 s，取出細(xì)管，剪掉兩端，將精液倒入預(yù)先預(yù)熱10 min的BTS溶液中。在37 ℃恒溫水浴中30 min后進(jìn)行精液質(zhì)量檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 熊果酸對豬精子活力和相關(guān)運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

從表1可以看出：熊果酸對處理組精子運(yùn)動(dòng)有顯著影響。豬精子冷凍稀釋液中添加熊果酸可以顯著改善解凍后精子的活力及相關(guān)運(yùn)動(dòng)參數(shù)。添加1.6 mg/mL熊果酸組的精子活力、STR和VAP顯著高于其他組(P<0.05)。1.6 mg/mL處理組和對照組的VCL差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于其他組(P<0.05)。各組間VSL、LIN、ALH差異不顯著(P>0.05)。

表1 熊果酸對公豬精運(yùn)動(dòng)力的影響

2.2 熊果酸對冷凍保存的豬精子線粒體膜完整性、質(zhì)膜完整性和頂體完整性的影響

檢測熊果酸對精子線粒體膜完整性、質(zhì)膜完整性和頂體完整性的影響，結(jié)果見表2。解凍后的豬精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性均顯著高于對照組和其他處理組(P<0.05)。

表2 熊果酸對凍融后公豬精子的線粒體膜完整性、質(zhì)膜完整性和頂體完整性的影響

3 討 論

哺乳動(dòng)物精子的質(zhì)膜中含有高濃度的多不飽和脂肪酸(PUFA)，容易受到活性氧的攻擊[23]。且與其他哺乳動(dòng)物的精子質(zhì)膜相比，豬精子中含有更高濃度的PUFA，因而極易受到活性氧(ROS)的破壞[24]?？寡趸瘎┦菍棺杂苫T導(dǎo)的ROS的主要防御手段?？寡趸瘎┛汕宄又械难踝杂苫?，對抗活性氧，抑制精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化，從而保持精子的形態(tài)和功能。另外，抗氧化劑可以保護(hù)精子免受活性氧對精子運(yùn)動(dòng)的有害影響，有助于維持精子活力。據(jù)報(bào)道，在精液中添加抗氧化劑可以改善小鼠[3]、野豬[22,25-26]、兔子[27]、大鼠[28]、狗[29]、牛[30]、公牛[31]、水牛[32]、山羊[33]、單峰駱駝[34]和貓[35]的精液質(zhì)量。冷凍和解凍是精子冷凍保存的兩個(gè)主要步驟，對精子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有重要影響[36]。精液的保存過程、精液的運(yùn)輸、搬運(yùn)過程、添加物濃度以及活性氧等均會(huì)對精子的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷。在大多數(shù)物種中，精子冷卻會(huì)在一個(gè)時(shí)間依賴的過程中對精子造成一些功能和結(jié)構(gòu)損傷。為了防止這些損傷，精液需要用適當(dāng)?shù)南♂寗┫♂屢岳鋬霰４鎇37]。

熊果酸作為內(nèi)源性抗氧化劑，能有效清除自由基的天然抗氧化化合物，已受到越來越多的關(guān)注，尤其脂質(zhì)過氧化的抗氧化作用已被許多研究者證實(shí)[38]。但是，熊果酸在長白豬精液冷凍損傷中作用未見到報(bào)道。本研究在長白公豬冷凍精子稀釋液中加入一定劑量熊果酸提取物可以明顯提高冷凍后精子的活力、活率及相關(guān)運(yùn)動(dòng)參數(shù)。同時(shí)觀察到有保護(hù)質(zhì)膜完整性、線粒體膜、頂體完整性的作用。這與本實(shí)驗(yàn)室孫艷青[39]、王捷等[40]研究發(fā)現(xiàn)添加外源性抗氧化劑可以改善解凍后精子品質(zhì)結(jié)果一致。此外，Varo-Ghiuru等[41]研究證明，在冷凍稀釋劑中添加水溶性維生素E可起到保護(hù)精子的作用，提高解凍后豬精子活率和頂體完整率。Shen等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液冷凍稀釋液中添加α-硫辛酸，可以顯著提高解凍后豬精子活率。Pei等[22]對冷凍公豬精子質(zhì)量的研究顯示芹菜素和阿魏酸的聯(lián)合作用同樣明顯改善了冷凍后精子的活率。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)表明，豬精液冷凍稀釋液中添加適量的熊果酸提取物可以提高冷凍解凍后公豬精液活力、活率以及功能完整性，其適合添加的濃度為1.4 mg/mL、1.6 mg/mL和1.8 mg/mL。