朱怡珂 李定國(guó) 田 勇 余奕穎 田 博 曹 妮 劉 君

(海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199)

魚腥草(Houttuynia cordata thunb)，雙子葉植被三白草科的蕺菜屬，植物學(xué)名稱蕺菜。其揮發(fā)油癸酰乙醛(Decanoylacetal dehyde)，即魚腥草素，是產(chǎn)生魚腥味的主要成分[1]。魚腥草在我國(guó)生長(zhǎng)廣泛，不僅含有各種營(yíng)養(yǎng)元素，還具有多糖、生物堿、有機(jī)酸、黃酮以及揮發(fā)油類等各種藥用成分，是一類富有經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值的藥食同源的野生植物[2，3]。現(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)，魚腥草有止痛、抗菌、耐病毒、抗老化、抗氧化、抗射線、增強(qiáng)機(jī)體免疫、減少應(yīng)激和氧化反應(yīng)、利尿、止血及降血糖等作用[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)以魚腥草為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別利用無菌水、乙醇提取其有效成分，對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，探討魚腥草的不同提取方法對(duì)人體4種常見致病菌的抑菌活性和特性[7]。為魚腥草的進(jìn)一步開發(fā)利用和體外抑菌效果的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮魚腥草地下莖，在海南省?？谑猩礁叽遛r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買。

痢疾志賀氏菌(GDMCC801366)，金黃黃葡萄球菌(GDMCC1.2442)，大腸埃希菌(GDMCC1.737)，傷寒沙門氏菌(GDMCC1.2777)，購(gòu)于廣東微生物菌種保藏中心。

1.2 供試儀器與試劑 GR60DR立式自動(dòng)壓力蒸發(fā)滅菌器[致微(廈門)儀器有限公司]；420-B恒溫水箱(江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司)；HR40-ⅡA2生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)；SW-CJ-1FD清潔控制系統(tǒng)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；FX-200GD電子天平(東莞市穩(wěn)象科技有限公司)等。無水乙醇(HPLC級(jí)，德國(guó)默克公司)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)等。

1.3 提取方法

1.3.1 直接研磨法 稱取20 g洗凈后的新鮮魚腥草，研磨充分，取研磨液密封備用。

1.3.2 水提取法 稱取20 g洗凈后的新鮮魚腥草，加入4 mL無菌水，研磨充分，取研磨液密封備用。

1.3.3 無水乙醇提取法 取20 g洗凈后的新鮮魚腥草，搗碎，然后置于500 mL的圓底燒瓶中，再添加約40 mL的無水乙醇，經(jīng)冷凝回流，水浴加熱3 h(加熱過程在通風(fēng)櫥中完成)，最終將提取物倒入無菌燒杯中置于室溫下自然揮發(fā)24 h，揮發(fā)完全后，加入4 mL的無菌水備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟 用麥?zhǔn)媳葷岱ǖ玫?種菌的0.5濁度菌液，再配比4倍稀釋液、8倍稀釋液。制作直接研磨法、水提取法以及乙醇提取法的魚腥草提取液(物)的藥敏紙片。將每種菌的0.5濁度菌液，4倍和8倍稀釋液分別涂布平板，每個(gè)平板置3種藥敏紙片，對(duì)照組為無菌水藥敏紙片、空白藥敏紙片和空白平板。放入生化培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)8 h。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟3次，得到3組重復(fù)樣本(平行樣本數(shù)為6)。觀察并記錄結(jié)果，測(cè)量抑菌環(huán)的大小。

2 結(jié)果

2.1 魚腥草3種提取方法提取物的抑菌效果 實(shí)驗(yàn)中直接研磨法、水提取法、乙醇提取法的提取物對(duì)大腸埃希菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)有不同程度的抑菌作用，而對(duì)傷寒沙門菌(S.typhi)均沒有觀察到明顯抑制效果。抑菌效果大致上隨菌液濃度增大而減小。見表1。

3種提取方法的提取物對(duì)E.coli的抑制作用均有顯著性差異，且抑制強(qiáng)弱程度依次為：水提取法>直接研磨法>乙醇提取法。直接研磨法的提取物與水提取法的提取物對(duì)S.aureus的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2種方法的提取物均與乙醇提取法的提取物差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抑制強(qiáng)弱程度依次為：水提取法=直接研磨法>乙醇提取法。3種提取方法的提取物對(duì)S.flexner的抑制強(qiáng)弱程度依次為：水提取法=直接研磨法>乙醇提取法。見圖1。

表1 不同提取方法下不同菌種的抑菌環(huán)大小

注：*P≤0.05；**P≤0.01；***P<0.001;****P<0.0001。圖1 魚腥草3種提取物對(duì)E.coli、S.aureus、S.flexner的 抑制效果(0.5濁度菌液)

2.2 魚腥草提取物對(duì)3種菌的抑制效果差異 直接研磨液對(duì)E.coli、S.aureus和S.flexner3種細(xì)菌的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。水提取液對(duì)E.coli和S.flexner，S.aureus和S.flexner的抑制效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對(duì)E.coli和S.aureus的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，抑制作用強(qiáng)弱依次為：E.coli=S.aureus>S.flexner。乙醇提取液對(duì)S.aureus和S.flexner的抑制效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且對(duì)S.aureus的抑制作用強(qiáng)于S.flexner，而E.coli與二者均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 抑菌環(huán)直徑隨菌液稀釋倍數(shù)變化規(guī)律 理論上抑菌環(huán)直徑隨菌液稀釋倍數(shù)增大而增大。但本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的稀釋倍數(shù)-抑菌環(huán)直徑曲線與理性模型不完全一致(見圖2)，這可能與細(xì)菌生長(zhǎng)速度、培養(yǎng)時(shí)間以及培養(yǎng)過程中pH值變化有關(guān)。

圖2 抑菌環(huán)直徑隨菌液稀釋倍數(shù)變化規(guī)律

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中采購(gòu)的不同批次的魚腥草的抑菌效果有差異，可能與魚腥草的新鮮程度、生長(zhǎng)時(shí)間、植株部位、地理位置和植株遺傳因素等方面的差異有關(guān)。魚腥草越新鮮，抑菌效果越明顯。本實(shí)驗(yàn)的魚腥草均在4 ℃冷藏12 h以內(nèi)，此時(shí)實(shí)驗(yàn)效果最好。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)冷藏保存36 h以上時(shí)，抑菌效果明顯減小且抑菌圈周圍觀察到明顯雜菌環(huán)，說明有效抑菌成分失活且腐敗菌滋生。魚腥草的地上組成部分的生長(zhǎng)發(fā)育可分成出苗期、旺長(zhǎng)期、靜止期、枯萎期和冬眠期5期，地下部分成長(zhǎng)的過程可分成出苗期、旺長(zhǎng)期、靜止期和冬眠期4期。不同生長(zhǎng)周期的魚腥草營(yíng)養(yǎng)成分也有明顯差異[8]。魚腥草的活性成分含量和抗氧化功能從部位上看，葉片>地上莖>根狀莖，呈由上往下逐步減少的趨勢(shì)[9]。本實(shí)驗(yàn)選用魚腥草根狀莖，故猜測(cè)魚腥草不同部位的抑菌效果大小依次為葉片>地上莖>根狀莖，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。此外，不同地理位置魚腥草的活性成分有所不同，但魚腥草群體間的地理分布和遺傳多樣性分布沒有直接的相關(guān)性，即海拔、緯度和經(jīng)度等的變化還不足以影響魚腥草的遺傳多樣性水平[10]。

除了魚腥草自身的因素，培養(yǎng)基的酸堿度、菌種的迭代培養(yǎng)、提取方法、細(xì)菌的生長(zhǎng)速度等因素也會(huì)影響抑菌環(huán)的直徑。大部分細(xì)菌的生命活動(dòng)受氫離子濃度的影響很大，一般而言，在弱酸條件下活力最高，且魚腥草中一些活性成分如多酚等可通過離子配位結(jié)合改變其抑菌能力[11]，所以不同pH條件對(duì)魚腥草的抑菌作用的影響較為復(fù)雜。除此之外，實(shí)驗(yàn)過程中菌種的迭代培養(yǎng)也可能導(dǎo)致基金突變，產(chǎn)生耐藥性，從而影響抑菌效果。新鮮魚腥草的抑菌物質(zhì)主要為具有揮發(fā)性的總黃酮、揮發(fā)油、多糖等[12]。不同提取方法對(duì)魚腥草活性成分的提取程度不同。目前對(duì)魚腥草抗菌物質(zhì)研究得比較多的是魚腥草素，但本試驗(yàn)中具體抗菌物質(zhì)。其中乙醇提取法的抑菌效果并不理想，可能與提取工藝和器材條件有關(guān)，導(dǎo)致有效活性成分的損失。本實(shí)驗(yàn)對(duì)傷寒沙門氏菌未觀察到抑制作用，查閱相關(guān)文獻(xiàn)也未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)條件為37 ℃，8 h，細(xì)菌生長(zhǎng)速度也很大程度影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。金黃色葡萄球菌的繁殖速率最快，3個(gè)濃度梯度的培養(yǎng)皿37 ℃培養(yǎng)8 h，菌落生長(zhǎng)的密度差別最小。痢疾志賀氏菌生長(zhǎng)速度最慢，3個(gè)濃度梯度的培養(yǎng)皿的菌落密度差別最明顯。因此，痢疾志賀氏菌的不同濃度梯度的抑菌環(huán)的直徑差小于理想值，可能與細(xì)菌生長(zhǎng)較慢、藥液抑菌活性減弱有關(guān)。

總的來說，本實(shí)驗(yàn)初步探究了魚腥草的抑菌作用，為魚腥草抑菌類產(chǎn)品的研發(fā)與推廣提供了理論依據(jù)。我國(guó)魚腥草分布范圍廣，中醫(yī)學(xué)中運(yùn)用廣泛且歷史悠久。目前臨床上常見的藥品復(fù)方魚腥草顆粒、魚腥草滴眼液等。魚腥草所含有的活性成分對(duì)多種細(xì)菌和真菌具有抑制作用[13]，這為魚腥草在緩解皮膚病、霧化治療肺炎、天然的食品添加劑和畜牧業(yè)飼料添加劑等方面的應(yīng)用提供了可能。