丁 燦，沈 浮，劉 鑫，楊 雷

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.永州市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 永州 425000）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種常見(jiàn)的血清陰性型脊柱炎，以慢性炎癥和新骨形成為主要特征，常累及脊柱及骶髂關(guān)節(jié)[1]。流行病學(xué)提示其全球發(fā)病率為0.1%～1.4%，男性發(fā)病率高于女性，晚期AS可導(dǎo)致活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)僵硬，甚者致殘而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2-3]。AS的確切原因尚不清楚，目前一般認(rèn)為其與遺傳及環(huán)境因素導(dǎo)致的自身免疫機(jī)制紊亂所致的慢性炎癥相關(guān)[4-5]。近年來(lái)，越來(lái)越多學(xué)者認(rèn)為，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在AS的發(fā)生、發(fā)展和治療中起著至關(guān)重要的作用。如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、輔助性T1細(xì)胞和輔助性T17細(xì)胞都與AS的發(fā)展有重要關(guān)系[6]。因此，評(píng)估免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和確定免疫細(xì)胞成分的差異對(duì)闡明AS進(jìn)展的分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的免疫治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。在臨床實(shí)踐中，AS的治療主要依賴于非甾體抗炎藥及生物制劑[7]，而此類(lèi)藥物長(zhǎng)期使用具有心血管、胃腸道及腎臟不良反應(yīng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)[8]，而中藥的較好療效、低副作用和低成本，以及對(duì)于免疫失衡的調(diào)節(jié)干預(yù)，使得其成為治療AS較為優(yōu)越的替代療法。

隨著高通量遺傳分析的出現(xiàn)，基因表達(dá)譜分析成為了鑒定各種疾病差異表達(dá)基因的有效方法，有助于探索發(fā)病機(jī)制和開(kāi)發(fā)生物標(biāo)志物。迄今為止，已有多項(xiàng)研究使用微陣列表達(dá)來(lái)鑒定AS發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵基因[9-10]。CIBERSORT是一種分析工具，它使用微陣列數(shù)據(jù)或RNA測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估樣本中免疫細(xì)胞的表達(dá)，并獲得各種免疫細(xì)胞比率[11]。本研究應(yīng)用基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中AS患者與正常人群的全血差異樞紐基因進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，采用廣泛用于評(píng)估鑒定22種免疫細(xì)胞相對(duì)含量的CIBERSORT反卷積算法進(jìn)行差異基因的免疫浸潤(rùn)分析研究，并篩選與免疫浸潤(rùn)相關(guān)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，從而預(yù)測(cè)免疫相關(guān)靶點(diǎn)及中藥復(fù)方，旨在為AS的診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 以“Ankylosing Spondylitis”為關(guān)鍵詞檢索GEO基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到“GSE25101”芯片為本次研究分析的對(duì)象。該芯片主要包含16例AS患者及16名年齡性別對(duì)應(yīng)的健康人全血基因表達(dá)譜，通過(guò)GPL6947 Illumina HumanHT-12 V3.0表達(dá)珠芯片平臺(tái)將探針轉(zhuǎn)換成基因名稱，利用R語(yǔ)言程序中“Limmar”安裝包對(duì)每個(gè)樣本的微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，剔除缺失值，當(dāng)基因?qū)?yīng)于多個(gè)探針時(shí)，取最大值[12]。

1.2 關(guān)鍵差異樞紐基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作（PPI）及功能注釋 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）獲取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)模型（protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape軟件中利用CentiScape插件計(jì)算每個(gè)靶基因的DC（度）值，以平均度值的2倍進(jìn)行核心靶基因的篩選并進(jìn)行可視化[13]。運(yùn)用R語(yǔ)言程序中的“clusterProfiler”插件包進(jìn)行差異基因的基因本體論（Gene Ontology，GO）與京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.3 免疫浸潤(rùn)矩陣整理 本研究利用CIBERSORT反卷積算法進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等22種免疫細(xì)胞在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄特征矩陣的模擬計(jì)算，設(shè)定次數(shù)為100次，對(duì)P＜0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 免疫細(xì)胞間相關(guān)性分析及組間差異分析 為了分析各類(lèi)免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，本研究在CIBERSORT反卷積算法以P＜0.05篩選可信樣本數(shù)據(jù)，然后計(jì)算可信樣本數(shù)據(jù)中不同免疫細(xì)胞間的Pearson相關(guān)系數(shù)，并運(yùn)用秩和檢驗(yàn)分析AS患者與健康人群之間的差異。

1.5 關(guān)鍵差異樞紐基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平關(guān)系的相關(guān)性分析 為進(jìn)一步研究關(guān)鍵差異樞紐基因與疾病相關(guān)性程度，本研究將篩選所得的差異樞紐基因與差異性較為顯著的免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，分析靶基因與各免疫細(xì)胞表達(dá)是否存在相關(guān)性并計(jì)算相關(guān)性系數(shù)r值。|r|＜0.4為弱相關(guān)，0.4＜|r|＜0.7為中等強(qiáng)度相關(guān)，|r|＞0.7為高度相關(guān)。

1.6 AS免疫浸潤(rùn)過(guò)程中潛在中藥及復(fù)方的篩選預(yù)測(cè) 將AS差異核心靶基因及GO富集的與免疫浸潤(rùn)相關(guān)生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）導(dǎo)入Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)（https://coremine.com/）及本草組鑒數(shù)據(jù)庫(kù)（http://herb.ac.cn/）中，篩選具有潛在效應(yīng)機(jī)制的中藥。Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)中的藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05；本草組鑒數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選標(biāo)準(zhǔn)為P-value＜0.05，且FDR_BH＜0.05。通過(guò)閱讀文獻(xiàn)及古籍，基于上述所預(yù)測(cè)的藥物進(jìn)行復(fù)方預(yù)測(cè)，使得復(fù)方盡可能的包含較多的預(yù)測(cè)藥物。

2 結(jié)果

2.1 AS差異表達(dá)基因獲取結(jié)果 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及篩選結(jié)果顯示，AS組與正常組的差異基因?yàn)?35個(gè)，其中上調(diào)基因?yàn)?9個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?6個(gè)。圖1A熱圖展示了前20個(gè)上調(diào)及下調(diào)基因的情況，圖1B為差異基因的分布情況。

圖1 AS 相關(guān)基因探針差異表達(dá)的熱圖及火山圖

2.2 AS關(guān)鍵樞紐基因獲取 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析（PPI），將分析結(jié)果的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行可視化展示。圖2A中節(jié)點(diǎn)顏色越深代表該節(jié)點(diǎn)的度值越大，在PPI模型中的重要程度越高。圖2B可視化展示了度值大于2倍平均度值（15.8）的關(guān)鍵樞紐基因，其中度值大于15.8的有14個(gè)，分別是SNRPG、LSM3、PSMA6、MRPL22、RPL26、COX7C、PSMA4、RPS17、RPL31、SLIRP、NDUFS5、RPS24、NDUFB3、SRP14。

圖2 AS 差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶基因

2.3 GO及KEGG富集分析結(jié)果 運(yùn)用R語(yǔ)言程序中的“ClusterProfiler”插件包分析AS差異基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析。差異基因的GO分析中共獲取生物過(guò)程（biological process，BP）77條，細(xì)胞組成（cellular component，CC）28條，分子功能（molecular fuction，MF）17條，對(duì)其中基因富集數(shù)目最多的10條進(jìn)行條形圖展示。根據(jù)基因的富集數(shù)目，表1展示了與免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，主要涉及中性粒細(xì)胞脫粒（Neutrophil degranulation）、免疫反應(yīng)中的中性粒細(xì)胞激活（Neutrophil activation involved in immune response）、先天免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)（Regulation of innate immune response）、核糖體生物發(fā)生（Ribosome biogenesis）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控（Positive regulation of NF-κB transcription factor activity）、中性粒細(xì)胞趨化性（Neutrophil chemotaxis）、細(xì)胞防御反應(yīng)（Cellular defense response）、白細(xì)胞介素-1介導(dǎo)的信號(hào)通路（Interleukin-1-mediated signaling pathway）、T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性（T cell mediated cytotoxicity）。（見(jiàn)圖3）在KEGG富集分析中，差異基因主要涉及核糖體合成、氧化磷酸化等相關(guān)通路，與代謝、炎性反應(yīng)相關(guān)通路聯(lián)系密切。

表1 AS 與對(duì)照組差異基因免疫浸潤(rùn)相關(guān)GO 富集分析列表

圖3 AS 差異基因的KEGG 及相關(guān)基因可視化

2.4 AS患者與正常組的免疫細(xì)胞分布特征 通過(guò)CIBERSORT反卷積算法以P＜0.05樣本進(jìn)行篩選，最終獲取32個(gè)可信樣本，如圖4A所示。熱圖左側(cè)16個(gè)樣本（GSM616684～GSM616699）為正常組，右側(cè)16個(gè)樣本（GSM616668-GSM616683）為AS組，結(jié)果顯示，單核細(xì)胞（Monocytes）、CD8 T細(xì)胞（T cells CD8）、中性粒細(xì)胞（Neutrophils）、初始CD4+T細(xì)胞（T cells CD4 naive）在兩組中含量均較高，且AS組中單核細(xì)胞（Monocytes）含量高于正常組。圖4B顯示，免疫細(xì)胞比例箱圖中進(jìn)一步展示了22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例。

圖4 AS 組與正常組中免疫相關(guān)細(xì)胞的浸潤(rùn)組成

2.5 免疫細(xì)胞間相關(guān)性分析 未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞（T cells CD4 memory resting）與γδT細(xì)胞（T cell gamma delta）呈中度正相關(guān)（r=0.52），CD8+T細(xì)胞（T cells CD8）與活化的自然殺傷細(xì)胞（NK cell activated）呈中度正相關(guān)（r=0.51），而CD8+T細(xì)胞（T cells CD8）與中性粒細(xì)胞（Neutrophils）呈中度負(fù)相關(guān)（r=-0.65），初始CD4+T細(xì)胞（T cells CD4 naive）與未活化的CD4+記憶性T細(xì)胞（T cells CD4 memory resting）呈中度負(fù)相關(guān)（r=-0.69）。（見(jiàn)圖5）

圖5 AS 組中免疫細(xì)胞間的相關(guān)性分析

2.6 AS組與正常組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異分析 通過(guò)小提琴圖對(duì)不同組織樣本免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異分析進(jìn)行可視化，以P＜0.05為顯著差異性。結(jié)果顯示，AS組血清中單核細(xì)胞（Monocytes）明顯多于正常組（P=0.002），而正常組血清中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T cells regulatoy，Tregs）明顯少于AS組（P=0.03）。（見(jiàn)圖6）

圖6 AS 組與正常組間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異分析小提琴圖

2.7 關(guān)鍵差異樞紐基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平關(guān)系的相關(guān)性分析 將AS關(guān)鍵樞紐基因與上述所得差異性顯著的免疫細(xì)胞（單核細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）進(jìn)行相關(guān)性分析，對(duì)相關(guān)性較為顯著的基因進(jìn)行展示。結(jié)果顯示，SNRPG（r=-0.26）、LSM3（r=-0.14）、PSMA6（r=-0.27）、MRPL22（r=-0.18）與單核細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），但相關(guān)性較弱；SNRPG（r=-0.30）、LSM3（r=-0.16）、PSMA6（r=-0.20）、MRPL22（r=-0.16）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），但相關(guān)性較弱。（見(jiàn)圖7）

圖7 AS 關(guān)鍵樞紐基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)性分析

2.8 干預(yù)AS免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)生物途徑的中藥及復(fù)方預(yù)測(cè)通過(guò)Coremine Medical及本草組鑒預(yù)測(cè)具有潛在治療作用的中藥。圖8顯示了AS核心差異靶基因及相關(guān)免疫反應(yīng)生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的中藥，其中雷公藤、蜈蚣、冬蟲(chóng)夏草、紅花、人參、銀杏葉等度值較高，與AS相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系最密切。藥物歸經(jīng)多歸為肝、腎、肺經(jīng)，如圖9A所示；功效多與清熱補(bǔ)虛及祛風(fēng)濕相關(guān)，如圖9B所示。表2為AS免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)生物途徑的中藥復(fù)方預(yù)測(cè)結(jié)果，涉及補(bǔ)腎活血湯、化痰逐瘀散結(jié)湯、寄生湯等多種方劑，功效多為補(bǔ)腎健脾、活血通絡(luò)，兼祛風(fēng)散寒化痰。

表2 AS 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的中藥復(fù)方預(yù)測(cè)

圖8 AS 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的中藥預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 AS 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的中藥歸經(jīng)功效統(tǒng)計(jì)

3 討論

AS是一種多種復(fù)雜因素誘發(fā)的疾病，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，AS的診斷與治療已獲得了飛速的發(fā)展，但由于其病因的不確切性，目前尚無(wú)治愈的療法[14]。因此深入研究AS的發(fā)病機(jī)制，為AS的治療提供潛在的靶點(diǎn)對(duì)于AS的診治具有重要意義。本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選合適的基因芯片，比較正常人群與AS患者血清樣本的基因表達(dá)譜，得到差異基因并通過(guò)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作獲得其核心靶基因。核心靶基因分別是SNRPG、LSM3、PSMA6、MRPL22、RPL26、COX7C、PSMA4、RPS17、RPL31、SLIRP、NDUFS5、RPS24、NDUFB3、SRP14。有研究表明SNRPG與腸道中巨噬細(xì)胞活化相關(guān)[15]，而產(chǎn)生巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）的巨噬細(xì)胞在AS患者腸道中富集，MIF在AS患者的關(guān)節(jié)液中處于高水平，由此推測(cè)SNRPG干預(yù)AS的機(jī)制可能與激活腸道中MIF相關(guān)。LSM3基因在AS患者中表達(dá)下降，LSM3基因作為預(yù)催化的前體參與前體mRNA剪接，而前體mRNA在加工和剪接過(guò)程中可能會(huì)影響AS患者其他基因的表達(dá)[16]。PSMA4、PSMA6基因是蛋白酶體功能所需的20S蛋白酶體核心，蛋白酶體復(fù)合物是一種蛋白水解系統(tǒng)，通過(guò)主要組織相容性復(fù)合物在AS適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。MRPL22在細(xì)胞質(zhì)中生成，屬于基因編碼線粒體核糖體蛋白的成員，對(duì)線粒體氧化磷酸化至關(guān)重要，且在AS中調(diào)節(jié)凋亡誘導(dǎo)因子方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用[18]。RPL26通常構(gòu)成參與核糖體亞基翻譯的細(xì)胞過(guò)程，而敲低該基因的表達(dá)，能使成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路去磷酸化，進(jìn)一步降低AS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因的轉(zhuǎn)錄[19]。COX7C是細(xì)胞色素氧化酶（COX）的組成部分[20]。這對(duì)能量的生產(chǎn)至關(guān)重要，與本研究中的KEGG富集分析中的核糖體生物發(fā)生、氧化磷酸化密切相關(guān)，并且MRPL22、RPS17、RPL31、NDUFS5、RPS24等核糖體相關(guān)蛋白可能與AS發(fā)病的能量代謝有關(guān)。而其他基因尚缺乏與AS相關(guān)的研究，可能是AS的潛在治療靶點(diǎn)，需進(jìn)一步發(fā)掘驗(yàn)證。本研究中差異基因蛋白互作中的部分樞紐基因有AS的相關(guān)基礎(chǔ)研究的結(jié)果支持，進(jìn)一步說(shuō)明了本研究預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，但其他基因的表達(dá)或功能在AS的發(fā)病基礎(chǔ)研究中鮮有提及。這些基因可能為AS診斷和治療靶點(diǎn)的研究提供新的思路。

本研究進(jìn)一步對(duì)AS相關(guān)差異基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析。結(jié)果顯示，差異基因的生物學(xué)過(guò)程不僅有T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)參與，還有更為豐富的中性粒細(xì)胞活化介導(dǎo)的相關(guān)免疫反應(yīng)，包括中性粒細(xì)胞趨化性、中性粒細(xì)胞脫粒等生物過(guò)程。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AS是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，尤其是CD4+T細(xì)胞的紊亂在其病程的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，最近的研究表明，先天免疫細(xì)胞在炎癥和新骨形成過(guò)程中也很重要，而中性粒細(xì)胞越來(lái)越被認(rèn)為是自身炎癥和自身免疫性疾病的介質(zhì)[21]，且中性粒細(xì)胞通過(guò)諸如TLR受體、吞噬、脫顆粒和活性酶的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)上述過(guò)程，即細(xì)胞以網(wǎng)狀物的形式釋放其染色質(zhì)[22]。NF-κB介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)在AS中發(fā)揮著樞紐作用，Th1/Th2的平衡在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。I-κB激酶的激活使得NF-κB的抑制作用解除，從而激發(fā)不同Th因子的合成和釋放，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫紊亂[23]。白細(xì)胞介素-1（IL-1）介導(dǎo)的信號(hào)通路在AS差異基因的富集上也表現(xiàn)出良好的聚集性。IL-1由炎癥滑膜中活化的巨噬細(xì)胞分泌，能啟動(dòng)免疫細(xì)胞的募集和炎癥反應(yīng)。有研究顯示，IL-1多態(tài)性與AS易感性相關(guān)，IL-1基因簇中的IL-1A、IL-1B和IL-1RN可觸發(fā)AS先天性免疫反應(yīng)[24]。除此之外，AS的差異基因KEGG通路富集中涉及核糖體生物發(fā)生、氧化磷酸化等相關(guān)通路，與代謝、炎癥反應(yīng)相關(guān)通路聯(lián)系密切。

本研究利用CIBERSORT反卷積算法探索免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在AS發(fā)病機(jī)制的作用，結(jié)果顯示，AS組患者血清中單核細(xì)胞較正常組明顯增多，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則明顯減少。Treg主要分為胸腺來(lái)源的Treg細(xì)胞（tTreg）及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（iTreg），其是CD4+T細(xì)胞的一小部分，在維持免疫耐受和自身免疫方面起著關(guān)鍵作用[25]。Treg在AS中的含量變化是有爭(zhēng)議的，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為T(mén)reg比例下降是誘發(fā)AS重要因素，其機(jī)制可能為AS患者Treg細(xì)胞中STAT5磷酸化相對(duì)較少，F(xiàn)OXP3的平均熒光強(qiáng)度降低，導(dǎo)致Treg細(xì)胞不能有效抑制幼稚T細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的進(jìn)展[26]。單核細(xì)胞是專(zhuān)業(yè)抗原提呈細(xì)胞的前體。有研究顯示，AS患者的血單核細(xì)胞的微陣列分化標(biāo)記物上調(diào)，與正常單核細(xì)胞相比，AS單核細(xì)胞參與了多種炎癥途徑的蛋白質(zhì)水平升高[27]。免疫浸潤(rùn)相關(guān)性分析結(jié)果中顯示，CD8+T細(xì)胞與活化的自然殺傷細(xì)胞呈中度正相關(guān)性。在一項(xiàng)AS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群變化規(guī)律的研究中，其N(xiāo)K細(xì)胞含量伴隨T細(xì)胞顯著升高，表明AS的免疫亢進(jìn)伴有非特異性[28]。γδT細(xì)胞介于固有免疫與獲得性免疫之間，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究中，CD4+記憶性T細(xì)胞與γδT細(xì)胞呈中度正相關(guān)，說(shuō)明兩者在AS的發(fā)病中發(fā)揮協(xié)同作用。而CD8+T細(xì)胞與中性粒細(xì)胞呈中度負(fù)相關(guān)性的基礎(chǔ)研究尚缺乏大規(guī)模的驗(yàn)證，故本預(yù)測(cè)具有一定程度的參考意義。

AS在中醫(yī)學(xué)屬“大僂”“僂痹”等范疇。病機(jī)為五臟內(nèi)傷、外感六淫，又以肝腎虧虛、督脈虛空為要，病性多為本虛標(biāo)實(shí)[29]。中醫(yī)藥治療AS療效穩(wěn)固且持久，對(duì)于調(diào)節(jié)患者免疫失衡具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本課題組通過(guò)Coremine Medical及本草組鑒預(yù)測(cè)具有潛在治療作用的中藥，其中雷公藤、蜈蚣、冬蟲(chóng)夏草等出現(xiàn)的頻數(shù)較高且度值較高，提示與AS相關(guān)免疫浸潤(rùn)的關(guān)系最密切。藥物歸經(jīng)多歸肝、腎、肺經(jīng)，功效多與清熱補(bǔ)虛及祛風(fēng)濕相關(guān)，此與AS的病機(jī)相符。其中雷公藤中的主要成分雷公藤甲素在體外可減少膠原形成、堿性磷酸酶活性和鈣沉積，其對(duì)AS的免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到證實(shí)。雷公藤甲素可能通過(guò)上調(diào)外周血中的CD4+CD25+CD127+Treg和下調(diào)IL-17來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[30-31]。蜈蚣在骨痹的治療中使用頻率較高，因其走竄力強(qiáng)，臟腑經(jīng)絡(luò)及氣血不通之處皆能通之，并且蜈蚣在關(guān)節(jié)炎的局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)中表現(xiàn)為顯著的抑炎反應(yīng)及軟骨的保護(hù)作用[32]。冬蟲(chóng)夏草素目前尚缺乏在AS免疫調(diào)節(jié)方面的基礎(chǔ)研究，但其在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中有著顯著的平衡免疫的功能，具體機(jī)制為調(diào)控MMP-3、TIMP-1而抑制炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-10，進(jìn)而平衡Ⅱ型膠原免疫紊亂[33]。在方劑預(yù)測(cè)中，補(bǔ)腎活血湯、寄生湯中多數(shù)藥物與預(yù)測(cè)中藥相符合。有臨床研究表明，補(bǔ)腎活血湯能顯著改善AS患者的疼痛、晨僵不適及活動(dòng)性炎性指標(biāo)[34]，且有報(bào)道稱補(bǔ)腎活血湯含藥血清對(duì)CD4+CD25+Treg增殖具有明顯促進(jìn)作用[35]。而在本研究中，樞紐差異基因SNRPG、LSM3、PSMA6、MRPL22與Tregs呈患者負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性較弱。故筆者推測(cè)，上述靶基因可能作為補(bǔ)腎活血湯干預(yù)AS免疫浸潤(rùn)相關(guān)機(jī)制的靶點(diǎn)，但需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究局限之處在于數(shù)據(jù)分析來(lái)源依賴于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中所納入的AS探針樣本，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而單一芯片納入樣本的數(shù)量局限可能造成偏倚。總之本課題組利用生物信息學(xué)方法對(duì)AS的免疫浸潤(rùn)機(jī)制進(jìn)行分析并預(yù)測(cè)相關(guān)生物途徑所涉及的中藥及復(fù)方，對(duì)于后續(xù)研究及臨床用藥具有參考意義。