詹東昂 柯峰 楊超 劉華

肝纖維化是對一系列慢性肝損傷的愈合反應，主要特征為細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）過度沉積并最后發(fā)展為肝硬化[1]。肝星狀細胞被激活后增殖，大量分泌ECM導致肝纖維化發(fā)生[2]。miRNA為小分子非編碼RNA，長度約21～25個堿基，廣泛參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡及機體炎癥反應等多種生命活動[3-5]。相關研究報道m(xù)iRNA參與調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生，如馬艷華等[6]研究表明健康人與肝纖維化患者的血漿樣本中存在104個差異miRNA，其中72個表達下調(diào)，包括miR-450b-5p、miR-455-5p等，32個miRNA表達上調(diào)，包括miR-16-5p、miR-182-5p等；冉龍嬌等[7]也發(fā)現(xiàn)在肝星狀細胞的活化及肝纖維化過程中，均有多種miRNA出現(xiàn)差異表達，或上調(diào)或下調(diào)。通過靶基因預測在線分析發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p可能與程序性死亡受體-1（programmed cell death-1,PD-1）存在結合位點，PD-1及其配體PD-L1（CD274）屬于負共刺激分子，主要參與調(diào)控多種腫瘤及自身免疫性疾病的免疫逃逸過程，抑制免疫應答的激活，目前作為腫瘤等治療的重要免疫檢查點[8]。相關研究表明，抑制PD-1/PD-L1表達與治療自身免疫性肝炎密切相關[9]。因此推測miR-16-5p可能介導PD-L1表達參與調(diào)控活化的肝星狀細胞及炎癥反應。本實驗以大鼠肝星狀細胞HSC-T6為研究對象，探討miR-16-5p是否參與調(diào)控PD-L1表達而影響肝星狀細胞生理形態(tài)及炎癥水平，以期為臨床上治療肝纖維化及炎癥提供可能的治療靶點，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料 肝星狀細胞HSC-T6（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：SH30022.01B）；FBS（美國 Gibco公司，批號：10270-106）；PBS（批號：P1010）、胰蛋白酶（批號：T1350）和濃度測定試劑盒（批號：PC0020）均來自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑（美國Ambion公司，批 號 ：15596026）；轉 化 生 長 因 子 β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1，英國Abcam公司）；CCK-8試劑盒（中國Solarbio公司，批號：CA1210）；蛋白質(zhì)Marker（美國Helix公司，批號：P12103）；PVDF轉移膜和化學發(fā)光試劑（中國Millipore公司，批號：IPVH00010）；鼠抗細胞PD-L1抗體、兔抗NF-κB抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體 、羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（中國Bioswamp公司）；兔抗磷酸化的NF-κB（nuclear factor kappa B,p-NF-κB）抗體（中國CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組及處理 HSC-T6細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，均按照1∶2～1∶4進行傳代。將細胞分為6組并分別處理：對照組、模型組（5 ng/ml TGF-β1處理48 h）、miR-16-5p超表達組（轉染miR-16-5p mimics 24 h后，再用 5 ng/ml TGF-β1處理48 h）、miR-16-5p抑制組（轉染miR-16-5p inhibitor 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1處理48 h）、超表達-空載組（轉染mimics-NC 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1處理48 h）和抑制-空載組（轉染inhibitor-NC 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1處理48 h）。

1.2.2 細胞轉染 將 100 pmol miRNA、5 μl Lipofectamine 2000分別稀釋于250 μl Opti-MEM中，混勻后，將兩者混合液室溫孵育20 min，然后將其加入到融合度為90%的細胞中，37℃、5%CO2轉染4 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，測定miR-16-5p的表達水平以觀察轉染效果。

1.2.3 各組細胞 TNF-α、IFN-γ、miR-16-5p、PD-L1、IL-6、IL-10 mRNA表達水平檢測 采用RT-qPCR法。加入TGF-β1處理48 h收集細胞，用Trizol法提取各組細胞總RNA，將mRNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板進行qPCR擴增。反應條件為：95℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40個循環(huán)，其中GAPDH和U6作為內(nèi)參進行樣品間的校正，使用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 各組細胞形態(tài)學觀察 收集各組細胞，稀釋細胞懸液濃度至1×105個細胞/孔，每孔2 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。對照組于正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，模型組、miR-16-5p超表達組、miR-16-5p抑制組、超表達-空載組和抑制-空載組的細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為5 ng/ml的TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72或48 h。取出細胞培養(yǎng)板，光鏡下觀察各組細胞形態(tài)，拍照、收樣。

1.2.5 各組細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將細胞濃度稀釋為3×103個細胞/孔，取100 μl細胞液接種到96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。對照組于正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另外5組細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為5 ng/ml的TGF-β1刺激48 h，然后均加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔450 nm處的吸光值，以吸光值表示細胞增殖能力。同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、CCK-8溶液），每組設定3個復孔。

1.2.6 各組細胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。收集各組細胞，加入適量預冷的1×PBS洗滌后，按照每1×106個細胞加入裂解液200 μl，充分裂解后，取上清液進行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE電泳后，選用90 V轉膜50 min，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加一抗，PD-L1抗體（1∶2 000）、NF-κB抗體（1∶1 000）、p-NF-κB抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜，按照1∶10 000稀釋HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。洗膜，選用ECL化學發(fā)光法顯色，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對照組和模型組細胞形態(tài)學比較 光鏡下觀察可見，對照組和模型組細胞在開始培養(yǎng)時（0 h），細胞形態(tài)和數(shù)量無明顯差異。與對照組同期培養(yǎng)時間相比（24、48、72 h），模型組細胞數(shù)量明顯增多，延展性更好，并且5 ng/ml TGF-β1刺激后，細胞表現(xiàn)為肌纖維細胞形態(tài)的特征。隨著培養(yǎng)時間增加，細胞密度增大，形態(tài)變小，呈現(xiàn)出多邊形的梭形，且相鄰細胞有偽足相連，在培養(yǎng)板表面整齊均勻分布。見圖1。

圖1 對照組和模型組細胞形態(tài)學比較（a、b、c、d：分別為對照組細胞培養(yǎng)0、24、48、72 h；e、f、g、h：分別為模型組細胞培養(yǎng)0、24、48、72 h；×200）

2.2 TGF-β1不同作用時間的模型組細胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達水平比較 與TGF-β1作用0 h相比，TGF-β1作用24 h時的模型組細胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；TGF-β1作用48、72 h時的模型組細胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達水平比較顯著增高（均P＜0.05），且以48 h時最高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 TGF-β1不同作用時間的模型組細胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達水平比較

2.3 各轉染組細胞轉染效果比較 與對照組相比，超表達-空載組和抑制-空載組細胞中miR-16-5p表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；與超表達-空載組相比，miR-16-5p超表達組細胞miR-16-5p表達水平升高（P＜0.05）；與抑制-空載組相比，miR-16-5p抑制組細胞miR-16-5p表達水平降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各轉染組細胞miR-16-5p表達水平比較

2.4 模型組、miR-16-5p超表達組、miR-16-5p抑制組、超表達-空載組和抑制-空載組細胞形態(tài)學比較與模型組相比，miR-16-5p超表達組細胞數(shù)量明顯減少，肌纖維細胞形態(tài)減少；miR-16-5p抑制組細胞數(shù)量明顯增多，形態(tài)無明顯變化；超表達-空載組和抑制-空載組細胞形態(tài)及數(shù)量無明顯差異。見圖4。

圖4 模型組、miR-16-5p超表達組、miR-16-5p抑制組、超表達-空載組和抑制-空載組細胞形態(tài)學比較（a：模型組；b：miR-16-5p超表達組；c：miR-16-5p抑制組；d：超表達-空載組；e：抑制-空載組；×200）

2.5 各組細胞增殖能力比較 與模型組相比，miR-16-5p-超表達組A值明顯降低（P＜0.05），細胞增殖能力下降；miR-16-5p抑制組A值明顯升高，細胞增殖能力增強（P＜0.05）；超表達-空載組和抑制-空載組細胞增殖能力均無明顯變化（均P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞增殖能力比較

2.6 各組細胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平比較 與模型組相比，超表達-空載組和抑制-空載組細胞中PD-L1、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達水平均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）；miR-16-5p超表達組PD-L1蛋白表達水平升高（P＜0.05），p-NF-κB/NF-κB蛋白表達水平降低（P＜0.05）；miR-16-5p抑制組PD-L1蛋白表達水平降低（P＜0.05），p-NF-κB/NF-κB蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達水平比較（a：蛋白表達電泳圖比較；b：PD-L1蛋白表達水平比較；c：p-NF-κB/NF-κB蛋白表達水平比較）

2.7 各組細胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA表達水平比較 與模型組相比，超表達-空載組和抑制-空載組細胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA 表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；miR-16-5p超表達組miR-16-5p、PD-L1、IL-10 mRNA表達水平均升高（均 P＞0.05），TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA 表達水平均降低（均P＞0.05）；miR-16-5p抑制組miR-16-5p、PD-L1、IL-10表達水平均降低（均P＜0.05），TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA表達水平均升高（均P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組細胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA表達水平比較

3 討論

肝星狀細胞分為靜息和激活兩種狀態(tài)，在某些介質(zhì)因素如活性氧物質(zhì)、纖維化細胞因子如TGF-β、血小板源生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）[10]等的刺激下，肝星狀細胞被激活，增殖并轉化為肌成纖維細胞樣細胞（myofibroblast like cells,MFB）[2]。肝星狀細胞的活化屬于級聯(lián)活化模式，肝細胞受損后分泌有絲分裂的作用因子刺激自身細胞增殖，喪失接觸抑制能力，同時與其毗鄰細胞共同作用釋放大量TNF-α、TNF-β、IFN-γ等細胞因子促進肝星狀細胞活化、增殖，另外MFB樣細胞也會自分泌TGF、PDGF等細胞因子促進自身的活化及增殖等[11]。本研究選用TGF-β1刺激HSC-T6細胞0、24、48、72 h，TGF-β1介導的TGF-β/Smad信號通路是肝星狀細胞活化及增生的關鍵環(huán)節(jié)[10]，結果顯示細胞增殖具有時間誘導依賴性，細胞數(shù)量隨藥物處理時間的延長而增多，另外發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激HSC-T6細胞48 h，細胞內(nèi)TNF-α和IFN-γ表達含量顯著升高，這表明TGF-β1處理48 h時，細胞內(nèi)的炎癥反應最強，HSC活化正處于最繁盛時期。因此篩選此時間點為TGF-β1的最佳作用時間。

我國有大量的急性肝炎發(fā)展為慢性炎癥，最終形成肝硬化的病例。肝纖維化的發(fā)展速度受發(fā)病病因、環(huán)境和遺傳因素等的影響[12]。近年來大量文獻表明多種miRNA與肝纖維化的發(fā)生密切相關，miRNA的異常表達參與調(diào)控HSC的活化及肝纖維化相關信號通路[13]。如Lakner等[14]通過miRNA微陣列分析靜息態(tài)HSC被激活后miRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)3種miRNA表達上調(diào)（miR-34c、miR-184和miR-221），8種miRNA表達下調(diào)（miR-16、miR-19a、miR-19b、miR-29a、miR-29c、miR-92a、miR150、miR-194）。本研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細胞被TGF-β1刺激活化后，胞內(nèi)miR-16-5p的表達水平也出現(xiàn)下調(diào)，并且預測的目的靶蛋白PD-1表達水平也明顯下降，與miR-16-5p的表達呈正相關。PD-1是一種免疫共抑制分子，通過負調(diào)控T、B細胞激活而抑制免疫應答，張宏宇等[15]研究表明PD-1通過抑制其表達降低肝細胞損傷，減少炎癥反應，抑制肝炎向肝纖維化的發(fā)展。本研究檢測肝星狀細胞活化后相關炎癥細胞因子，發(fā)現(xiàn)促炎癥因子p-NF-κB/NF-κB、TNF-α、IFN-γ、IL-6表達水平顯著升高，而抗炎因子IL-10表達水平明顯降低。NF-κB可調(diào)控多種炎癥和抗炎因子的表達來調(diào)節(jié)肝星狀細胞的活化、增殖從而影響肝纖維化的發(fā)展[16-17]；IFN-γ和TNF-α在人表皮淋巴管內(nèi)皮細胞的炎癥反應中具有協(xié)同促進PD-L1表達的作用[11]。與之相同，對比模型組，miR-16-5p超表達組細胞內(nèi)miR-16-5p、PD-L1表達上調(diào)，炎癥反應降低，抑制細胞增殖；miR-16-5p抑制組miR-16-5p、PD-L1表達下調(diào)，細胞活化增殖，炎癥反應加劇。

綜上所述，miR-16-5p在激活的肝星狀細胞中的表達水平低于靜息態(tài)細胞，高表達miR-16-5p可促進PD-L1表達上調(diào)，抑制細胞增殖，降低細胞炎癥反應，其作用機制可能參與治療肝纖維化的發(fā)展。