付雪峰,谷 英,吳翠玲,德德瑪,孟根曹,斯慶畢力格,斯登丹巴*,田可川

(1.新疆畜牧科學(xué)院 畜牧研究所,新疆絨毛用羊遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室(XJYS1105),新疆 烏魯木齊 830011;2.鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017100;3.新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心/新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830017;4.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗家畜改良工作站,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017300;5.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,山東 濟(jì)南 250100)

鄂爾多斯細(xì)毛羊是1985年育成命名的毛肉兼用細(xì)毛羊培育品種，烏審旗為核心產(chǎn)區(qū)。鄂爾多斯細(xì)毛羊及其產(chǎn)品在國內(nèi)外市場具備較大競爭潛力[1-2]。但隨著人們?nèi)找嬖鲩L的物質(zhì)文化需求和紡織工藝技術(shù)的提高，國內(nèi)外毛紡產(chǎn)品開始向輕薄、柔軟、挺括、高檔方向發(fā)展[3]。因此鄂爾多斯細(xì)毛羊高產(chǎn)、超細(xì)型群體的選育成為目前主要任務(wù)。

核纖層蛋白(lamin B1，LMNB1)基因定位綿羊5號染色體上，有11個(gè)外顯子。LMNB1在器官發(fā)育和組織分化過程中具有重要調(diào)節(jié)作用，是核纖層重要的組成部分[4-5]。硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)是α-視紫紅質(zhì)抑制蛋白家族成員之一。TXNIP基因也被稱為VDUP1基因，定位在綿羊1號染色體上，有8個(gè)外顯子。TXNIP作為一個(gè)多功能的蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、線粒體氧化磷酸化、炎癥反應(yīng)等[6]。課題組前期通過qRT-PCR法發(fā)現(xiàn)相對于細(xì)毛組，LMNB1基因和TXNIP基因在超細(xì)毛組的綿羊皮膚中表達(dá)上調(diào)[7]。另外在細(xì)毛組和粗毛組綿羊皮膚的基因組表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)TXNIP基因在細(xì)毛組上調(diào)[8]。提示LMNB1基因和TXNIP基因在羊毛性狀中參與調(diào)控作用。目前LMNB1基因和TXNIP基因在綿羊羊毛性狀研究較少。

本研究聯(lián)合DNA混池和Snapshot檢測技術(shù)，對鄂爾多斯細(xì)毛羊LMNB1基因和TXNIP基因進(jìn)行多態(tài)性分析，旨在加快鄂爾多斯細(xì)毛羊超細(xì)型群體選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市的烏蘭陶勒蓋鎮(zhèn)(n=41)、嘎魯圖鎮(zhèn)(n=97)、蘇力德蘇木(n=134)、圖克鎮(zhèn)(n=91)、烏審召鎮(zhèn)(n=99)5個(gè)鎮(zhèn)，總共采集462只周歲鄂爾多斯細(xì)毛羊母羊作為試驗(yàn)動(dòng)物。對試驗(yàn)?zāi)秆蜢o脈采血至5 mL抗凝管中，放入-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)提取血液基因組DNA。同時(shí)在試驗(yàn)羊左側(cè)體中線上方肩胛骨后緣10 cm處采集羊毛樣品。將羊毛樣品送往農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種羊及羊毛羊絨質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，通過纖維直徑光學(xué)分析儀(OFDA 2000)檢測羊毛樣品的平均纖維直徑、纖維直徑變異系數(shù)[9]。最后收集試驗(yàn)羊群的2020年鑒定記錄，主要包括產(chǎn)毛量、羊毛纖維長度等。

1.2 構(gòu)建DNA混池

利用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取血液基因組DNA。取4 μL DNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，取1 μL DNA，利用核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度。在測得的羊毛纖維直徑數(shù)據(jù)中分別選取20個(gè)極端個(gè)體(極細(xì)n=10，極粗n=10)DNA樣品。其中極細(xì)組平均纖維直徑為16.36 μm，極粗組為21.50 μm。將極端個(gè)體DNA濃度通過核酸蛋白檢測儀檢測并加入ddH2O調(diào)整到一致。從20個(gè)極端個(gè)體中取分別取10 μL，構(gòu)建2個(gè)DNA混合池(極細(xì)DNA混合池，極粗DNA混合池)。

1.3 PCR擴(kuò)增及測序

根據(jù)Ensembl核酸數(shù)據(jù)庫中LMNB1基因(登錄號：ENSOART00000019747.1)和TXNIP基因(登錄號：ENSOART00000022506.1)序列，利用Premer Premer5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以2個(gè)混池DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：PCR Mixture 10 μL，上下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，加蒸餾水至20 μL。將建立好的PCR體系放入PCR儀中反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。對條帶明亮的PCR產(chǎn)物直接送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果利用DNASTAR軟件的SeqMan程序進(jìn)行序列拼接和校正，用BioEdit軟件比對峰圖。

表1 引物信息表

1.4 Snapshot檢測

根據(jù)雙向測序篩選的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)上、下游引物和延伸引物，引物信息如表2。由北京奧科鼎盛生物科技有限公司使用Snapshot基因分型技術(shù)對462只個(gè)體進(jìn)行檢測，利用ABI 3730XL測序儀進(jìn)行分型。最后對每個(gè)位點(diǎn)隨機(jī)挑選3個(gè)樣品進(jìn)行一代測序，驗(yàn)證Snapshot分型檢測結(jié)果。

表2 Snapshot檢測擴(kuò)增引物和延伸引物

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用Popgene軟件計(jì)算SNPs的基因頻率(gene frequency)、基因型頻率(genotype frequency)、有效等位基因數(shù)(Ne)、基因雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)，以及Hardy-Weinberg平衡。利用SAS 9.2軟件分析SNPs不同基因型與鄂爾多斯細(xì)毛羊毛用性狀關(guān)聯(lián)性。結(jié)果以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示，線性模型為：

Yick=μ+Gi+Fe+eick

公式中:Yick.細(xì)毛羊個(gè)體表型值；μ.群體均值；Gi.基因型SNP效應(yīng)；Fe.場效應(yīng)；eick.隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA和PCR檢測結(jié)果

提取的基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA條帶明亮，結(jié)果如圖1。利用核酸蛋白檢測儀檢測DNA，OD260∶OD280為1.8～2.1，說明提取的DNA質(zhì)量與純度滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。LMNB1基因和TXNIP基因PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果見圖2。PCR產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致，無雜帶，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

圖1 基因組DNA檢測結(jié)果

圖2 LMNB1和TXNIP基因PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

2.2 混池結(jié)果分析

對鄂爾多斯細(xì)毛羊2個(gè)基因5個(gè)PCR片段混池測序發(fā)現(xiàn)了6個(gè)突變。其中LMNB1基因P1片段上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)突變(Indel1和SNP1)，P2片段上發(fā)現(xiàn)了1個(gè)突變(SNP2)，P3片段上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)突變位點(diǎn)(SNP3和SNP4)，P4片段上未發(fā)現(xiàn)突變。TXNIP基因P5片段上發(fā)現(xiàn)了1個(gè)突變(SNP5)。LMNB1基因和TXNIP2個(gè)基因6個(gè)突變信息見表3。其中Indel1是LMNB1基因第2內(nèi)含子上TATT 4個(gè)堿基的缺失；SNP1-SNP4為LMNB1基因外顯子上的同義突變；SNP5為TXNIP基因3'UTR區(qū)突變。

表3 LMNB1基因和TXNIP基因突變位點(diǎn)信息表

2.3 Snapshot檢測分型及驗(yàn)證結(jié)果

利用Snapshot分型技術(shù)檢測462只鄂爾多斯細(xì)毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6個(gè)突變位點(diǎn)分型峰圖見圖3。在Snapshot檢測中6個(gè)突變位點(diǎn)成功分型，并均具有3種基因型。其中Indel1、SNP1、SNP3延伸產(chǎn)物為正向延伸，SNP2、SNP4、SNP5延伸產(chǎn)物為反向延伸。另外，Indel1和SNP1基因型有相同的分型模式，即當(dāng)Indel1為TATT 4個(gè)堿基缺失(AA基因型)時(shí)，SNP1為CC基因型；當(dāng)Indel1為TATT 4個(gè)堿基插入(TT基因型)時(shí)，SNP1為TT基因型，推測Indel1和SNP1 2個(gè)突變存在連鎖，因此后續(xù)將2個(gè)突變位點(diǎn)Indel1-SNP1合并分析。根據(jù)Snapshot分型檢測結(jié)果，隨機(jī)選擇6個(gè)突變不同基因型個(gè)體進(jìn)行一代測序，其中Indel1、SNP1、SNP3為反向測序，SNP3、SNP4、SNP5為正向測序，驗(yàn)證結(jié)果見圖4，一代測序與Snapshot分型結(jié)果完全匹配，說明Snapshot分型結(jié)果可靠。

圖3 LMNB1基因和TXNIP基因6個(gè)突變位點(diǎn)Snapshot分型結(jié)果

圖4 LMNB1基因和TXNIP基因6個(gè)突變位點(diǎn)分型驗(yàn)證

2.4 遺傳多態(tài)性分析

鄂爾多斯細(xì)毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6個(gè)突變基因型頻率、等位基因頻率和χ2計(jì)算結(jié)果如表4所示。由表4可知，Indel1-SNP1優(yōu)勢基因型為TTTT基因型；SNP2為CT基因型；SNP3為AG基因型；SNP4為AA基因型；SNP5為CC基因型。同時(shí)6個(gè)突變位點(diǎn)的χ2值均未達(dá)到顯著水平，Hardy-Weinberg平衡。另外，鄂爾多斯細(xì)毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6個(gè)突變位點(diǎn)遺傳純合度(Ho)、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)性信息含量(PIC)見表5。由表5可知，6個(gè)突變位點(diǎn)純合度較高，有效等位基因數(shù)分別為1.807、1.805、1.807、1.324、1.812。根據(jù)突變位點(diǎn)多態(tài)性標(biāo)準(zhǔn)：PIC>0.5為高度多態(tài)，0.25

表4 LMNB1基因和TXNIP基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.5 6個(gè)突變位點(diǎn)與羊毛性狀相關(guān)性分析

利用SAS 9.2軟件對鄂爾多斯細(xì)毛羊LMNB1基因和TXNIP基因6個(gè)突變位點(diǎn)多態(tài)性與羊毛性狀相關(guān)性分析如表5。其中LMNB1基因的SNP2、SNP3、SNP4等4個(gè)突變位點(diǎn)對鄂爾多斯細(xì)毛羊羊毛性狀均無顯著影響。LMNB1基因Indel1-SNP1突變位點(diǎn)ATCT基因型和TTTT基因型纖維直徑變異系數(shù)顯著高于AACC基因型(P<0.05)，ATCT基因型和TTTT基因型之間差異不顯著(P>0.05)。TXNIP基因SNP5突變位點(diǎn)TT基因型平均纖維直徑顯著高于CT基因型(P<0.05)，極顯著高于CC基因型(P<0.01)。CC基因型和CT基因型之間平均纖維直徑差異不顯著(P>0.05)。

表5 LMNB1基因和TXNIP基因群體多態(tài)性分析

表6 LMNB1基因和TXNIP基因突變位點(diǎn)與羊毛性狀關(guān)聯(lián)性分析

3 討 論

鄂爾多斯細(xì)毛羊羊毛綜合品質(zhì)優(yōu)良，被毛閉合性良好，密度大，細(xì)度以66～70支為主。群體羊毛性狀遺傳穩(wěn)定[2]。在本研究中發(fā)現(xiàn)的6個(gè)突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，進(jìn)一步證明鄂爾多斯細(xì)毛羊遺傳性能保持相對穩(wěn)定，利用傳統(tǒng)的育種方法很難再提高羊毛品質(zhì)及生產(chǎn)性能。羊毛纖維直徑、纖維長度、產(chǎn)毛量決定了羊毛纖維的品質(zhì)，是絨毛羊產(chǎn)業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀和數(shù)量性狀，受微效多基因控制[10]。目前對綿、山羊絨毛性狀相關(guān)基因多態(tài)性的研究主要集中在角蛋白家族基因和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白家族基因中[11-14]，未見LMNB1基因和TXNIP基因多態(tài)性影響羊毛性狀的報(bào)道[15]。同時(shí)目前針對鄂爾多斯細(xì)毛羊羊毛性狀相關(guān)基因的研究較少[16]。因此本研究結(jié)合課題組前期研究進(jìn)展，首次對鄂爾多斯細(xì)毛羊LMNB1基因和TXNIP基因多態(tài)性與羊毛性狀相關(guān)性進(jìn)行研究。

分子標(biāo)記技術(shù)可以通過檢測動(dòng)物在基因或基因型上發(fā)生的變異來表現(xiàn)生物個(gè)體或種群間的差異?；谀z電泳SNP檢測方法有限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)，梯度凝膠電泳(DGGE)、等位基因特異性 PCR(AS-PCR)等。基于高通量的SNP檢測，有高分辨率熔解曲線(HRM)、直接測序法、DNA芯片、變性高效液相色譜(DHPLC)、質(zhì)譜檢測等[17-18]。本研究使用的Snapshot檢測SNP分型是一種以單堿基延伸原理為基礎(chǔ)，同時(shí)利用多重PCR對多個(gè)已知SNP位點(diǎn)進(jìn)行遺傳分型的方法。該方法適用于多個(gè)突變位點(diǎn)的檢測、數(shù)據(jù)完整性高、試驗(yàn)結(jié)果可靠[19]。

在LMNB1基因的研究中發(fā)現(xiàn)，鄂爾多斯細(xì)毛羊外顯子區(qū)域相對保守，檢測到的4個(gè)突變位點(diǎn)均為同義突變，未導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變。在過去主要針對錯(cuò)義突變的研究，因?yàn)殄e(cuò)義突變導(dǎo)致氨基酸改變，從而影響蛋白質(zhì)的合成及其功能。然而同義突變一定程度上可能會(huì)影響mRNA穩(wěn)定性、改變蛋白質(zhì)合成速率、影響蛋白折疊及構(gòu)象等[20-21]。值得注意的是，在LMNB1基因第2內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了TATT 4個(gè)堿基的缺失(Indel1)，同時(shí)通過Snapshot檢測分型可知Indel1和LMNB1基因第3外顯子上的SNP1存在連鎖。其AACC基因型個(gè)體的纖維直徑變異系數(shù)顯著低于ATCT基因型和TTTT基因型。羊毛纖維直徑的變異系數(shù)表示了纖維直徑細(xì)度的均勻程度，直接影響纖維的加工性能及成品。在生產(chǎn)實(shí)踐中，造成羊毛細(xì)度不均的原因很多，如品種、年齡、性別、生長部位和飼養(yǎng)條件等[22-23]。在本研究中對周歲鄂爾多斯細(xì)毛羊母羊肩胛部取樣，減少了試驗(yàn)誤差。因此LMNB1基因Indel 1-SNP1突變位點(diǎn)值得我們進(jìn)一步研究。同時(shí)也提示我們內(nèi)含子區(qū)域的研究不容忽視。

目前對TXNIP的研究主要集中在人類肥胖、糖尿病[24]、高血壓和神經(jīng)疾病等[25]，在綿羊上的研究較少。田月珍等[15]通過PCR-SSCP法對289個(gè)中國美利奴羊(新疆型)TXNIP基因研究，發(fā)現(xiàn)2個(gè)同義突變位點(diǎn)對羊毛細(xì)度影響不顯著。本研究分析發(fā)現(xiàn)TXNIP基因3'UTR的SNP5突變位點(diǎn)與羊毛纖維直徑極顯著相關(guān)，隨著C等位基因拷貝數(shù)的增加，纖維直徑減小?；蛐蛄?'URT區(qū)域?yàn)閙RNA 3′末端非翻譯區(qū)，mRNA成熟前的3'UTR區(qū)隨著物種的進(jìn)化其序列不斷延伸?；?'URT區(qū)可以調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。另外，哺乳動(dòng)物miRNA通常作用于3'UTR區(qū)域[26]。因此，后續(xù)將深入研究TXNIP基因3'UTR區(qū)的SNP5突變位點(diǎn)對羊毛性狀影響的分子機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究在鄂爾多斯細(xì)毛羊LMNB1和TXNIP兩個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)突變位點(diǎn)，在鄂爾多斯細(xì)毛羊群體中呈Hardy-Weinberg平衡。LMNB1基因Indel1-SNP1突變位點(diǎn)對纖維直徑變異系數(shù)影響顯著。TXNIP基因SNP5突變位點(diǎn)對平均纖維直徑影響極顯著。該研究對鄂爾多斯細(xì)毛羊超細(xì)型群體的選育提供了試驗(yàn)依據(jù)。