張 凈，張陽利，尹圓圓，張林聰，郭家彬，劉密鳳

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.中國人民解放軍疾病預防控制中心，北京 100071）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以炎癥和骨損傷為主要特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，全世界患病率平均為0.5%～1.0%[1]，臨床表現(xiàn)為關節(jié)功能下降、腫脹、疼痛。RA降低了患者的生活質(zhì)量，且危害患者健康。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是治療類風濕關節(jié)炎的臨床一線用藥，可以有效抑制炎癥，減輕骨破壞，但長期使用可能會導致嚴重的全身并發(fā)癥，造成胃、腸、血液系統(tǒng)、肝、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)多器官損傷[2-6]。MTX還具有生殖系統(tǒng)毒性，可引起卵母細胞缺乏和精子減少，生育能力減退。另外，30%～40%的早期RA患者中，單一MTX治療無法有效抑制炎癥和降低疾病活動度，需聯(lián)合使用其他緩解病情抗風濕藥物（DMARD）或生物制劑[7]。因此，尋找安全有效的治療方法是一個亟待解決的問題。

中醫(yī)學認為類風濕關節(jié)炎屬于“痹證”范疇。《素問·痹論篇》指出：“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹”。北京中醫(yī)醫(yī)院風濕科國家級老中醫(yī)藥專家王為蘭認為，類風濕關節(jié)炎多因風寒濕邪內(nèi)侵或內(nèi)生濕邪，久蘊不解，化熱傷陰，灼津釀毒，熱毒濕濁瘀滯，痹阻經(jīng)隧，致成痹熱。王為蘭據(jù)此創(chuàng)立了清熱養(yǎng)陰除濕湯，該方由半枝蓮、虎杖、金銀花、連翹等組成，具有清熱解毒、化濁除濕、通督止痛之功。該方最早應用于治療類風濕關節(jié)炎急性期，后逐漸推廣用于治療強直性脊柱炎、痛風等多種風濕病急性期[8]。前期研究顯示其抗炎、鎮(zhèn)痛作用良好[9]。清熱養(yǎng)陰除濕湯作為我院臨床使用的有效方劑，其藥效學機制尚不明確。代謝組學通過現(xiàn)代高通量分析技術對生物體內(nèi)產(chǎn)生的代謝物進行分析，可以更好地了解并確定藥物中的小分子代謝物及代謝途徑。本研究利用膠原誘導性關節(jié)炎模型（collagen-induced arthritis，CIA），通過代謝組學技術尋找差異性代謝物，擬探討清熱養(yǎng)陰除濕湯治療RA的藥效學機制。

1 材 料

1.1 實驗動物6～8周齡健康SPF級Wistar大鼠24只，雌雄各半，購于北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證編號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物質(zhì)量合格證號：1100111911046320。所有大鼠均在SPF級動物房中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（24±2）℃，濕度（50±2）%，12 h周期光照，實驗期間動物自由飲食水，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。實驗結(jié)束后用1%戊巴比妥鈉麻醉取材。動物實驗方案經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)院倫理委員會批準。所有動物實驗均按照中華人民共和國衛(wèi)生部出版的《動物護理和使用指南》（1998年1月）進行。

1.2 藥物與試劑清熱養(yǎng)陰除濕湯組方中白花蛇舌草、金銀花、連翹、半枝蓮、虎杖、生地黃、白鮮皮、桂枝、忍冬藤、牡丹皮（報告書編號分別為：C20190627-01，C20190326-02，C20181228-01，C20190725-01，C20190703-04，C20190723-01，C20190312-02，C20190530-02，C20190412-01，C20190517-15）均由北京杏林藥業(yè)有限責任公司檢驗；制川烏（報告書編號：DX-C2019081901）由北京華邈藥業(yè)有限公司檢驗；土茯苓（報告書編號：C201805023）由北京太洋樹康中藥飲片廠檢驗，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定標準。中藥材統(tǒng)一由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，以中藥煎煮機統(tǒng)一制成煎劑；甲氨蝶呤（MTX）（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：H31020644）；弗氏不完全佐劑（批號：7002）、牛Ⅱ型膠原（批號：20022）均購自美國Chondrex.Inc公司；甲醇（批號：67-56-1）、乙腈（批號：75-05-8）均購自美國Thermo公司；甲酸（日本TCI公司，批號：64-18-6）；甲酸銨（美國Sigma公司，批號：540-69-2）；L-纈氨酸（批號：81201-85-6）、L-苯丙氨酸（批號：81201-86-7）、尿嘧啶（批號：35803-45-3）、D-果糖（批號：108311-21-3）、維生素B3（批號：66148-15-0）、氯化膽堿（批號：61037-86-3）均購自美國CIL公司；N-（Carboxymethyl)-N,N,N-trimethyl-d9-ammonium Chloride（批號：285979-85-3）、L-carnitine-d3 HCl（批號：350818-62-1）均購自加拿大CDN公司。

1.3 主要儀器UltiMate 3000液相色譜儀（美國Thermo公司）；Q Exactive型質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）；H1850-R型冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；QL-866型混勻儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；5305型真空濃縮儀（德國Eppendorf公司）；FSH-2A型高速勻漿機（常州市億能實驗儀器廠）。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型制備參照文獻[10]建立大鼠CIA模型。將等體積的牛Ⅱ型膠原溶液和不完全弗氏佐劑在冰浴上用高速勻漿機（15 000 r/min）充分混勻制備乳劑，濃度為1 mg/mL，并于制備后1 h內(nèi)使用。將大鼠分為造模組和對照組。造模組大鼠尾部皮下注射0.2 mL乳劑進行初次免疫，7 d后繼續(xù)注射0.1 mL乳劑加強免疫。對照組大鼠相同部位注射等量生理鹽水。大鼠致敏后第7天開始，每周觀察大鼠四肢關節(jié)病變程度，進行關節(jié)炎指數(shù)評價。根據(jù)病變程度累計積分，按5級評分方法計算關節(jié)炎指數(shù)。評分標準如下，0分：正常；1分：小趾紅腫；2分：趾關節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關節(jié)以下足爪腫脹；4分：包括踝關節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。將各個關節(jié)的積分累計得出每只大鼠的關節(jié)炎指數(shù)[10]。初次免疫14 d后，關節(jié)炎指數(shù)〉4分的大鼠視為造模成功。

2.2 分組及給藥造模成功的大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、甲氨蝶呤組和清熱養(yǎng)陰除濕湯組，每組6只。另選取6只大鼠作為對照組。對照組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，10 mL/kg，1次/d，連續(xù)5周。清熱養(yǎng)陰除濕湯組大鼠給予清熱養(yǎng)陰除濕湯劑灌胃，17 g/kg，1次/d，連續(xù)5周。甲氨蝶呤組大鼠給予甲氨蝶呤片溶液灌胃，0.625 mg/kg，2次/周，連續(xù)5周。藥物干預5周后，1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后腹主動脈取血，離心分離并提取上層血清，-80℃保存待測。

2.3 代謝物提取[11]取100 μL大鼠血清樣本至2 mL離心管中；加入100 μL內(nèi)標混標和400 μL甲醇，渦旋振蕩1 min；4℃12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL至2 mL離心管中真空濃縮干燥；加入150 μL 80%甲醇溶液復溶，充分混勻后4℃12 000 r/min再次離心10 min，取上清液作為待測樣本。

2.4 色譜條件[12]使用ACQUITY UPLCRHSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）色譜柱，自動進樣器溫度設為8℃，流速為0.25 mL/min，柱溫為40℃，進樣體積為2 μL。程序設置為梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；負離子5mmol/L甲酸銨水（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序為0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98% B/D；12～13.5 min，98% B/D；13.5～14 min，98%～2% B/D；14～20 min，2% D-正模式（14～17 min，2% B-負模式）。

2.5 質(zhì)譜條件[12]儀器使用Thermo Q Exactive，電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣為30 arb，輔助氣為10 arb。毛細管溫度為325℃，以分辨率為70 000進行全掃描，掃描范圍81～1 000，并采用HCD進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析代謝組學數(shù)據(jù)經(jīng)Proteowizard軟件（v3.0.8789）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式，并采用R（v3.3.2）的XCMS程序包對上述數(shù)據(jù)進行過濾及歸一化[13]。使用SIMCA-P（v13.0）（Umetrics，Umea，Sweden）進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）)和正交-偏最小二乘判別（OPLS-DA）分析[14]。篩選OPLS-DA分析中VIP值≥1.0，且組間差異有統(tǒng)計學意義（P≤0.05）的化合物，通過METLIN數(shù)據(jù)庫（http://metlin.scripps.edu）鑒定代謝物，Metabo Analyst軟件進行代謝通路分析[15]。計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行Kruskal-Wallis H檢驗及多重比較分析，P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠血清代謝物分析采用LC-MS/MS技術對4組大鼠血清樣品進行檢測。質(zhì)量控制（quality control，QC）樣品中的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）〈30%的特征峰比例均達到70%以上，說明數(shù)據(jù)良好[16]。（見圖1）經(jīng)色譜分離流出的組分不斷進入質(zhì)譜，質(zhì)譜連續(xù)掃描進行數(shù)據(jù)采集。每一次掃描得到一張質(zhì)譜圖，將每一張色譜圖中各個時刻點選擇譜圖中最強的離子連續(xù)描繪，以離子強度為縱坐標，時間為橫坐標，得到基峰色譜圖（Base peak chromatogram，BPC）。正負離子模式下各組大鼠血清的基峰圖見圖2。正離子模式獲得7 416個前體分子（precursor molecule），負離子模式獲得5 594個前體分子?；迳V圖顯示4組大鼠之間代謝產(chǎn)物存在明顯差異。

圖1 質(zhì)量保證結(jié)果圖

圖2 正離子（A）和負離子（B）模式下各組大鼠血清樣品基峰圖

3.2 潛在生物標志物的鑒定對各組采集的多維數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析、數(shù)據(jù)建模及差異代謝物篩選。選取OPLS-DA模型中投影重要度（VIP）≥1.0，且Kruskal-Wallis檢驗（P≤0.05）的變量為差異代謝物，對不同組別差異代謝物進行篩選。與對照組比較，模型組中（R）-3-羥基丁酸、硫酸鹽、L-絲氨酸、胸腺嘧啶、N-甲基酪胺、嘧啶二氮艸卓、13-L-氫過氧化亞油酸、共軛亞油酸、抗壞血酸、L-蘋果酸、3-羥基鄰氨基苯甲酸酯、肌醇、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖等14種差異代謝物上調(diào)，豆蔻酸、琥珀酸、5-羥基吲哚乙酸3種差異代謝物下調(diào)。清熱養(yǎng)陰除濕湯可下調(diào)（R）-3-羥基丁酸、L-絲氨酸、嘧啶二氮艸卓、抗壞血酸、L-蘋果酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖水平；甲氨蝶呤可下調(diào)L-絲氨酸、共軛亞油酸、抗壞血酸、L-蘋果酸水平。其中L-絲氨酸、抗壞血酸、L-蘋果酸為清熱養(yǎng)陰除濕湯和甲氨蝶呤共有的差異代謝物。（見表1）

表1 各組大鼠血清潛在差異代謝物分析

3.3 代謝通路分析借助MetaboAnalyst 4.0（http://www.metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫對鑒別出的潛在生物標志物進行代謝通路富集分析。在KEGG數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)-log（P）〉0.5且Pathway impact〉0.1篩選出9條與RA最為相關的代謝通路，包括癌癥、腎癌、AMPK信號通路、氧化磷酸化、亞油酸代謝、硫代謝、甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸代謝、丁酸代謝、酮體合成和降解。各條代謝通路對應的代謝物見表2。甲氨蝶呤和清熱養(yǎng)陰除濕湯干預與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氧化磷酸化，丁酸代謝，癌癥途徑，以及腎細胞癌5種代謝途徑有關。此外，MTX干預還可引起亞油酸代謝、硫代謝途徑改變；清熱養(yǎng)陰除濕湯可引起AMPK信號通路、酮體的合成與降解代謝途徑改變。（見圖3～5）清熱養(yǎng)陰除濕湯和甲氨蝶呤干預存在5種不同的差異代謝物[主要包括（R）-3-羥基丁酸、嘧啶二氮艸卓、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖、共軛亞油酸]和4條差異代謝通路（包括AMPK信號通路、亞油酸代謝、硫代謝和酮體合成和降解）。

圖3 代謝通路影響因子柱狀圖（模型組VS對照組）

表2 大鼠差異代謝物通路分析

圖4 代謝通路影響因子柱狀圖（甲氨蝶呤組VS模型組）

圖5 代謝通路影響因子柱狀圖（清熱養(yǎng)陰除濕湯組VS模型組）

4 討 論

RA的主要特征是滑膜關節(jié)的慢性炎癥和關節(jié)軟骨破壞[17]。遺傳易感性、環(huán)境因素觸發(fā)的針對滑膜和軟骨成分的致病性自身免疫炎癥反應，以及免疫炎癥細胞浸潤并誘導滑膜細胞向自主增殖細胞轉(zhuǎn)化、炎癥細胞因子生成失調(diào)是引發(fā)RA的主要因素[18-19]。這些因素提示，細胞因子介導的炎癥過程在RA進程中具有重要作用，并且這種炎癥過程能夠引起新陳代謝改變[20-21]。代謝途徑對單細胞和多細胞生物的發(fā)育具有深遠影響。代謝物通過抗原受體和共刺激分子、生長因子、激素、細胞因子、環(huán)境因子和其他調(diào)節(jié)信號等機制影響免疫系統(tǒng)發(fā)育。先天性和適應性免疫系統(tǒng)中細胞的異質(zhì)性取決于代謝物的供應。代謝組學技術與高通量、高分辨率分析技術和多元數(shù)據(jù)分析方法相結(jié)合，通過建立代謝物含量變化與生物表型變化之間的關系，可揭示疾病發(fā)生和發(fā)展的代謝機制[22]，廣泛用于復方中藥的機制研究。CIA模型是一種經(jīng)典的臨床前模型，與人類RA的發(fā)病機制最為相似[23]。為了解清熱養(yǎng)陰除濕湯治療類風濕關節(jié)炎的代謝機制，本研究以CIA大鼠為模型，利用血清代謝組學方法探討了清熱養(yǎng)陰除濕湯治療CIA大鼠后差異代謝物和代謝通路的變化。

本研究結(jié)果表明，與對照組比較，模型組大鼠存在17種差異代謝物（P〈0.05），涉及9條代謝通路（P〈0.05）。清熱養(yǎng)陰除濕湯可下調(diào)（R）-3-羥基丁酸、L-絲氨酸、嘧啶二氮艸卓、抗壞血酸、L-蘋果酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、1，6-二磷酸果糖等7種差異代謝物水平（P〈0.05），涉及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氧化磷酸化，丁酸代謝，癌癥途徑，腎細胞癌，AMPK信號通路，以及酮體合成和降解7種代謝途徑（P〈0.05）。絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸參與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子合成，有助于免疫球蛋白和抗體的產(chǎn)生，參與免疫和抗炎、抗氧化功能[24-27]。L-絲氨酸是甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝的中間產(chǎn)物，清熱養(yǎng)陰除濕湯治療后L-絲氨酸水平下降，提示清熱養(yǎng)陰除濕湯可能通過調(diào)節(jié)絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸代謝通路治療RA。酮體的新陳代謝是生理動態(tài)平衡的中心節(jié)點，是炎癥和氧化應激調(diào)節(jié)劑，在細胞代謝、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和信號傳導中具有重要作用[28-29]。（R）-3-羥基丁酸是酮途徑的代謝產(chǎn)物，可以恢復能量代謝、改變氧化還原狀態(tài)[30]。清熱養(yǎng)陰除濕湯治療后（R）-3-羥基丁酸水平降低，提示清熱養(yǎng)陰除濕湯可通過調(diào)節(jié)酮體合成和降解治療RA。此外，（R）-3-羥基丁酸也是丁酸代謝通路中的代謝物，調(diào)節(jié)丁酸代謝可以增強機體免疫力，抑制炎癥反應[31]。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是一種AMP依賴性蛋白激酶，是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關鍵分子，參與機體的多種代謝反應過程。當機體出現(xiàn)多種應激反應狀況時，如缺氧、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)或者在運動過程中時，AMP/ATP比值升高，AMPK激活從而啟動AMPK激活酶系統(tǒng)，關閉ATP損耗路徑和同時開啟產(chǎn)生途徑，所以AMPK信號通路又被稱為“細胞能量監(jiān)測器”[32]。在低ATP條件下，AMPK被招募到溶酶體的細胞質(zhì)表面，并阻斷mTOR復合物1（mammalian target of rapamycin complex1,mTORC1）激活，促進分解代謝途徑，導致細胞生長減緩和蛋白質(zhì)合成減少[33-34]。AMPK還可以通過調(diào)控下游靶點乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）調(diào)控脂肪酸的合成過程。AMPK信號通路通過調(diào)控細胞能量代謝過程而影響宿主對病原體感染的防御機制[32，35-36]。AMPK的激活可以抑制JAK-STAT依賴的信號通路，這也是RA相關事件的主要原因[37]。由于能量傳感器AMPK障礙[38]，RA-T細胞在平衡分解代謝和合成代謝方面存在缺陷，并偏離了細胞構建程序。

1，6-二磷酸果糖（Fructose 1,6-bisphosphate，F(xiàn)BP）是細胞糖酵解過程的一種內(nèi)源性中間體，由6-磷酸果糖磷酸化而產(chǎn)生，是葡萄糖氧化過程中的重要調(diào)節(jié)點[39]。1，6-二磷酸果糖含量變化提示CIA大鼠糖酵解作用增強。糖酵解分解中的關鍵事件是通過6-磷酸果糖-1-激酶（PFK1）將6-磷酸果糖磷酸化為1,6-二磷酸果糖，這是一種不可逆的反應，使葡萄糖參與糖酵解。PFKFB3對糖酵解速率起著關鍵性的調(diào)節(jié)作用。RA-T細胞在活化后不能上調(diào)PFKFB3，可抑制糖酵解分解并限制丙酮酸/乳酸的產(chǎn)生[40-41]。相反，RA-T細胞轉(zhuǎn)錄上調(diào)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）后，可將葡萄糖轉(zhuǎn)移到磷酸戊糖途徑（PPP）。PFK/G6PD平衡失調(diào)導致NADPH過量產(chǎn)生和還原型谷胱甘肽的積累，從而形成一個還原性的細胞內(nèi)環(huán)境[42-43]。這種氧化還原穩(wěn)態(tài)的根本性改變明顯干擾了對能量狀態(tài)的正確感知。因此，這種代謝適應不是T細胞適應炎癥組織環(huán)境的結(jié)果。相反，其是T細胞侵入周圍組織，定植并驅(qū)動相應部位炎癥的途徑，是代謝重編程的結(jié)果之一。T細胞適應性的關鍵因素是它們對細胞內(nèi)能量資源和代謝活性的高效感應[44]。RA患者存在糖代謝異常、胰島素抵抗，多種糖酵解酶活性增強可能與RA的發(fā)病機制密切相關[45]。T細胞將葡萄糖從糖酵解分解中轉(zhuǎn)移到戊糖磷酸途徑，以提供生物合成前體，并上調(diào)脂肪生成，從而實現(xiàn)細胞運動性和組織侵襲性。RA患者T細胞顯示出獨特的代謝特征，其代謝異常都與異常細胞行為有關。RA患者代謝異常可影響原始CD4+T細胞群，是導致RA患者自身耐受性喪失的可能初始因素之一。T細胞出現(xiàn)線粒體功能缺陷后，由于線粒體DNA修復不足，導致線粒體耗氧量低，ATP生成受損。受損的線粒體DNA逃逸到細胞質(zhì)中，被認為是一種危險相關分子模式（danger associated molecular pattern，DAMP）。炎癥小體的組裝和Caspase-1的激活可導致T細胞焦亡，并引發(fā)強烈的組織炎癥。細胞代謝在促進免疫細胞功能中起著不可或缺的作用。T細胞自身免疫效應功能依賴于細胞能量的特定代謝途徑。清熱養(yǎng)陰除濕湯可能通過調(diào)節(jié)FBP和AMPK信號通路來調(diào)整和恢復T細胞紊亂的能量代謝、生物合成及氧化還原狀態(tài)，可以使其從慢性炎癥狀態(tài)恢復到正常穩(wěn)態(tài)，從而減輕炎癥反應緩解疾病。