張利 應榮敏 陳國達 黃一 單曉杭

(浙江工業(yè)大學機械工程學院 杭州310032)

0 引言

隨著年齡增長,骨組織極易損傷且力學性能退化[1]。對于55 歲以上的人群,骨關節(jié)病發(fā)病率達到了80%,嚴重會導致關節(jié)活動能力喪失,生活不能自理。目前,使用醫(yī)用材料進行損傷關節(jié)替換的人工關節(jié)置換術是治愈關節(jié)疾患終末期的最有效手段。鈦合金具有良好的力學性能與生物相容性,是現(xiàn)有醫(yī)用內植入產(chǎn)品的首選材料[2-3],但鈦合金表面硬度較高、工藝性較差,使其復雜曲面的表面加工困難,存在加工均勻性差、效率低的問題。

關節(jié)置換術實施后,醫(yī)用材料與活體組織是直接接觸的,因此材料的生物相容性、毒性、耐用性尤為重要,即需確保人工關節(jié)使用中對人體是安全的[4]。細胞黏附即細胞附著于植入體的過程,是植入體進入人體后所有生物學行為的第一步,有了良好的黏附基礎,細胞隨后的增殖、分化、遷移和凋亡才能正常進行[5]。細胞與底物之間的黏附過程為底物吸附細胞外介質中的離子和水,繼而吸附其中的黏附類蛋白,形成蛋白聚集層后,細胞通過離子鍵、范德華力等弱作用力附著在材料表面。植入體的化學組成,決定了材料的親疏水性,植入體表面形貌的變化又會使其具有不同表面力場、表面電荷及表面能[5-6]。過于粗糙的植入體表面會引起血凝,磨損會產(chǎn)生微小顆粒[7],而過于光滑的表面,與組織接觸易形成炎癥。目前生物材料粗糙度研究范圍為10 nm～10 μm,該尺寸對細胞與生物材料表面的相互作用影響較大。

本文基于仿型流道磨粒流技術加工4 組Ti6Al4V 鈦合金薄片表面,并進行體外細胞黏附對比實驗,觀察磨粒流加工后薄片表面的微觀形貌特征,探索適宜MC3T3-E1 細胞黏附的表面粗糙度,對于鈦合金人工關節(jié)表面處理及其生物相容性的相關研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 鈦合金薄片處理及檢驗

1.1.1 加工方法

仿型流道磨粒流表面加工技術原理圖如圖1所示[8],利用仿型約束構件與鈦合金工件表面共同組成一條厚度均勻的加工約束流道,在泥漿泵的作用下磨粒(SiC)體積分數(shù)在0.1～0.3 之間的軟性磨粒流從流道入射口流入[9-10],根據(jù)流動特性流體進入約束流道后發(fā)展為湍流狀態(tài)并填充滿整個流道[11]。其中磨粒在液相載體作用下做無規(guī)則隨機運動并且不斷沖擊被加工件表面,實現(xiàn)微量微力的微切削作用,從而實現(xiàn)對關節(jié)復雜表面的精密加工。

圖1 覆蓋式磨粒流加工原理圖

選用Ti6Al4V 的鈦合金圓薄片作為實驗品,厚度為1 mm,直徑為10 mm。將鈦合金分為4 組,每組20 片,表面粗加工使用砂紙拋光至粗糙度Ra約為0.23 μm,精加工分別采用磨粒粒徑為8 μm、10 μm、13 μm 和18 μm,體積分數(shù)為0.1 的軟性磨粒流進行加工,加工時長5 h。

1.1.2 表面形貌觀察及粗糙度測量

采用KEYENCE VW-60 動態(tài)分析三維顯示系統(tǒng),對鈦合金拋光前及不同粒徑磨粒流拋光后的表面形貌進行觀察。

采用Mitutoyo 粗糙度儀測量鈦合金片的表面粗糙度Ra。測量方法是在各個鈦合金片上取5 個點進行測量,結果取其平均值。

1.2 細胞黏附實驗與檢測

1.2.1 材料

主要儀器:二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,美國)、倒置顯微鏡(Olympus,日本)、酶標儀(華東電子,中國)、低速臺式離心機(Anke,中國)。

主要試劑:0.25%胰蛋白酶溶液、DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)培養(yǎng)液、胎牛血清,二甲基亞砜(DMSO),磷酸鹽緩沖液(PBS),5 mg/ml噻唑藍(MTT)溶液。

細胞:MC3T3-E1 小鼠成骨細胞,由國家實驗細胞共享服務平臺提供。

1.2.2 細胞復蘇與傳代

無菌條件下將MC3T3-E1 細胞從-80 ℃低溫環(huán)境取出,置于37 ℃的水浴中復溫,不斷搖動,完全融化后,取1 ml 凍存懸液至離心管,1000 r/min 離心5 min,吸除上清液,完成復蘇。

復蘇后加入培養(yǎng)基(DMEM +10%胎牛血清),移至25T 培養(yǎng)瓶中,放入37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),于細胞鋪滿培養(yǎng)瓶90%～100%進行傳代。加入PBS 緩沖液,洗去未黏著細胞,重復2～3 次,吸除PBS 溶液,加入0.25%的胰蛋白酶溶液進行消化,使用倒置顯微鏡對消化情況進行觀察,細胞回縮變圓后,加入適量的培養(yǎng)基停止消化,制成細胞懸液。按1:2 進行傳代培養(yǎng)。中間每2 d 更換一次培養(yǎng)基,每次傳代重復以上操作,直至第4 代,如圖2 所示,細胞密度增加且伸展狀況良好,用于后續(xù)實驗。

圖2 第四代細胞培養(yǎng)情況

1.2.3 實驗分組

對照組1 中未放置鈦合金片,直接在24 孔板內接種細胞;對照組2 中既未放置鈦合金也未接種細胞。實驗組將鈦合金薄片使用75%酒精進行清洗,高壓蒸汽消毒晾干后,按精加工磨粒流磨粒粒徑值的不同各取10 片,設置為實驗組1(8 μm)、實驗組2(10 μm)、實驗組3(13 μm)和實驗組4(18 μm),每片1 個孔。

1.2.4 細胞黏附

將細胞懸液加入培養(yǎng)液稀釋至5 ml,血球計數(shù)板測得懸液密度8.4×105個/ml,取100 μl 懸液接種于24 孔板中的樣品表面上(圖3),細胞懸液能夠借助液體自身的張力完全覆蓋于鈦合金片表面之上,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后,吸掉孔板中培養(yǎng)液,用PBS 洗去未黏附細胞,加入DMEM溶液與MTT 溶液,再培養(yǎng)4 h 后取出,吸除培養(yǎng)液,加入DMSO 溶液,于振蕩器振蕩至結晶完全溶解。每組各取部分溶液移至96 孔板,放入酶標儀中測量光吸收值(OD),并取平均。

圖3 鈦合金接種細胞懸浮液

MTT 比色法原理:對于外源性的MTT 溶液,活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將其還原為一種藍紫色的甲瓚晶體。該晶體不溶于水,并且在細胞中沉積,而已經(jīng)死亡的細胞無法完成該功能,故測定在490 nm 波長的條件下各組的光吸收值,吸光度越大,證明該組活細胞數(shù)目越多,反之亦然。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

使用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0 對細胞黏附實驗得到的各組吸光度進行分析,由于從成骨細胞黏附實驗獲得的是重復測量數(shù)據(jù),因此使用完全隨機設計的單向方差分析方法。檢驗水準α=0.05,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.2.6 黏附百分比

為了進一步表現(xiàn)各實驗組以及對照組之間成骨細胞黏附效果的差異,使用細胞黏附百分比進行對比分析,如下式[12]所示。

式中,Pad為細胞黏附百分比,ODi為第i組實驗的平均吸光度,OD對照1為對照組1 的MTT 實驗吸光度平均值,OD對照2為對照組2 的MTT 實驗吸光度平均值。

2 結果

2.1 鈦合金表面粗糙度

使用8 μm 粒徑磨粒流加工后薄片粗糙度Ra平均值與方差結果如表1 所示,由表可知,表面粗糙度Ra平均值范圍為0.05～0.08 μm。同理,測量計算后得到10 μm 粒徑的磨粒流加工得到鈦合金片表面粗糙度Ra平均值范圍為0.08～0.10 μm,13 μm粒徑的磨粒流加工得到鈦合金片表面粗糙度Ra平均值范圍為0.10～0.12 μm,18 μm 粒徑的磨粒流加工得到鈦合金片表面粗糙度Ra平均值范圍為0.12～0.15 μm。結果如表2 所示。

表1 8 μm 粒徑磨粒流加工后薄片表面粗糙度Ra

表2 不同粒徑加工結果

2.2 鈦合金表面形貌

不同磨粒粒徑磨粒流加工鈦合金表面形貌觀察結果如圖4 所示。圖4(a)為鈦合金片經(jīng)砂紙粗加工后的表面,密集分布有條紋狀溝槽及凹坑,且溝槽的寬度與深度大小不一,整體表面精度低。圖4(b)～(e)為進一步經(jīng)過磨粒流精加工的鈦合金薄片表面圖,由圖可見表面的溝槽結構已沖蝕消失,僅剩部分凹坑與擠出唇離散分布,且磨粒粒徑越小,凹坑與擠出唇尺寸越小、數(shù)量越少。

圖4 不同磨粒粒徑磨粒流加工鈦合金表面形貌

2.3 吸光度檢測結果

用酶標儀檢測各組黏附結果,并取平均值,實驗組1～4 吸光度分別為0.098、0.127、0.122、0.118,對照組1 吸光度為0.144,對照組2 吸光度為0.006。由圖5 可知,吸光度隨表面粗糙度的增加呈現(xiàn)先增加再減小的趨勢。

圖5 各實驗組吸光度與粗糙度對比圖

統(tǒng)計學分析:實驗組2、實驗組3 和實驗組4 三組吸光度兩兩之間無顯著差異(P＞0.05),而對比實驗組1,吸光度明顯更高(P＜0.05)。另外,相較于各個實驗組,對照組1 吸光度更高(P＜0.05)。

2.4 黏附比分析

圖6為各實驗組的細胞黏附百分比柱狀圖,從中得出黏附百分比最低的是實驗組1,只有71.01%;實驗組3 的細胞黏附百分比為88.41%,實驗組4 為85.51%,兩者實驗結果相近;實驗組2的細胞黏附百分比達到了92.02%,黏附率最高。

圖6 鈦合金細胞率柱形圖

3 討論

鈦合金具備韌性好、強度高、密度低[13-14]等優(yōu)良性質,其表面自然生成的TiO2氧化涂層能控制基體離子溶出,增強其抗腐蝕性與生物相容性。傳統(tǒng)的拋光方式如車削、磨削,耗時長[15],并在材料表面形成一定規(guī)則的溝槽分布,且難以保證表面粗糙度的整體均勻性。本研究采用軟性磨粒流約束流道的方法,利用磨粒在約束流道內的湍流壁面效應實現(xiàn)拋光加工,所用磨粒粒徑范圍為8～18 μm,加工得到的鈦合金薄片表面粗糙度Ra整體范圍在0.05～0.15 μm 之間,使用磨粒粒徑越小,加工所得表面粗糙度Ra值越小。從圖4 中觀察可得,加工后的鈦合金表面形貌未呈現(xiàn)出規(guī)律性,這是軟性磨粒流加工無序性特征的結果,可能會對細胞在其表面的黏附、鋪展起到較好的接觸引導效果,同時表面的微坑與擠出唇增大了材料的表面積,可為細胞提供更多的黏附區(qū)域。

醫(yī)用材料表面性質的變化對生物相容性的影響是人工關節(jié)領域的研究熱點,表面性質中產(chǎn)生影響作用最大的就是微觀幾何和表面粗糙度[7]。已有研究表明,細胞中存在細胞黏附分子——整聯(lián)蛋白,細胞外環(huán)境可通過其調控細胞內活性,蛋白的胞外結構域與其特異性的配體相互作用,可產(chǎn)生多種信號,對細胞黏附、生長、遷移等行為產(chǎn)生影響[16]。本研究采用體外實驗的方法,觀察在磨粒流處理后不同粗糙度Ra的鈦合金薄片表面上MC3T3-E1 細胞的黏附差異。研究發(fā)現(xiàn)Ra于0.05～0.08 μm 內的薄片表面細胞黏附效果最差,說明過于光滑的表面,附著點少,不利于細胞黏附。對照組1 中,成骨細胞直接黏附于24 孔板的內壁上,吸光值明顯高于鈦合金實驗組,說明鈦合金薄片對成骨細胞的黏附存在抑制作用。此外,實驗組2 薄片黏附率最高,為92%,因此認為磨粒流加工后得到Ra為0.08～0.10 μm的表面最有利于細胞黏附,而較粗糙和較光滑的表面均會在一定程度上影響成骨細胞的黏附效果。

目前,眾多學者就表面粗糙度對細胞黏附的影響進行了研究。Deligianni 等人[17]利用3 種規(guī)格粗碳化硅砂紙?zhí)幚礅伜辖鸨砻?發(fā)現(xiàn)Ra為0.3 μm 表面細胞黏附量最少,粗糙度越高對細胞黏附行為越有利,與本研究結果差別較大。Huang 等人[18]利用拋光粉及砂紙?zhí)幚沓龃植诙萊a在50 nm～1.2 μm的5 種鈦金屬表面,結果顯示金屬表面的溝槽對細胞黏附有接觸引導現(xiàn)象,且相對于較粗糙或較光滑的樣品,Ra為150 nm 的表面表現(xiàn)出了最佳的細胞黏附性能,與本研究結果較為一致。

細胞黏附的影響因素眾多,即使表面粗糙度Ra相同,材料不同或加工方法不同都會導致細胞反應的差異[19],因此,為探索不同加工方法的細胞黏附差異性,需就各自處理得到的最佳黏附表面的黏附效果進行對比分析。趙昕[20]對Ra為0.3 μm～1.8 μm的砂紙拋光后鈦合金表面對MC3T3-E1 細胞黏附的影響機制進行了分析,發(fā)現(xiàn)粗糙度Ra介于0.9～1.0 μm 之間的表面得到了80%的最佳黏附率,相較之下,磨粒流加工后的最佳黏附率達到了92%,說明磨粒流技術加工出的表面形貌比砂紙拋光更適宜于MC3T3-E1 細胞黏附。

4 結論

本研究探索了磨粒流加工得到的Ti6Al4V 鈦合金表面的微觀形貌及表面粗糙度Ra對MC3T3-E1細胞黏附的影響,得到如下結論。

(1)通過觀察磨粒流加工后的鈦合金薄片表面形貌,發(fā)現(xiàn)其表面離散分布有微坑與擠出唇,均勻性較好,證實了磨粒流加工的優(yōu)異性。

(2)通過對比對照組1 與鈦合金實驗組,發(fā)現(xiàn)實驗組吸光值低,說明放置了鈦合金后,反而對細胞的黏附起到了抑制作用。

(3)通過各個實驗組之間的吸光值對比分析可得,粗糙度Ra為0.05～0.08 μm 實驗組1 吸光值顯著低于其他組,說明過于光滑的表面并不利于細胞黏附。

(4)從黏附率的計算結果來看,實驗組2 黏附率最高,達到了92%,說明磨粒流處理后的鈦合金表面最適宜細胞黏附的粗糙度Ra閾值為0.08～0.10 μm,這一結果為磨粒流加工技術及鈦合金表面生物相容性的進一步研究提供了參考。