邱瓊?cè)A，覃子龍，張 蓓，韋 倩，李雋永，梁學(xué)政

（1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院/柳州市壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001；2.柳州市質(zhì)量檢驗檢測研究中心，廣西 柳州 545001）

清熱顆粒為柳州市中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，已申報注冊二十多年，處方由崗梅、野菊花、千里光、紫花地丁、桑葉、蒲公英6味藥物組成。清熱顆粒具有清熱解毒、清肝明目、疏風(fēng)散熱的作用，臨床上常用于呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚瘡癰腫毒等，效果顯著，使用量較大。但由于該制劑申報時間較早，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，缺乏含量控制指標(biāo)，尚不能全面反映制劑質(zhì)量。

為對清熱顆粒進(jìn)行更全面的質(zhì)量評價，本研究采用一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）對清熱顆粒中的5種有效成分進(jìn)行含量測定。QAMS是近年來廣泛用于中藥質(zhì)量評價的一種方法，它利用中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測定1個成分即可實現(xiàn)多個成分同步測定的方法，具有經(jīng)濟、便捷的優(yōu)點[1-2]。本研究以綠原酸為內(nèi)參物，建立綠原酸與隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷等有效成分的相對校正因子，同時測定5種成分的含量，實現(xiàn)對清熱顆粒質(zhì)量較為全面的控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-20AT高效液相色譜儀，配備SPD-M20A檢測器（日本島津公司）；UV-2450二極管陣列檢測器（日本島津公司）；Waters e2695型高效液相色譜儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XS205DU型分析天平（梅特勒-托利多公司）；AE200型分析天平（梅特勒-托利多公司）；GWB-2E型超純水機（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SK8200HP型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥綠原酸（批號：MUST-20032310，含量：99.73%）、隱綠原酸（批號：MUST-20042403，含量：99.07%）、秦皮乙素（批號：MUST-20070504，含量：99.87%）、蒙花苷（批號：MUST-20031612，含量：98.65%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司。木犀草苷（批號：111720-201406，含量：94.9%）購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇均為色譜純，購自弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司。清熱顆粒5批（批號：20190905，20200102，20200501，20200504，20201101）購自柳州市中醫(yī)醫(yī)院。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷對照品適量，以70%甲醇溶解并定容，用0.45 μm濾膜濾過，即得混合對照溶液[綠原酸（50.66 μg/mL）、隱綠原酸（52.61 μg/mL）、秦皮乙素（51.83μg/mL）、木犀草苷（15.69 μg/mL）、蒙花苷（14.86 μg/mL）]。

2.1.2 供試品溶液的制備 取質(zhì)量差異下的清熱顆粒10袋，混勻，取約10.0 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%的甲醇50 mL，超聲30 min，取出，放冷，定容，0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按清熱顆粒的處方及制法，制備缺野菊花、缺紫花地丁陰性對照品，按“2.2.2”項下方法操作，制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件Welchrom C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，10%乙腈；5～20 min，10%→20%乙腈；20～30 min，20%乙腈；30～55 min，20%→45%乙腈；55～60 min，45%乙腈；60～65 min，45%→10%乙腈；65～70 min，10%乙腈；體積流量為1 mL/min；測定波長為320 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性試驗分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計算均在10 000以上。缺紫花地丁和缺野菊花的陰性對照品在相應(yīng)位置處未見色譜峰，表明方法專屬性良好。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品溶液，制成6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進(jìn)行測定。記錄相應(yīng)的色譜峰峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

2.4.2 檢測限與定量限 取“2.1.1”項下混合對照品溶液逐步稀釋，以信噪比S/N=3/1測定檢測限，以S/N=10/1測定定量限，結(jié)果見表1。

表1 5種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3 精密度試驗 稱取樣品（批號：20200102）粉末約10 g，精密稱定，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰峰面積，計算綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷峰面積的RSD值分別為0.19%、0.17%、0.12%、0.16%、0.11%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 稱取樣品（批號：20200102）粉末約10 g，精密稱定，制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜峰，計算綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷峰面積的RSD值分別為0.13%、0.12%、0.14%、0.51%、0.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗 稱取樣品（批號：20200102）粉末約10 g，共6份，精密稱定，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.16%、0.27%、0.19%、0.34%、0.26%，結(jié)果表明本試驗的重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取樣品（批號：2020102）粉末6份，精密稱定，每份5 g，分別置錐形瓶中，加入中等濃度的對照品儲備溶液適量（相當(dāng)于樣品中各成分的50%），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，計算加樣回收率，結(jié)果表明本試驗方法回收率良好。（見表2）

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

附表2：

2.5 相對校正因子（fk/s）的計算[3-6]

2.5.1 多點校正法 以多個質(zhì)量濃度點計算所得的fk/s取平均值作為定量用fk/s。其中fk/s=（Cs×Ak）/（Ck×As）；待測成分質(zhì)量濃度Ck′=（Cs×Ak′）/（fk/s×As）。兩式中Cs為參照物質(zhì)質(zhì)量濃度，As為參照物質(zhì)色譜峰峰面積，Ck為其他對照組分質(zhì)量濃度，Ak為其他對照組分色譜峰峰面積，Ak′為待測組分色譜峰峰面積。以綠原酸為內(nèi)參物，應(yīng)用以上多點校正法進(jìn)行計算，得到其他成分相對于綠原酸的fk/s。由表3可知，隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的fk/s分別為1.050 7、1.223 1、1.508 7、1.437 4，RSD值分別為0.51%、0.25%、0.29%、0.20%。（見表3）

表3 以綠原酸為參照的fk/s（多點校正法）

2.5.2 斜率校正法 用“2.4.1”項下所得的各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線計算X與Y的斜率之比即fk/s（fk/s=ak/as）。Ck′=Ak′/(as×fk/s)，as為參照物斜率，ak為其他對照組分斜率。應(yīng)用斜率校正法進(jìn)行計算，得到其他成分相對于綠原酸的fk/s。隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷對于綠原酸的fk/s分別為1.046 9、1.219 1、1.505 1、1.439 4。

2.5.3 定量因子 在公式Ck′=Ak′/(as×fk/s)中，當(dāng)在同一實驗室、同一儀器、同一色譜條件時，特別是在藥廠或藥檢所大量樣品短期內(nèi)復(fù)檢時，由于as基本一致，fk/s也是固定值，故可先以公式ak=asfk/s推算出定量因子ak，直接以待測樣品峰面積Ak′即可快速推測其量（Ck′=Ak′/ak）?？梢姌?biāo)準(zhǔn)曲線中各成分的斜率值實際上就是其定量因子。應(yīng)用此法需首先獲得as值，并保證as值恒定。定量因子ak僅對同一儀器在相同色譜條件下短期內(nèi)保持恒定，不同儀器應(yīng)分別建立。另外定量因子計算所用fk/s為斜率校正法所得，故其計算結(jié)果與斜率校正法一致。結(jié)果綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的定量因子分別為27 555 502.04、26 332 161.83、22 602 724.56、18 307 697.59、19 143 636.44。

2.6 fk/s的重現(xiàn)性考察本試驗考察了2套不同的色譜系統(tǒng)（LC-20AT、Waters e2695）及不同的色譜柱（Welchrom C18、UltimateAQ C18、Shin-pack GIST C18）對fk/s的影響。結(jié)果表明，各種條件下所得到的RSD值＜3.0%，本試驗條件下不同儀器及色譜柱對各成分fk/s無顯著影響。（見表4）

表4 不同儀器和不同色譜柱對fk/s的影響

2.7 待測組分色譜峰的定位利用相對保留時間進(jìn)行定位，即以各待測組分色譜峰與綠原酸色譜峰的相對保留時間來確定。以綠原酸為基準(zhǔn)峰，計算不同儀器和不同色譜柱下隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷相對保留時間。結(jié)果顯示各種條件下所得到的RSD＜5.0%，表明本方法利用綠原酸來定位不同成分色譜峰是可行的。（見表5）

表5 不同儀器和不同色譜柱下的各色譜峰相對保留時間

2.8 一測多評法與常規(guī)法測定結(jié)果的比較取5批清熱顆粒樣品，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷的峰面積，分別用外標(biāo)法和3種一測多評法計算其含量，對比不同方法計算清熱顆粒指標(biāo)成分含量的差異，結(jié)果顯示RSD均＜2%。說明一測多評法應(yīng)用于清熱顆粒多指標(biāo)成分測定具有良好的準(zhǔn)確定性，可信度較高。（見表6）

表6 清熱顆粒中5種成分不同方法定量測定結(jié)果（n=3）

3 討 論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇清熱顆粒臨床上常用于治療咽喉腫痛、上呼吸道感染、皮膚瘡癰腫毒、濕疹等。本課題組前期曾對崗梅[7-8]中的冬青苷B、香葉木素、東莨菪內(nèi)酯，蒲公英[9]中菊苣酸、咖啡酸，千里光[10]中金絲桃苷等成分進(jìn)行檢測，但該色譜條件下未被檢出，推測該顆粒制備工藝中使用了醇沉工藝，導(dǎo)致部分化學(xué)成分流失。清熱顆粒組方中各味藥物均有抗炎、抑菌、抗病毒等功效。其中，綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷為抑菌、抗病毒的有效成分[11-13]，在清熱顆粒多味藥物中均有存在。其次秦皮乙素、蒙花苷分別為紫花地丁與野菊花中的特征性成分[14]，也是抑菌、抗炎、祛痰的有效成分[15-17]，故本研究選擇綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、秦皮乙素、蒙花苷等5個成分作為清熱顆粒質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

3.2 試驗方法的考察為了盡可能充分提取出清熱顆粒中的有效成分。本試驗前期考察了不同提取溶劑（100%、70%、50%甲醇）對指標(biāo)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取較為充分，各指標(biāo)性成分響應(yīng)較高。在此基礎(chǔ)上，本研究比較了超聲提取和回流提取兩種方式，發(fā)現(xiàn)兩者的提取率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而超聲提取的操作便捷，故確定供試品溶液制備方法為70%甲醇超聲30 min。另外，在考察檢測波長時，由于綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、木犀草苷、蒙花苷等5個成分的最大吸收波長均在300～350 nm[18-19]，當(dāng)檢測波長為320 nm時，樣品中5種待測成分色譜峰的分離良好、峰面積較大，故本研究選擇320 nm為5種成分的檢測波長。同時預(yù)試驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液流動相系統(tǒng)在梯度洗脫條件下的分離效果。結(jié)果顯示，以甲醇-水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，分離度較差，且各成分出峰時間較長，故本研究選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為該檢測條件的流動相。

3.3 3種一測多評法的比較本試驗考察了一測多評法fk/s的3種不同計算方式，其中多點校正法為近年來多數(shù)文獻(xiàn)所用，但由于其使用不同濃度參比對照溶液的峰面積計算其余成分的fk/s值，當(dāng)參比對照溶液濃度較低或較高時，儀器容易產(chǎn)生檢測誤差，導(dǎo)致fk/s也有一定偏差。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比計算fk/s，系統(tǒng)誤差不容易對標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率產(chǎn)生影響，準(zhǔn)確度較高，且斜率法直接使用線性回歸方程中的斜率進(jìn)行計算，相對更簡便。定量因子計算所用fk/s為斜率校正法所得，故其計算結(jié)果與斜率校正法一致，但由于不同儀器對同一成分檢測有一定差異，故每臺儀器需單獨建立相應(yīng)方法的定量因子，此方法在大量樣品短期內(nèi)復(fù)檢時較為簡便。

4 小 結(jié)

本試驗比較了外標(biāo)法和3種一測多評法測定清熱顆粒指標(biāo)成分的含量，3種一測多評法計算的結(jié)果與外標(biāo)法無顯著差異，說明一測多評法測定清熱顆粒多指標(biāo)成分與外標(biāo)法具有良好的一致性，準(zhǔn)確度較高，重現(xiàn)性較好，實際工作中可根據(jù)需要選擇適合的一測多評方法。此外，由于綠原酸對照品便宜易得，檢測成本較低，適用于醫(yī)院制劑日常檢驗工作中。綜上所述，一測多評法可用于清熱顆粒的質(zhì)量控制。