李 韜，曹雅淇，鄒 偉，白光劍，文曉霞

（四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005）

水稻秸稈是世界三大農(nóng)作物秸稈之一，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素[1]。水稻秸稈結(jié)構(gòu)獨特，生物質(zhì)頑抗性很強，結(jié)晶度高，難以直接利用，每年有大量的秸稈資源被浪費，水稻秸稈的資源化利用逐漸被社會重視起來[2]。研究發(fā)現(xiàn)，通過微生物降解的方法可以將木質(zhì)纖維素中的能源逐步釋放出來，將能得到綠色無害的可持續(xù)資源[3]。以木質(zhì)纖維素為原料、以微生物為工具，將木質(zhì)纖維素中的生物質(zhì)能逐步導(dǎo)出，使其流向有價值的方向，被稱為木質(zhì)纖維素的生物煉制，是木質(zhì)纖維素資源化利用中最有前景的新方向，而木質(zhì)纖維素的糖化是其中的重要領(lǐng)域和關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。

纖維素酶是由多種水解酶組成的一個復(fù)雜酶系，是在各種酶組分協(xié)同作用下，能降解纖維素，使之變成纖維寡糖、纖維二糖和葡萄糖的復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶。纖維素酶被稱為木質(zhì)纖維素糖化的發(fā)動機，獲取低成本高酶活的纖維素酶是木質(zhì)纖維素糖化工業(yè)化持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。纖維素酶屬于誘導(dǎo)酶，是微生物體內(nèi)的一種“智能酶”，受到多重調(diào)節(jié)機制影響[6]。通常在自然發(fā)酵的狀態(tài)下，沒有纖維素底物的存在時，微生物不合成纖維素酶；當環(huán)境中有纖維素碳源且其他碳源不足時，才會合成纖維素酶，水解纖維素產(chǎn)糖[7-8]。當環(huán)境中可發(fā)酵糖類充足時，纖維素酶的合成受到抑制，這些都為提高纖維素酶的產(chǎn)量帶來了阻礙[9]。

絲狀真菌是生產(chǎn)纖維素酶的主要微生物菌株，其中包括木霉菌、曲霉菌和青霉菌，特別是里氏木霉（Trichoderma reesei）及其相關(guān)的菌株。它具有降解天然木質(zhì)纖維素的3種酶，即內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，所產(chǎn)生的纖維素酶系統(tǒng)完整，遺傳性狀穩(wěn)定，抗代謝抑制能力強，生產(chǎn)的酶活性高，易于提取和純化，并且該菌株安全無毒[10]。

因此，本研究為了提高纖維素酶生產(chǎn)效率，以里氏木霉（Trichoderma reesei）為研究對象，對水稻秸稈進行糖化試驗。采用單因素試驗及響應(yīng)面試驗對產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化，采用單因素試驗對里氏木霉的酶解條件進行優(yōu)化，旨在優(yōu)化其糖化效果，提高秸稈的資源化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌株

預(yù)處理水稻秸稈：參考白光劍等[11]方法進行預(yù)處理；里氏木霉（Trichoderma reesei）CICC41027：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母粉、尿素（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、FeSO4·7H2O、吐溫-80、羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）、蔗糖、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基[11]：預(yù)處理水稻秸稈20 g/L、蛋白胨2 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO42 g/L、吐溫-80 0.5 mL/L、FeSO4·7H2O 0.002 g/L、微量元素液10 mL/L，pH自然6.0～6.5。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ150L多功能培養(yǎng)搖床：上海滬奧明科學(xué)儀器有限公司；SHZ-82恒溫振蕩器：寧波市鄞州華豐儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

（1）單因素試驗

氮源選擇：在初始秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇不同的氮源（2 g/L）：蛋白胨、（NH4）NO3、（NH4）2SO4、酵母粉、麩皮、尿素。設(shè)定初始發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度28 ℃、接種量5%、初始pH 6.5、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、發(fā)酵時間5 d?？疾觳煌磳︳燃谆w維素鈉酶活（carboxyl methyl cellulose-Na activity，CMCA），濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA）和β-葡萄糖苷酶活（β-glucosidase activity，BGA）的影響。

碳源選擇：在初始秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以（NH4）2SO4為氮源，選擇不同的碳源：麩皮、預(yù)處理水稻秸稈段、CMC-Na、蔗糖、葡萄糖。發(fā)酵條件同上，考察不同碳源對CMCA、FPA和BGA的影響。

（2）響應(yīng)面試驗

①Plackett-Burman試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以預(yù)處理水稻秸稈、（NH4）2SO4添加量、MgSO4·7H2O、KH2PO4、吐溫-80、FeSO4·7H2O及微量元素液添加量為自變量，纖維素酶活為響應(yīng)值，每個因素取2個水平，篩選出對CMCA、FPA和BGA影響較為顯著的因素。Plackett-Burman（PB）試驗法優(yōu)化培養(yǎng)基成分設(shè)計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

②最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗的結(jié)果，選出主要影響因素，根據(jù)主要因素的最速上漲路徑與變化步長，如果系數(shù)為正，則該因素水平增加，反之就遞減；再按照各因子響應(yīng)值的大小來確定變化步長，能夠快速、有效地貼近最佳值區(qū)[12]。

③Box-Benhnken試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果，確定顯著影響因素和相應(yīng)因素的響應(yīng)面中心值，選取預(yù)處理水稻秸稈（X1）、KH2PO4（X2）、吐溫-80（X3）3個因素設(shè)計響應(yīng)面試驗，并以濾紙酶活（Y）為響應(yīng)值，并用Design-Expert8.0.6軟件進行Box-Benhnken試驗設(shè)計，Box-Benhnken試驗因素與水平見表2。

表2 Box-Benhnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置250 mL錐形瓶裝液量40%，分別在不同發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28、30 ℃、32 ℃、34 ℃），不同初始pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0），不同接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%），不同轉(zhuǎn)速（90 r/min、120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min），不同發(fā)酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）條件下，分別考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量及轉(zhuǎn)速對里氏木霉產(chǎn)酶的影響。

1.3.3 分析檢測

還原糖測定：參照國標GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的DNS法[13]；纖維素酶活（CMCA、FPA和BGA）測定：參照中華人民共和國能源行業(yè)標準NB/T 13005—2016《用于生物燃料乙醇制備的纖維素酶酶活力測定方法》[14]。

羧甲基纖維素鈉酶活定義：在50 ℃、指定pH值條件下（酸性纖維素酶pH=4.8，中性纖維素酶pH=6.0），水解羧甲基纖維素鈉底物，以每分鐘降解產(chǎn)生出相當于1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

羧甲基纖維素鈉酶活計算公式如下：

式中：X為羧甲基纖維素鈉酶活，U/mL；c為產(chǎn)生0.5 mg葡萄糖的酶濃度；0.185為轉(zhuǎn)換系數(shù)。

濾紙酶活定義：在50 ℃、指定pH值條件下（酸性纖維素酶pH=4.8，中性纖維素酶pH=6.0），以50 mg濾紙為底物，截取在60 min釋放2.0 mg葡萄糖當量的還原糖（轉(zhuǎn)化率4%）來計算濾紙活力，以每分鐘降解產(chǎn)生出相當于1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位（PFU/mL）。

濾紙酶活計算公式如下：

式中：X為濾紙酶活，PFU/mL；c為產(chǎn)生2.0 mg葡萄糖的酶濃度；0.37為轉(zhuǎn)換系數(shù)。

β-葡萄糖苷酶活定義：在50 ℃、指定pH值條件下（酸性纖維素酶pH=4.8，中性纖維素酶pH=6.0），水解纖維二糖（或其結(jié)構(gòu)類似物）為底物，以每分鐘降解產(chǎn)生出相當于1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

β-葡萄糖苷酶活計算公式如下：

式中：X為β-葡萄糖苷酶活，U/mL；c為產(chǎn)生1.0 mg葡萄糖的酶濃度；0.092 6為轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 里氏木霉產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 氮源的選擇

由圖1可知，添加不同氮源的實驗組中，蛋白胨組的CMCA最高，為（0.790±0.012）U/mL，其次是（NH4）2SO4組，為（0.720±0.031）U/mL；而BGA在（NH4）2SO4組最高，為（0.120±0.021）U/mL，其次是蛋白胨組，為（0.090±0.011）U/mL。FPA是最能反映酶液的綜合酶解能力的指標[6]，在6組實驗中蛋白胨組和（NH4）2SO4組相當，分別為（0.320±0.022）PFU/mL和（0.310±0.013）PFU/mL，其次是麩皮組，為（0.290±0.015）PFU/mL，酵母粉組為（0.280±0.016）PFU/mL。綜合分析6種氮源對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響，蛋白胨和（NH4）2SO4最好。蛋白胨是有機碳源，營養(yǎng)豐富，微生物生長快，但成本高，可以作為種子液中的氮源，（NH4）2SO4是小分子無機氮源，易于吸收，價格便宜，可以用作大規(guī)模發(fā)酵的氮源。因此，選擇（NH4）2SO4為發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適氮源。

圖1 不同氮源對里氏木霉產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources on the enzyme production by Trichoderma reesei

2.1.2 碳源的選擇

碳源是微生物發(fā)酵中最基本的物質(zhì)，是物質(zhì)基礎(chǔ)和能量基礎(chǔ)[15]。由圖2可知，其中3種酶活的從大至小的順序是預(yù)處理水稻秸稈、CMC-Na、麩皮、葡萄糖、蔗糖。實驗結(jié)果符合纖維素酶的合成代謝特點，纖維素酶是一類誘導(dǎo)酶，當環(huán)境中有纖維素物質(zhì)且易利用糖類較少時，纖維素酶合成較多[16]。水稻秸稈段是天然木質(zhì)纖維素，CMC-Na是類纖維素，麩皮中含有較多的纖維素成分，因此其發(fā)酵液中維素酶酶活較高，F(xiàn)PA達（0.400±0.011）PFU/mL、CMCA達（1.080±0.091）U/mL、BGA達（0.110±0.013）U/mL。蔗糖和葡萄糖實驗組中所測的FPA和CMCA都很低，其原因可能是蔗糖和葡萄糖都是易被微生物利用的碳源，需要合成纖維素酶。但是也發(fā)現(xiàn)葡萄糖實驗組中的BGA是5組實驗中最高的（0.310±0.022）U/mL，其原因尚不清楚，可能是發(fā)酵液較多的葡萄糖通過某種機制激發(fā)了BGA，不同碳源對產(chǎn)酶的影響實驗可知，纖維素酶的合成需要纖維素的誘導(dǎo)。因此，選擇預(yù)處理水稻秸稈為發(fā)酵培養(yǎng)基中的最適碳源。

圖2 不同碳源對里氏木霉產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the enzyme production by Trichoderma reesei

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 PB試驗

水稻秸稈在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中可作為碳源，同時又是產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物[17]；（NH4）2SO4作為氮源可促進蛋白質(zhì)的合成[18]；KH2PO4為微生物的生長提供磷元素的同時也可作為發(fā)酵液pH的緩沖劑[19]；MgSO4提供鎂元素，是許多酶系的輔助因子和激活劑，F(xiàn)eSO4·7H2O提供鐵元素[20]；吐溫-80能改變細胞膜的通透性，促進纖維素酶分泌到胞外，同時降低菌體結(jié)成球[21]；微量元素液提供微生物生長所必需的微量元素[22]。培養(yǎng)基中的成分對微生物的生長繁殖及代謝都有重要的影響作用，以FPA為指標，通過PB試驗可以找到在一定水平范圍內(nèi)培養(yǎng)基中的成分變化對所檢測的結(jié)果的影響趨勢，從而對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。PB試驗結(jié)果見表3，采用Design Expert 8.0.6 軟件對PB試驗各因素進行主效應(yīng)分析，結(jié)果表4。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗各因素主效應(yīng)分析Table 4 Main effect analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

由表4可知，模型的P值=0.006 8＜0.05表現(xiàn)為影響顯著。其中因素D（KH2PO4）和F（吐溫-80）對產(chǎn)酶影響顯著（P＜0.05），因素A（預(yù)處理水稻秸稈）對產(chǎn)酶有極顯著影響。因此，選擇對產(chǎn)酶影響較大的因素A（預(yù)處理水稻秸稈）、D（KH2PO4）、F（吐溫-80）進行最陡爬坡試驗，為響應(yīng)面試驗確定中心條件。

2.2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)PB試驗的結(jié)果，預(yù)處理水稻秸稈和吐溫-80的t值為負，說明其隨添加量呈負效應(yīng)，KH2PO4的t值為正，其隨添加量呈正效應(yīng)。在最陡爬坡試驗設(shè)計中，預(yù)處理水稻秸稈和吐溫-80因素水平增加，KH2PO4因素水平遞減。最陡爬坡試驗結(jié)果見表5。由表5可知，F(xiàn)PA酶活在試驗組3時最大，為（0.551±0.013）PFU/mL。因此，選擇試驗組3為響應(yīng)面試驗的中心條件，即預(yù)處理水稻秸稈16 g/L、KH2PO43 g/L、吐溫-80 0.6 mL/L。

表5 最陡爬坡試驗結(jié)果Table 5 Results of the steepest climbing tests

2.2.3 Box-Benhken試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗的結(jié)果，選取預(yù)處理水稻秸稈（X1）、KH2PO4（X2）、吐溫-80（X3）三個因素設(shè)計響應(yīng)面試驗，并以濾紙酶活（Y）為響應(yīng)值，并用Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Benhnken試驗設(shè)計，Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，并對表6試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合及方差分析，結(jié)果見表7。

表6 Box-Benhken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Benhken experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert8.0.6軟件對表6數(shù)據(jù)進行分析，得到模型的回歸方程為：

圖3 水稻秸稈、KH2PO4及吐溫-80添加量對產(chǎn)酶影響的響應(yīng)面及等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between rice straw,KH2PO4 and Tween-80 addition on the enzyme production

運用F檢驗分析模型是否顯著，對回歸模型進行方差分析，如表7所示，模型P值=0.000 2＜0.01，表明模型極顯著；失擬項P值=0.853 6，表明回歸模型與實際值非常吻合。該模型決定系數(shù)R2=0.968 9，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.928 9，表明該模型可信。由F值可知，3個因素對FPA的影響順序為X1（預(yù)處理水稻秸稈）＞X3（吐溫-80）＞X2（KH2PO4）。由P值可知，其中一次項X1，二次項X12、X22、X32對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01）；一次項X2、X3，交互項X2X3對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05）。經(jīng)過響應(yīng)面試驗優(yōu)化過后，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為：預(yù)處理水稻秸稈15.3 g/L、KH2PO43.2 g/L，吐溫-80 0.47 mL。此優(yōu)化條件下得到FPA預(yù)測值為0.602 PFU/mL。為了便于實際操作，將發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)修正為預(yù)處理水稻秸稈15.0 g/L、KH2PO43.0 g/L和吐溫-80 0.5 mL。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，F(xiàn)PA實際值為0.612 PFU/mL，與預(yù)測值相比，誤差為1.66%。與初始培養(yǎng)基相比，F(xiàn)PA由0.401 PFU/mL提高至0.612 PFU/mL，提高了52.6%。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵溫度對里氏木霉產(chǎn)酶的影響

溫度影響微生物的生長代謝過程從而影響產(chǎn)酶，真菌的最適生長溫度為26～34 ℃[23]。

由圖4可知，發(fā)酵溫度在24～29 ℃時，酶活隨之升高；在發(fā)酵溫度29 ℃時，酶活達到最大，為（0.650±0.017）PFU/mL；發(fā)酵溫度高于29 ℃之后，酶活有所下降。溫度對產(chǎn)纖維素酶的影響可能是二重的，一方面溫度過高或過低，對產(chǎn)酶微生物的生長代謝造成影響，從而直接影響酶的產(chǎn)量[24]；另一方面，真菌纖維素酶的最適酶解溫度在40～60 ℃范圍內(nèi)，溫度升高，可能有利于增強纖維素酶的酶解效果，提升發(fā)酵液中的還原糖含量，從而反饋抑制纖維素酶基因的合成，使發(fā)酵液中的纖維素酶活降低。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為29 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對里氏木霉產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on enzyme production by Trichoderma reesei

2.3.2 初始pH值對里氏木霉產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，初始pH值在3～6時，酶活隨初始pH升高而增加；初始pH值為6時，酶活達到最大，為（0.68±0.023）PFU/mL；初始pH＞6之后，酶活開始下降。因此，選擇最佳初始pH值為6。

圖5 初始pH對里氏木霉產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of initial pH on enzyme production by Trichoderma reesei

2.3.3 接種量對里氏木霉產(chǎn)酶的影響

根據(jù)微生物的不同，發(fā)酵過程和發(fā)酵條件的不同以及所需的代謝產(chǎn)物不同，適宜的接種量有助于提高產(chǎn)物產(chǎn)量[25]。

由圖6可知，在接種量為2.5%～5.0%時，酶活隨接種量升高而增加；在接種量為7.5%時，酶活最高，為（0.720±0.024）PFU/mL；在接種量＞5.0%之后，酶活開始下降。因此，選擇最佳接種量為5.0%。

圖6 接種量對里氏木霉產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of inoculum on enzyme production by Trichoderma reesei

2.3.4 轉(zhuǎn)速對里氏木霉產(chǎn)酶的影響

里氏木霉是好氧真菌，發(fā)酵液中的氧氣含量對微生物的生長代謝有影響[26]；里氏木霉發(fā)酵過程中會結(jié)成小球，不同轉(zhuǎn)速對此有一定影響。由圖7可知，轉(zhuǎn)速為90～150 r/min時，酶活隨接種量升高而增加；在轉(zhuǎn)速為150 r/min時，酶活最高，為0.78±0.015 PFU/mL；在轉(zhuǎn)速＞150 r/min之后，酶活以后開始下降。發(fā)酵液過高或過低的轉(zhuǎn)速都會對最終產(chǎn)酶有影響。因此，選擇最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖7 轉(zhuǎn)速對里氏木霉產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of speed on enzyme production by Trichoderma reesei

2.3.5 發(fā)酵時間對里氏木霉產(chǎn)酶的影響

微生物的發(fā)酵過程中不同時間段發(fā)酵的主要狀態(tài)和目的是不同的，因此根據(jù)所需要的產(chǎn)物不同其發(fā)酵所需的時間也不同[27]。

由圖8可知，在里氏木霉的水稻秸稈發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，發(fā)酵時間在1～8 d時，隨著發(fā)酵時間延長酶活升高；在發(fā)酵時間為8 d時，酶活最高，為（1.180±0.011）PFU/mL；在發(fā)酵時間超過8 d之后，酶活開始下降。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為8 d。

圖8 發(fā)酵時間對里氏木霉產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of fermentation time on enzyme production by Trichoderma reesei

3 結(jié)論

選擇里氏木霉作為發(fā)酵產(chǎn)酶菌株；通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗對發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基為水稻秸稈15 g/L、（NH4）2SO42 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、吐溫-800.5mL/L、FeSO4·7H2O0.005g/L、微量元素液10 mL/L。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基的條件下：菌株的FPA由0.401 PFU/mL提高至0.612 PFU/mL，提高了52.6%。優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵溫度29 ℃，初始pH 6、接種量5.0%、轉(zhuǎn)速150 r/min、發(fā)酵時間8 d。在此優(yōu)化條件下，酶活為1.12 PFU/mL，提高了83.2%。