蔡 朔，韓疏影，夏浩然，閆郅燁，黃瀟正，趙 明，段金廒*，劉 睿, 3*

·綜 述·

基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用的膠類中藥質(zhì)量控制

蔡 朔1, 2，韓疏影2，夏浩然2，閆郅燁2，黃瀟正2，趙 明1, 2，段金廒1, 2*，劉 睿1, 2, 3*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 3. 江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023

膠類中藥源于動(dòng)物的皮、角、甲等組織部位，經(jīng)提取、濃縮、干燥而形成固體膠塊，是極具特色的傳統(tǒng)中藥。近年來，膠類中藥以其獨(dú)特的滋補(bǔ)功效愈發(fā)受到消費(fèi)者青睞，市場(chǎng)需求不斷擴(kuò)大。然而，膠類中藥原料短缺、有效質(zhì)量控制方法缺乏，導(dǎo)致偽劣膠類中藥及其產(chǎn)品大行其道，嚴(yán)重影響行業(yè)聲譽(yù)，危害人民健康安全?；诖?，中藥行業(yè)的學(xué)者們圍繞膠類中藥的質(zhì)量控制研究不斷創(chuàng)新突破，建立了多種高效、靈敏的膠類中藥質(zhì)量檢測(cè)方法，以確保膠類中藥的質(zhì)量，促進(jìn)行業(yè)健康發(fā)展。從膠類中藥物質(zhì)組成、質(zhì)控方法、基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用的膠類中藥質(zhì)控方法等方面系統(tǒng)闡述了膠類中藥的質(zhì)控研究現(xiàn)狀，為進(jìn)一步構(gòu)建和完善科學(xué)合理的質(zhì)控體系提供參考，以期推動(dòng)膠類中藥及行業(yè)健康發(fā)展。

膠類中藥；特征肽；發(fā)現(xiàn)；應(yīng)用；質(zhì)量控制；生物標(biāo)志物

膠類中藥是由動(dòng)物的皮、骨、角、甲等部位經(jīng)煎煮、濃縮等工藝制成的固體膠塊，具有悠久的應(yīng)用歷史和鮮明的民族特色。目前，主要的膠類中藥包括《中國(guó)藥典》2020年版收載的阿膠、鹿角膠和龜甲膠3種[1]，以及市場(chǎng)上常見的黃明膠、新阿膠、鱉甲膠、鹿皮膠等；此外，以膠類中藥為原料的衍生產(chǎn)品，如復(fù)方阿膠漿、阿膠補(bǔ)血膏、烏雞白鳳丸、龜鹿補(bǔ)腎丸、阿膠糕、鹿膠糕等得到廣泛應(yīng)用。

隨著生活水平提高及大健康理念的普及與推廣，人們對(duì)于養(yǎng)生補(bǔ)益類中藥的需求增加，其中膠類中藥以其獨(dú)特的滋補(bǔ)功效備受消費(fèi)者青睞，在中醫(yī)臨床和養(yǎng)生保健方面應(yīng)用廣泛。然而，需求的不斷增加導(dǎo)致市場(chǎng)上膠類中藥質(zhì)量參差不齊，摻雜摻假的膠類中藥嚴(yán)重?cái)_亂市場(chǎng)良性競(jìng)爭(zhēng)、危害行業(yè)健康發(fā)展。因此，實(shí)現(xiàn)膠類中藥的準(zhǔn)確鑒別、進(jìn)一步完善膠類中藥的質(zhì)控方法，是亟待解決的問題之一。中藥行業(yè)的學(xué)者們圍繞膠類中藥的質(zhì)量控制研究不斷創(chuàng)新突破，建立了多種高效、靈敏的膠類中藥質(zhì)量檢測(cè)方法。本文從膠類中藥物質(zhì)組成、基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用的膠類中藥質(zhì)控方法等方面系統(tǒng)闡述了膠類中藥的質(zhì)控研究現(xiàn)狀，以期為膠類中藥質(zhì)控方法提升與行業(yè)健康發(fā)展提供新的思路和策略。

1 膠類中藥的物質(zhì)組成

膠類中藥含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸、微量元素等，其中蛋白質(zhì)類成分以膠原蛋白為主。膠原蛋白作為機(jī)體的重要功能性物質(zhì)，遍布于動(dòng)物組織器官中，是體內(nèi)相對(duì)含量最高、分布最廣的蛋白質(zhì)。根據(jù)每條肽鏈上的氨基酸序列及交聯(lián)方式，可分為28種不同類型的膠原[2]。膠原的一級(jí)結(jié)構(gòu)為多肽鏈的氨基酸序列，遵循甘氨酸（glycine，Gly）-X-Y的排列規(guī)則，其中X、Y常代表脯氨酸（proline，Pro）或羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp），穩(wěn)定的Gly-X-Y重復(fù)序列使不同物種的膠原表現(xiàn)出高度的保守特性[3-4]；二級(jí)結(jié)構(gòu)代表單條α螺旋的多肽鏈在空間上呈左手螺旋；3條呈左手α螺旋結(jié)構(gòu)的多肽鏈相互纏繞形成右手復(fù)合螺旋結(jié)構(gòu)，構(gòu)成膠原的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為原膠原或膠原分子；膠原分子首尾相接，錯(cuò)位1/4，按規(guī)則平行排列成束，通過共價(jià)鍵搭接交聯(lián)，形成膠原微纖維，并進(jìn)一步聚集成束形成膠原纖維四級(jí)結(jié)構(gòu)[5-6]，見圖1。

常見膠類中藥的膠原蛋白成分主要源于Ⅰ型膠原、II型膠原及III型膠原[7-8]，I型膠原主要存在于骨、真皮、肌腱、韌帶等多種組織中，是動(dòng)物中含量最豐富且研究最為廣泛的膠原蛋白；II型膠原主要存在于軟骨、玻璃體及髓核中；III型膠原則主要存在于皮膚、血管壁和網(wǎng)狀纖維組織中[9]。以動(dòng)物皮、角、骨、甲等為原料的膠類中藥在制備過程中，膠原蛋白發(fā)生非特異性降解，形成一系列復(fù)雜的膠原降解產(chǎn)物，加之膠類中藥生產(chǎn)過程中添加的輔料，使膠類中藥物質(zhì)組成異常復(fù)雜。

圖1 各級(jí)膠原的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Fig. 1 Structural characteristics of collagen at different levels

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，羥基化、脫酰胺化等翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）[10]存在于膠原蛋白或發(fā)生于膠類中藥加工過程中。Pro與賴氨酸（lysine，Lys）經(jīng)羥基化后轉(zhuǎn)變?yōu)镠yp與羥賴氨酸（hydroxylysine，Hyl）；天門冬酰胺（asparagine，Asn）與谷氨酰胺（glutamine，Gln）脫乙?；髣t轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼幔╝spartate，Asp）與谷氨酸（glutamic acid，Glu）；此外，Hyl還會(huì)進(jìn)一步發(fā)生糖基化修飾，形成半乳糖基化或葡萄糖-半乳糖基化結(jié)構(gòu)[8]，而這些不同修飾情況對(duì)膠原蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性均具有影響。研究表明，Hyp、Hyl的形成有利于維持膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)[11]，糖基化的Hyl則與I型膠原纖維分子間共價(jià)交聯(lián)密切相關(guān)[12]，故羥基化修飾、糖基化修飾與膠原蛋白的結(jié)構(gòu)成型及穩(wěn)定性之間關(guān)聯(lián)較大。本課題組前期研究對(duì)比生鹿皮與經(jīng)熬制提取的鹿皮膠中蛋白修飾位點(diǎn)的類型及數(shù)量，發(fā)現(xiàn)鹿皮經(jīng)過加工提取制成鹿皮膠后，羥基化與脫酰胺修飾位點(diǎn)數(shù)量明顯增加，這2種修飾均可形成羥基基團(tuán)，一定程度上可改善膠原成分的水溶性[13]。研究表明，Hyp的含量與膠原蛋白的熱穩(wěn)定性呈正相關(guān)[14]，且含有羥基化位點(diǎn)的多肽已被證實(shí)存在多種生物活性[15-16]。因此，進(jìn)一步探明膠原蛋白的“修飾信息”對(duì)深入研究其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及性質(zhì)功能具有重要意義。

2 膠類中藥的質(zhì)控方法

膠類中藥通常為經(jīng)過多道工序加工制成的塊狀固體，在外觀、顏色、氣味等方面沒有明顯差異，為建立科學(xué)合理的膠類中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，很多研究從膠類的組成成分、理化性質(zhì)出發(fā)，采用多種方法進(jìn)行檢測(cè)分析，主要有凝膠電泳法、紅外光譜法、元素分析法、氨基酸指紋圖譜法、DNA分子標(biāo)記法。

2.1 凝膠電泳法

李鋒等[17]對(duì)7種常見膠類中藥及雜皮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別，發(fā)現(xiàn)不同來源膠類中藥的電泳圖譜差異明顯，且偽品膠與正品膠的譜帶數(shù)目及泳動(dòng)率均存在較大差異；古今等[18]使用十二烷基硫酸鈉-不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)不同廠家的阿膠、鹿角膠及龜板膠進(jìn)行鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種膠的電泳圖譜具有各自的特征鑒別帶，所以凝膠電泳法對(duì)鑒別膠類中藥具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 紅外光譜法

許長(zhǎng)華等[19]采用傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）和二維紅外光譜技術(shù)（two-dimensional infrared vibrational echo spectroscopy，2D-IR）對(duì)阿膠、黃明膠及偽品阿膠進(jìn)行對(duì)比鑒別，結(jié)果表明FT-IR光譜圖無法區(qū)分，而2D-IR可依據(jù)蛋白質(zhì)成分及含量差異直觀反映出三者紅外光譜圖的區(qū)別，從而加以鑒別區(qū)分；Li等[20]采用近紅外光譜指紋圖譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立了東阿阿膠相似度匹配模型，可特異性識(shí)別東阿阿膠，說明紅外光譜法在膠類中藥的真?zhèn)舞b別與品牌維護(hù)上具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 元素分析法

黃必勝[21]使用原子吸收分光光度法測(cè)定了阿膠、鹿角膠、龜膠中鋅、銅、鐵、錳4種微量元素的含量，并認(rèn)為這些微量元素含量差異與不同膠類中藥性味歸經(jīng)、滋補(bǔ)功效存在內(nèi)在聯(lián)系；王文靜等[22]采用X射線熒光光譜法測(cè)定了不同產(chǎn)地阿膠樣品中元素種類及含量，并繪制元素特征譜，通過與阿膠對(duì)照品元素特征譜的對(duì)比分析，認(rèn)為可以簡(jiǎn)便快速地鑒別阿膠真?zhèn)巍?/p>

2.4 氨基酸指紋圖譜法

李婉斯等[23]采用柱前衍生化法檢測(cè)了10批阿膠中的氨基酸成分，并對(duì)阿膠中17種氨基酸成分進(jìn)行了相似度分析及聚類分析，建立了具有一定專屬性的阿膠指紋圖譜；周芳妍等[24]測(cè)定了鹿角膠中18種氨基酸，建立了鹿角膠的氨基酸成分指紋圖譜，為鹿角膠的質(zhì)控提供了一種參考方法。

2.5 DNA分子標(biāo)記法

近年來，DNA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于膠類中藥的原料鑒別[25-26]，但在膠類中藥制品的鑒別中無法成為普適性方法，其原因在于成品膠塊經(jīng)過加工提取后，物種特定DNA片段存量低，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增后容易產(chǎn)生假陽性或假陰性檢測(cè)結(jié)果[27-28]。Zhang等[29]采用TaqMan探針方法將特異性探針引入實(shí)時(shí)定量PCR，分析阿膠中驢源DNA特性并尋找潛在摻假物如馬、牛、豬源DNA，證明此改進(jìn)方法可用于鑒定阿膠中驢源DNA的純度以及摻假情況。

2.6 基于特征肽發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用的質(zhì)控方法

《中國(guó)藥典》2020年版中阿膠、鹿角膠及龜甲膠鑒別項(xiàng)下采用了液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，在多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式下，對(duì)特征離子進(jìn)行檢測(cè)以鑒別樣品真?zhèn)??；谝?質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）檢測(cè)物種特征肽的方法，憑借高專屬性優(yōu)勢(shì)，成為近年來膠類中藥鑒別的研究熱點(diǎn)[30-32]。Cheng等[33-34]結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，尋找鹿角膠、龜甲膠、阿膠、牛皮膠及豬皮膠的特征離子及其對(duì)應(yīng)的特征肽段，驗(yàn)證了特征肽段的物種專屬性并形成了相關(guān)質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；Li等[35]基于生物信息學(xué)方法比較了驢、馬、牛、豬的膠原蛋白序列中的潛在物種差異肽段，并通過實(shí)驗(yàn)確定了4種動(dòng)物的特征肽，可用于阿膠的真?zhèn)舞b別及馬、牛、豬雜皮源的檢測(cè)。

凝膠電泳法、紅外光譜法等集中于分析膠類中藥主要成分（膠原蛋白等）的理化性質(zhì)差異，但由于動(dòng)物膠原蛋白的高度同源性，極大地限制了此類鑒別方法的準(zhǔn)確性與普適性。元素、氨基酸分析法等以組成成分的種類及含量差異建立指紋圖片以圖鑒別真?zhèn)?，但膠類中藥與其偽劣膠產(chǎn)品之間成分組成相似，以元素、氨基酸等非專屬性成分為檢測(cè)指標(biāo)均難以準(zhǔn)確鑒別真?zhèn)?。基于特征肽發(fā)現(xiàn)的分析策略已逐漸成為目前膠類中藥鑒別的主流方法，其檢測(cè)原理是基于不同物種間的同源肽段氨基酸序列之間的差異，此差異在LC-MS中表現(xiàn)為同源肽段母離子與子離子在質(zhì)荷比上的不同，通過檢測(cè)這些肽段的MRM信息，可實(shí)現(xiàn)不同來源膠類中藥的鑒別。基于特征肽發(fā)現(xiàn)的分析策略應(yīng)用于膠類中藥的質(zhì)控，具有較高專屬性及較好普適性，其主要研究思路與方法包括特征肽的發(fā)現(xiàn)和在質(zhì)量控制中的應(yīng)用等方面。

2.6.1 特征肽發(fā)現(xiàn)的方法與策略

（1）基于化學(xué)物質(zhì)組與多元統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)特征肽（圖2-A）：Cheng等[33]采用超高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）得到了鹿角膠、龜甲膠、阿膠、牛皮膠及豬皮膠的胰酶酶解物總離子流圖，使用多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)5種膠原肽圖進(jìn)行了主成分分析（primary component analysis，PCA），結(jié)合正交偏最小二乘法比較出各個(gè)物種的差異性特征離子，并通過Mascot網(wǎng)絡(luò)檢索這些物種的特征離子進(jìn)而歸屬肽段，分別得到1個(gè)鹿源、3個(gè)龜源、4個(gè)驢源、4個(gè)牛源及3個(gè)豬源特征肽序列，進(jìn)一步通過合成特征肽驗(yàn)證了其專屬性。此方法基于酶解物中大量特征離子的數(shù)據(jù)信息，采用多元統(tǒng)計(jì)的分析方法，從大量數(shù)據(jù)中提取出關(guān)鍵離子信息以發(fā)現(xiàn)特征肽，因此要求有足夠的樣本量以保證特征肽離子的準(zhǔn)確性；同時(shí)，部分特征離子由于序列尚未被數(shù)據(jù)庫收載，特征肽序列信息的準(zhǔn)確性有待確證，一定程度上限制了這些特征離子在膠類中藥專屬性鑒別方面的應(yīng)用[34]。

（2）基于生物信息學(xué)比較分析發(fā)現(xiàn)特征肽（圖2-B）：Li等[35]基于生物信息學(xué)分析了阿膠的潛在特征肽，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)篩選驗(yàn)證。首先通過鳥槍法蛋白質(zhì)鑒定分析驢、馬、牛、豬皮中主要膠原蛋白類型，基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲取各物種相應(yīng)類型膠原蛋白的序列信息后，使用BioEdit序列比對(duì)編輯器軟件尋找不同動(dòng)物序列中的差異氨基酸位點(diǎn)，并以含差異位點(diǎn)的胰蛋白酶酶切肽段為潛在的目標(biāo)特征肽，通過LC-MS/MS對(duì)這些潛在特征肽進(jìn)行檢測(cè)，以序列長(zhǎng)短、檢測(cè)專屬性為標(biāo)準(zhǔn)篩選，最終獲得了具有良好專屬性的6條不同物種的特征肽。王芳等[36]基于生物信息學(xué)分析結(jié)合UPLC-QTOF-MS檢測(cè)到與預(yù)測(cè)結(jié)果匹配的1條驢皮特征肽，可用于阿膠與豬皮、牛皮膠的鑒別區(qū)分。生物信息學(xué)分析比較是基于已知的物種蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)特征肽的方法，可行性與準(zhǔn)確度較高，但是基于已知序列的分析并未包含特征肽的PTM信息，因而仍可能缺失部分特征肽信息。此外，生物信息分析獲得的理論存在的特征肽，可能由于樣品前處理、肽段穩(wěn)定性、離子化效率等方面影響，并不能在樣品中檢出，從而限制了此方法的實(shí)際應(yīng)用。

（3）基于多肽組與數(shù)學(xué)集合比較分析發(fā)現(xiàn)特征肽：Liu等[37]采用數(shù)學(xué)集合理論解釋了不同物種與目標(biāo)物種酶解多肽之間的關(guān)系，建立了一種新的特征肽發(fā)現(xiàn)策略（圖2-C）：基于非靶向質(zhì)譜方法分析目標(biāo)動(dòng)物膠與其他偽品膠的酶解肽圖譜，取不同批次目標(biāo)樣品肽段的交集設(shè)為集合I，取其他各偽品、各批次樣品中肽段的并集為集合II。集合I與集合II的交集部分為正品與偽品物種的共有肽段，不具有特異性，故將集合I中此交集部分肽段去除后，集合I中的剩余肽段即構(gòu)成了具有潛在特征肽的目標(biāo)差異集合，進(jìn)一步分析差異集合中的特征肽并進(jìn)行靶向質(zhì)譜驗(yàn)證，確立了可用于專屬性鑒別的2條鹿源特征肽的氨基酸序列，及6條含有不同PTM組合的特征肽。進(jìn)一步通過同源肽段序列比對(duì)，確定了驢、馬、牛、豬中的同源肽亦可作為識(shí)別相應(yīng)物種的特征肽。此方法較生物信息學(xué)預(yù)測(cè)步驟更為簡(jiǎn)便，基于實(shí)際樣品酶解肽圖的數(shù)學(xué)集合分析，通過排除法去除非特異性肽段，確定的特征肽段還包含了不同的PTM信息，可最大限度的發(fā)現(xiàn)特征肽，且發(fā)現(xiàn)的特征肽段均可在真實(shí)樣品中被檢測(cè)到，因此具有更高的可行性與可信度。

A-多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 B-生物信息學(xué)預(yù)測(cè) C-數(shù)學(xué)集合分析 D-LFQ篩選

（4）基于定量多肽組與修飾組結(jié)合比較分析發(fā)現(xiàn)特征肽：在實(shí)現(xiàn)不同物種來源膠原鑒別的基礎(chǔ)上，Han等[38]基于非標(biāo)記定量（label-free quantification，LFQ）多肽組學(xué)結(jié)合糖基化位點(diǎn)分析方法，篩選了含量差異特征肽，如圖2-D所示。首先采用納升液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（nano-LC-MS/MS）全面檢測(cè)并定量了鹿角膠及鹿皮膠的酶解肽段，結(jié)合PCA、火山圖和熱圖對(duì)比尋找具有潛在差異的糖基化肽段，通過質(zhì)譜的MRM模式篩選并確證了4條含有糖基化修飾位點(diǎn)的，且相對(duì)含量存在顯著性差異的鹿角特征肽，根據(jù)特征肽的相對(duì)含量差異可區(qū)分鹿角與鹿皮樣品，從而可實(shí)現(xiàn)相同基原不同部位來源的鹿角、鹿皮膠原產(chǎn)品的鑒別區(qū)分和相對(duì)摻偽定量，為進(jìn)一步提高膠類中藥的精準(zhǔn)鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一種新的研究思路。

2.6.2 特征肽在膠類中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用 特征肽作為具有物種差異性的生物標(biāo)志物，可以有效解決膠類中藥真?zhèn)舞b別問題。相比其他利用理化性質(zhì)差異區(qū)分正品與偽品的鑒別方法，基于質(zhì)譜檢測(cè)的特征肽技術(shù)具有一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)即可同時(shí)設(shè)定多個(gè)物種特征肽離子信息作為檢測(cè)指標(biāo)，在實(shí)現(xiàn)真?zhèn)舞b別的同時(shí)，可進(jìn)一步準(zhǔn)確判定摻偽成分并對(duì)摻偽成分相對(duì)定量?！吨袊?guó)藥典》2020年版規(guī)定了阿膠、鹿角膠及龜甲膠中必須檢出相應(yīng)的物種特征離子，并頒布了偽品添加如豬皮、牛皮的特征肽補(bǔ)充檢驗(yàn)方法；也有許多研究采用不同類型的偽品作為陰性對(duì)照，以篩選可用于膠類中藥鑒別的特征肽段。本文整理了部分具有代表性的特征肽信息，見表1。

（1）基于特征肽判別膠類中藥真?zhèn)闻c摻假情況：以物種專屬的特征肽“有”或“無”作為指標(biāo)，可對(duì)膠類中藥的真?zhèn)芜M(jìn)行判別。如在鑒別阿膠樣品時(shí)，設(shè)定驢源特征肽離子對(duì)用于檢測(cè)樣品是否來源于驢皮，同時(shí)可設(shè)定多個(gè)偽品物種同源特征肽離子對(duì)，如牛、馬、豬、羊等的特征肽離子對(duì)，正品阿膠僅可檢測(cè)出驢源特征肽，若未檢出驢源特征肽，則為偽品；若在檢出驢源特征肽的同時(shí)檢測(cè)到其他物種的特征肽，則為摻偽品?；谔卣麟臋z測(cè)的方法適用于各種膠類中藥的鑒別，可有效判別膠類中藥的真?zhèn)渭皳郊偾闆r。

表1 代表性膠類中藥特征肽信息

Table 1 Characteristic peptide information of representative gelatinous Chinese materia medica

類別特征肽序列特征離子m/z文獻(xiàn) 阿膠GPTGEPGKPGDK380.7 → 374.830,35 GPpGAAGPpGpR 539.8 → 612.4，539.8 → 923.834,39 HGDRGEpGPVGSVGPVGAVGPRGpSGPQGVRGDK**645.5 → 659.840-41 GPTGEPGK371.7 → 487.340-41 HGDRGEpGPVGSVGPVGAVGPR691.0 → 809.4 42 GPTGEpGKPGDK578.3 → 714.4，578.3 → 900.443 GppGAAGPPGLR 539.8 → 924.5，539.8 → 612.343 SGQPGTVGPAGVR591.8 → 910.5，591.8 → 455.843 GPAGPTGPVGK469.3 → 783.4，469.3 → 655.343 GPPGPVGppGLAGpPGESGR600.9 → 958.5，600.9 →772.443 SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR649.7 → 955.4，649.7 → 556.343 GEAGPAGPAGPIGPVGAR765.9 → 1 048.6，765.9 → 991.643 GDGGPpGVTGFpGAAGR751.4 → 849.4，751.4 → 608.343 GEPGpVGSVGPVGAVGPR535 6 → 809.5，535 6 → 556.343 GLPGVAGSLGEpGpLGIAGpPGAR716.0 → 641.3，716.0 → 570.343 DGTSGHPGPIGPPGPR519.6 → 596.3，519.6 → 442.444 GPPGESGAAGPAGPIGSR517.6 → 586.3，517.6 → 797.344 PGEAGPPGPPGPAGEK731.8 → 1 035.5，731.8 → 300.144 GPPGPMGPPGIAGPPGESGR595.6 → 756.4，595.6 → 699.344 GPNGEPGSTGPAGPPGIR825.9 → 1 195.6，825.9 → 837.544 DGTLGHPGPIGPPGPR514.3 → 596.3，514.3 → 442.244 GEQGPAGPPGFQGIPGPAGTAGEVGKPGER940.8 → 474.2，940.8 → 756.444 TGPPGPSGISGPPGPPGAAGK602.0 → 767.4，602.0 → 689.944 PGPTGLEGPPGER640.3 → 741.4，640.3 → 511.344 GPAGPTGPVGK469.3 → 783.4，469.3 → 712.444 GIPGVAGSIGEPGPIGIAGPPGAR715.7 → 641.3，715.7 → 570.344 GIPGPAGAAGATGAR620.3 → 602.3，620.3 → 715.444 GPPGPVGPPGIAGPPGESGR893.0 → 1 264.6，893.0 → 1 207.644 GIPGVAGSIGEPGPIGIAGPPGAR1 073.1 → 513.3，1 073.1 → 416.244 GEPGPVGSVGPVGAVGPR802.9 → 809.5，802.9 → 1 052.644 GPAGPNGIPGEK555.8 → 446.2，555.8 → 885.444 GAPGAVGAPGPAGANGDRGEAGAAGPAGPAGPR914.4 → 1 073.5，914.4 → 1 137.544 GEPGPTGLPGPPGER733.3 → 741.4，733.3 → 640.344 GETGPSGPAGPTGAR656.3 → 967.5，656.3 → 870.444 SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR649.3 → 766.5，649.3 → 955.444 IGAPGIIGIPGSR620.4 → 535.3，620.4 → 731.444 GLTGPIGPPGPAGAPGDKGETGPSGPAGPTGAR961.8 → 1 173.6，961.8 → 1 145.144 VGPPGPSGNAGPPGPPGPVGK614.6 → 837.4，614.6 → 667.444 GSPGGPGAAGFPGAR652.3 → 580.8，652.3 → 691.444 EGSPGAEGSPGR566.7 → 430.2，566.7 → 859.444

續(xù)表1

續(xù)表1

類別特征肽序列特征離子m/z文獻(xiàn) 鱉甲膠GETGPVGVTGSVGPAGAR784.9 → 872.5，784.9 → 1 028.651 GLpGQpGDSGPAGK635.3 → 801.1，635.3 → 516.252 DGEAGAQGPPGAAGPAGER832.9 → 979.5，832.9 → 1 036.550 GEVGPQGAIGPAGSSGPAGPIGAAGPAGSR834.1 → 743.4，834.1 → 953.550 牛皮膠GEGGPQGPR427.8 → 668.335 GPPGESGAAGPTGPIGSR 790.934 IGQpGAVGPAGIR 604.8 34 SGETGASGPpGFVGEK746.9 → 846.542 GYpGDAGPVGAAGApGPQGPVGPVGK755.0 → 553.442 GETGPAGPAGPIGPVGAR780.931 GEAGPSGPAGPTGAR641.3 → 726. 2，641.3 → 783.333,39 豬皮膠GPTGPAGVR406.6 → 556.835 AGVMGPPGSR473.0 → 718. 2，473.0 → 586.332 GEPGPTGVQGPPGPAGEEGK 925.4 → 832.6，925.4 → 1 011.534,53 TGETGASGPpGFAGEK739.9 → 818.542 GYpGNPGPAGAAGApGPQGAVGPAGK736.0 → 526.442 GETGPAGPAGPVGPVGAR 774.5 → 977.8，774.5 → 752.534,39 馬皮膠GASGPAGVR**386.3 → 499.3，386.3 → 643.335,54 GPSGEPGKPGDK**563.2 → 416.2，563.2 → 698.435,54 LSVEADIDGLR594.331 ISGEWYSIFLASDVK857.931 HGHRGEpGPVGSVGPVGAVGPRGpSGPQGVRGDK**649.7 → 670.840 GPSGEPGK364.7 → 487.340 HGHRGEpGPVGSVGPVGAVGPR698.3 → 809.442 羊皮膠TGEPGAAGPPGFVGEK751.9 → 903.5，751.9 → 846.632 GPAGPTGPAGK455.2 → 684.4，455.2 → 755.4，455.2 → 627.355 GFpGSDGVAGPK553.0 → 450.9，553.0 → 787.556

p-羥脯氨酸 k-羥賴氨酸*肽段為鹿皮膠與鹿角膠共有特征肽△肽段用于區(qū)分鹿皮膠與鹿角膠**肽段為騾皮膠共有特征肽

p-hydroxyproline k-hydroxylysine*peptides are shared by deer-skin gelatin and deer-horn gelatin△peptides are used to distinguish deer-skin gelatin and deer-horn gelatin**peptides are shared by mule-skin gelatin

（2）基于特征肽相對(duì)含量判別膠類中藥摻偽比例：僅以物種特征肽的“有”或“無”作為指標(biāo)并不能全面評(píng)價(jià)膠類中藥質(zhì)量，市場(chǎng)上的膠類中藥可能因多種原因混入偽品原料而生產(chǎn)出摻有偽品的膠類產(chǎn)品。因此，《中國(guó)藥典》2020年版補(bǔ)充檢驗(yàn)方法結(jié)合市場(chǎng)調(diào)研與檢測(cè)方法的差異，將雜皮含量不超過5%限度的膠類中藥產(chǎn)品視為合格品[57]。在真?zhèn)舞b別的基礎(chǔ)上，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)特征肽進(jìn)行定量分析，建立科學(xué)合理的摻偽比例測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)膠類中藥產(chǎn)品的“優(yōu)劣評(píng)價(jià)”。

《中國(guó)藥典》2020年版中阿膠含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)2種驢源多肽設(shè)立限度要求，采用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)不同濃度驢源多肽的對(duì)照品溶液，以對(duì)照品峰面積對(duì)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的多肽含量。但是，具有不同序列的肽段在離子化效率上存在差異，質(zhì)譜響應(yīng)與肽段豐度并不直接相關(guān)[58]。目前多種標(biāo)記和非標(biāo)記方法被開發(fā)應(yīng)用于蛋白質(zhì)定量組學(xué)，根據(jù)目的要求可分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量方法，其中常用的同位素標(biāo)記法多用于小分子蛋白、多肽的絕對(duì)定量，方法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性高，但同位素標(biāo)記成本過高，因此，針對(duì)特征肽的準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的定量方法仍需進(jìn)一步探索。

研究表明，摻偽樣品中偽品物種特征肽相對(duì)含量與偽品摻入量呈線性相關(guān)，可用于摻偽比例的相對(duì)定量[42,59]。如檢測(cè)鹿皮膠中偽品牛皮的摻入量時(shí)，以牛皮及鹿皮特征肽為指標(biāo)，檢測(cè)不同濃度比例的牛皮膠與鹿皮膠的混合酶解液，以偽品牛皮特征肽相對(duì)峰面積（牛皮特征肽/鹿皮特征肽）對(duì)牛皮摻偽比值（牛皮/鹿皮）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3-A所示，可用于測(cè)定鹿皮膠樣品中牛皮的摻雜量。研究證明，特征肽相對(duì)含量（偽品特征肽/正品特征肽）與偽品摻入比例（偽品/正品）線性關(guān)系良好，適用于膠類中藥中偽品摻入比例的測(cè)定。Han等[38]利用鹿角膠、鹿皮膠中的差異性鹿角特征肽，同樣建立了鹿角膠中鹿皮膠的摻入比例測(cè)定方法。以鹿角特征肽Pep-G1的峰面積除以內(nèi)參肽Pep-R的峰面積，計(jì)算不同鹿皮膠摻入量情況下的鹿角膠樣品中鹿角特征肽Pep-G1的相對(duì)含量，即Pep-G1/Pep-R，并以鹿角特征肽相對(duì)含量為縱坐標(biāo)，摻偽量為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3-B所示，結(jié)果線性關(guān)系良好，可用于鹿角膠中鹿皮膠摻入比例的測(cè)定。

圖3 特征肽相對(duì)含量與摻偽比例的線性關(guān)系

（3）PTM在特征肽檢測(cè)中的應(yīng)用：特征肽檢測(cè)應(yīng)用于膠類中藥的質(zhì)量控制，首先應(yīng)以正品特征肽的“有”和偽品特征肽的“無”為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，判斷真?zhèn)吻闆r或摻偽情況；再對(duì)存在摻偽的膠類產(chǎn)品進(jìn)一步評(píng)價(jià)，通過測(cè)定特征肽的相對(duì)含量計(jì)算摻偽比例；最終根據(jù)結(jié)果是否符合《中國(guó)藥典》2020年版中特征肽的檢測(cè)要求、含量限度要求及雜皮偽品含量限度要求評(píng)判產(chǎn)品質(zhì)量是否合格，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)較為全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)。針對(duì)在應(yīng)用中尚未解決的問題，仍需在發(fā)展和創(chuàng)新中不斷結(jié)合實(shí)際、完善質(zhì)量控制體系。

在特征肽的發(fā)現(xiàn)和尋找過程中，含有修飾位點(diǎn)的氨基酸序列值得關(guān)注。Hyp為具羥基化修飾的Pro，在除膠原蛋白外的其他蛋白中較少見，因此選擇含有Hyp的肽段作為動(dòng)物膠原鑒別的特征肽更具有特異性。另外，由于羥基化修飾與膠原的熱穩(wěn)定性呈正相關(guān)，因此在經(jīng)過高溫熬制的膠類中藥產(chǎn)品中，含Hyp的特征肽相對(duì)穩(wěn)定性較高，更適用于鑒別檢測(cè)，而含有甲基化、磷酸化、谷氨酸-末端環(huán)化等不穩(wěn)定修飾的肽段則不被考慮[55]。

修飾位點(diǎn)的存在也豐富了可用于鑒別及含量測(cè)定的特征肽指標(biāo)，Liu等[37]在鹿皮膠特征肽尋找過程中發(fā)現(xiàn)，在序列不同位點(diǎn)發(fā)生PTM但氨基酸序列相同的特征肽段，均可認(rèn)為是鹿皮膠的特征肽。在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，基本序列為GYPGNA GPVGTAGAPGPQGPVGPTGK的鹿源特征肽中的Pro、Asn、Gln均存在修飾，不同的修飾組合均可認(rèn)為是鹿源特征肽，如不同組合PTM的肽段有GYP（＋15.99）GNAGPVGTAGAP（＋15.99）GPQGPVGPTGK、GYP（＋15.99）GN（＋0.98）AGPVGTAGAP（＋15.99）GPQGPVGPTGK、GYP（＋15.99）GN（＋0.98）AGPV GTAGAP（＋15.99）GPQ（＋0.98）GPVGPTGK，其中＋15.99表示羥基化修飾，＋0.98表示脫酰胺化修飾，上述3個(gè)肽段均為鹿源特征肽，可用于鹿皮膠的專屬性檢測(cè)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)在后續(xù)研究中也得到證實(shí)：鹿皮膠樣品中均可檢測(cè)到上述3條肽段，且在其他動(dòng)物膠原中未檢出[42]。由此可見，在特征肽的尋找發(fā)現(xiàn)過程中，不同PTM增加了可檢測(cè)的特征肽種類，對(duì)膠類中藥質(zhì)控方法的提升是有益的幫助與補(bǔ)充。

3 結(jié)語與展望

結(jié)合高分辨率質(zhì)譜檢測(cè)物種特征肽，已被證明可實(shí)現(xiàn)物種的準(zhǔn)確溯源。《中國(guó)藥典》2020年版在阿膠、鹿角膠、龜甲膠鑒別項(xiàng)下，均規(guī)定采用基于串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式下檢測(cè)專屬性離子對(duì)的方法，而含量測(cè)定項(xiàng)下阿膠以2個(gè)驢源多肽以及Hyp、Pro、Gly、丙氨酸的含量為指標(biāo)，鹿角膠、龜甲膠僅以這4種氨基酸的含量為指標(biāo)。物種特征肽段的質(zhì)譜檢測(cè)方法已經(jīng)被《中國(guó)藥典》2020年版收載，表明以特征肽鑒別膠類中藥的方法是可行的，但基于特征肽絕對(duì)定量的膠類中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法尚需要進(jìn)一步豐富與完善，這是未來膠類中藥質(zhì)量控制研究的方向之一。

基于已被研究證實(shí)具有物種高度專屬性的特征肽，本文提出建立膠類中藥的多維評(píng)價(jià)體系：（1）根據(jù)檢測(cè)膠類中藥產(chǎn)品中目標(biāo)正品特征肽和各種偽品特征肽的“有無”判斷其真?zhèn)渭皳絺吻闆r，分為正品、摻偽品、純偽品。（2）根據(jù)特征肽相對(duì)含量關(guān)系測(cè)定摻偽品的摻偽比例，進(jìn)一步判斷產(chǎn)品質(zhì)量的“優(yōu)劣”情況。（3）根據(jù)對(duì)膠類中藥特征肽建立的檢測(cè)要求及含量限度要求最終評(píng)判產(chǎn)品質(zhì)量是否合格。該體系的核心在于選擇的特征肽應(yīng)具有高度的物種專屬性和檢測(cè)穩(wěn)定性。本文綜合論述了幾種發(fā)現(xiàn)、確定特征肽的方法策略，并介紹了修飾位點(diǎn)在特征肽確立及檢測(cè)中的重要作用，為發(fā)現(xiàn)更多可用于質(zhì)量檢測(cè)的物種特征肽提供了新的思路。

穩(wěn)定的物種特異性是特征肽最重要的特性，將其作為質(zhì)量檢測(cè)的生物標(biāo)志物可解決動(dòng)物膠原蛋白高度同源性的區(qū)分難題。基于特征肽檢測(cè)建立科學(xué)、全面的膠類中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究，可從以下方向進(jìn)一步展開：（1）深入研究膠原蛋白中廣泛存在的不同修飾類型與數(shù)量，關(guān)聯(lián)特征肽序列中可能具有的各種修飾，豐富物種專屬性鑒別、不同部位特征區(qū)分及含量測(cè)定的標(biāo)志成分。（2）針對(duì)含有膠類中藥的多種處方制劑及保健食品中特征肽標(biāo)志物含量可能較低的情況，探索建立微量標(biāo)志成分的檢測(cè)方法。（3）多方面考察質(zhì)譜檢測(cè)中特征肽響應(yīng)的影響因素，完善特征肽含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證，建立便捷穩(wěn)定、可重復(fù)性高的特征肽絕對(duì)定量測(cè)定方法，有利于進(jìn)一步評(píng)價(jià)膠類產(chǎn)品質(zhì)量以及優(yōu)化制膠工藝。隨著科學(xué)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展和相關(guān)理論研究的不斷深入，結(jié)合先進(jìn)技術(shù)和創(chuàng)新理念用于膠類中藥的質(zhì)控研究，才能更好地促進(jìn)產(chǎn)品的質(zhì)量提升和市場(chǎng)有序發(fā)展，進(jìn)一步保障人民群眾的健康安全。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 187-188, 197-198, 335-336.

[2] Ricard-Blum S. The collagen family [J]., 2011, 3(1): a004978.

[3] Boot-Handford R P, Tuckwell D S. Fibrillar collagen: The key to vertebrate evolution? A tale of molecular incest [J]., 2003, 25(2): 142-151.

[4] Kleinnijenhuis A J. Visualization of genetic drift processes using the conserved collagen 1α1 GXY domain [J]., 2019, 87(2/3): 106-130.

[5] Hu Y, Liu L, Gu Z P,. Modification of collagen with a natural derived cross-linker, alginate dialdehyde [J]., 2014, 102: 324-332.

[6] Liu X H, Zheng C, Luo X M,. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications [J]., 2019, 99: 1509-1522.

[7] Yang C T, Ghosh D, Beaudry F. Detection of gelatin adulteration using bio-informatics, proteomics and high-resolution mass spectrometry [J]., 2018, 35(4): 599-608.

[8] 劉睿, 蔡朔, 趙珂璇, 等. 鹿皮膠I型膠原賴氨酸位點(diǎn)的羥基化與-糖基化修飾分析 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2021, 46(3): 591-598.

[9] Gelse K, P?schl E, Aigner T. Collagens: Structure, function, and biosynthesis [J]., 2003, 55(12): 1531-1546.

[10] Mertins P, Qiao J W, Patel J,. Integrated proteomic analysis of post-translational modifications by serial enrichment [J]., 2013, 10(7): 634-637.

[11] Ma F F, Sun R X, Tremmel D M,. Large-scale differentiation and site specific discrimination of hydroxyproline isomers by electron transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD) mass spectrometry [J]., 2018, 90(9): 5857-5864.

[12] Yamauchi M, Shiiba M. Lysine hydroxylation and cross-linking of collagen [J]., 2008, 446: 95-108.

[13] 劉睿, 朱悅, 鄭云楓, 等. 基于“多肽組-修飾組”比較分析鹿皮與鹿皮膠物質(zhì)基礎(chǔ) [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 55(8): 1882-1888.

[14] 焦昀. 羥基化修飾對(duì)膠原熱穩(wěn)定性影響研究 [D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[15] Taga Y, Iwasaki Y, Shigemura Y,. Improvedtracking of orally administered collagen hydrolysate using stable isotope labeling and LC-MS techniques [J]., 2019, 67(16): 4671-4678.

[16] Gjaltema R A, Bank R A. Molecular insights into prolyl and lysyl hydroxylation of fibrillar collagens in health and disease [J]., 2017, 52(1): 74-95.

[17] 李鋒, 張振秋, 任子和, 鄒榮華. 七種動(dòng)物膠類藥材的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別 [J]. 中藥材, 1999, 22(4): 184-185.

[18] 古今, 劉萍, 胡景華. 三種動(dòng)物膠的SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺電泳法鑒別 [J]. 北京中醫(yī), 2003, 22(1): 33-34.

[19] 許長(zhǎng)華, 周群, 孫素琴, 王寶琹. 二維相關(guān)紅外光譜法與阿膠的真?zhèn)舞b別 [J]. 分析化學(xué), 2005, 33(2): 221-224.

[20] Li W L, Han H F, Zhang L,. Manufacturer identification and storage time determination of “Dong’e Ejiao” using near infrared spectroscopy and chemometrics [J]., 2016, 17(5): 382-390.

[21] 黃必勝. 阿膠龜膠和鹿角膠中微量元素的測(cè)定與分析 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2001, 12(6): 487.

[22] 王文靜, 關(guān)穎, 朱艷英. 阿膠真?zhèn)纹返腦射線熒光光譜的鑒別研究 [J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2007, 27(9): 1866-1868.

[23] 李婉斯, 李婷, 陸春怡, 等. 基于HPLC指紋圖譜及聚類分析評(píng)價(jià)市售阿膠的質(zhì)量 [J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 31(6): 91-96.

[24] 周芳妍, 李婷, 劉力, 等. 鹿角膠中氨基酸類成分的HPLC指紋圖譜 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(9): 47-51.

[25] 羅暉明, 肖炳燚, 聶平, 等. 阿膠原料驢源性成分的DNA分子鑒別方法 [J]. 藥物分析雜志, 2017, 37(2): 202-211.

[26] Zuo H L, Zhao J, Wang Y T,. Identification of the adulteratedwith cytochrome c oxidase subunit I gene-based polymerase chain reaction [J]., 2017, 9(4): 313-318.

[27] Kleinnijenhuis A J, van Holthoon F L, Herregods G. Validation and theoretical justification of an LC-MS method for the animal species specific detection of gelatin [J]., 2018, 243: 461-467.

[28] Grundy H H, Reece P, Buckley M,. A mass spectrometry method for the determination of the species of origin of gelatine in foods and pharmaceutical products [J]., 2016, 190: 276-284.

[29] Zhang W J, Cui S H, Cheng X L,. An optimized taqman real-time pcr method for authentication of(donkey-hide gelatin) [J]., 2019, 170: 196-203.

[30] 石峰, 杭寶建, 遲連利, 等. 驢皮特征肽的發(fā)現(xiàn)及其在阿膠鑒別中的應(yīng)用 [J]. 藥物分析雜志, 2017, 37(12): 2272-2278.

[31] 房芳, 張九凱, 馬雪婷, 等. 基于特征肽段的阿膠中異源性物種鑒別 [J]. 食品科學(xué), 2019, 40(16): 267-273.

[32] 張靜嫻, 胡青, 董洪霜, 等. 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法用于阿膠糕類食品中阿膠的鑒別及馬、牛、羊、豬皮源成分的檢測(cè) [J]. 世界中醫(yī)藥, 2019, 14(4): 828-832.

[33] Cheng X L, Wei F, Xiao X Y,. Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS) using principal component analysis [J]., 2012, 62: 191-195.

[34] 程顯隆. 膠類藥材質(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)研究 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2014.

[35] Li X, Shi F, Gong L P,. Species-specific identification of collagen components inusing a nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry proteomics approach [J]., 2017, 12: 4443-4454.

[36] 王芳, 范雨, 葉茂, 等. 基于生物信息學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的阿膠特異性肽段篩選與鑒定 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2019, 21(9): 1256-1261.

[37] Liu R, Huang Y, Xu H K,. A strategy for identifying species-specific peptide biomarkers in deer-hide gelatin using untargeted and targeted mass spectrometry approaches [J]., 2019, 1092: 32-41.

[38] Han S Y, Zhao K X, Cai S,. Discovery of peptide biomarkers by label-free peptidomics for discrimination of horn gelatin and hide gelatin fromTemminck [J]., 2021, 363: 130347.

[39] 程顯隆, 陳佳, 李明華, 等. 特征肽段檢測(cè)技術(shù)用于膠類藥材專屬性鑒別方法研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2015, 50(2): 104-108.

[40] Cai S, Zhao K X, Jiang M T,. Collagen derived species-specific peptides for distinguishing donkey-hide gelatin () [J]., 2021, 13(2): 261-266.

[41] 劉睿, 趙珂璇, 蔡朔, 等. 一種利用蛋白質(zhì)內(nèi)切酶切割膠原蛋白獲得專屬性肽段的方法和應(yīng)用: 中國(guó), CN111239302A [P]. 2020-06-05.

[42] Cai S, Jiang M T, Zhao K X,. A quantitative strategy of ultrasound-assisted digestion combined UPLC-MS/MS for rapid identifying species-specific peptide markers in the application of food gelatin authentication [J]., 2021, 147: 111590.

[43] 季申, 胡青, 張靜嫻, 等. 一組驢源性特征肽和一種鑒定阿膠或阿膠制品的方法: 中國(guó), CN109142598A [P]. 2019-01-04.

[44] 張鴻偉, 張曉梅, 梁成珠, 等. 一組鑒別阿膠及其制品中驢源性成分的多肽: 中國(guó), CN105842375A [P]. 2016-08-10.

[45] 石峰, 陳曉, 鞏麗萍, 等. 一組驢源性特征肽及其在驢皮和阿膠膠定性檢測(cè)中的應(yīng)用流程: 中國(guó), CN106589063A [P]. 2017-04-26.

[46] Yang H, Shen Y P, Xu Y,. A novel strategy for the discrimination of gelatinous Chinese medicines based on enzymatic digestion followed by nano-flow liquid chromatography in tandem with orbitrap mass spectrum detection [J]., 2015, 10: 4947-4955.

[47] 秦玉峰, 尤金花, 周祥山, 等. 一種膠類中藥及其制品中龜源性成分的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法: 中國(guó), CN103630644A [P]. 2014-03-12.

[48] Tang M, Yan J Y, Ren J,. Differentiatingshell glue fromshell glue by UPLC-QTOF/MS coupled with binary compare tool of UNIFI [J]., 2019, 2(1): 50-58.

[49] 劉宇文, 諶宇, 鄭娟, 等. 液質(zhì)聯(lián)用多肽識(shí)別技術(shù)用于龜甲的鑒別研究 [J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2020, 30(4): 408-409.

[50] 李國(guó)衛(wèi), 何民友, 胡綺萍, 等. 用于鱉甲和龜甲檢測(cè)的特征多肽組合的篩選方法和應(yīng)用: 中國(guó), CN114354772A [P]. 2022-04-15.

[51] 劉宇文, 楊直, 諶宇, 等. 液質(zhì)聯(lián)用多肽識(shí)別技術(shù)鑒別鱉甲膠的研究 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2019, 36(24): 3061-3063.

[52] 劉睿, 陳盛君, 段金廒. 一種鱉甲特征肽段及其檢測(cè)方法: 中國(guó), CN113896770A [P]. 2022-01-07.

[53] Cheng X L, Wei F, Chen J,. Using the doubly charged selected ion coupled with MS/MS fragments monitoring (DCSI-MS/MS) mode for the identification of gelatin species [J]., 2014, 2014: 764397.

[54] 石峰, 鞏麗萍, 李雪, 等. 一種馬和騾共有特征性多肽及其應(yīng)用: 中國(guó), CN106198790A [P]. 2016-12-07.

[55] 陽洪波, 王韋達(dá), 李意, 等. 基于特征肽段的液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)鑒定膠原蛋白的物種來源 [J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2018, 37(11): 1279-1286.

[56] 杭寶建, 田晨穎, 陳曉, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定阿膠中馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮源成分 [J]. 色譜, 2018, 36(4): 408-412.

[57] 程顯隆, 李明華, 郭曉晗, 等. 膠類藥材質(zhì)量問題變化情況及標(biāo)準(zhǔn)研究對(duì)策 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2020, 22(7): 996-999.

[58] Ankney J A, Muneer A, Chen X. Relative and absolute quantitation in mass spectrometry-based proteomics [J]., 2018, 11(1): 49-77.

[59] 蔡朔, 蔣夢(mèng)彤, 趙珂璇, 等. 超聲輔助酶解與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)阿膠中馬皮成分 [J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 36(5): 623-628.

Research progress on quality control of gelatinous traditional Chinese medicine based on discovery and application of specific peptides

CAI Shuo1, 2, HAN Shu-ying2, XIA Hao-ran2, YAN Zhi-ye2, HUANG Xiao-zheng2, ZHAO Ming1, 2, DUAN Jin-ao1, 2, LIU Rui1, 2, 3

1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, and National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics, Nanjing 210023, China

Gelatinous traditional Chinese medicine (TCM), as a valuable characteristic TCM in China, is derived from the skin, horn, shell and other tissues of animals, and it forms solid blocks after extraction, concentration and drying. Recently, gelatinous TCMs have been increasingly favored by consumers because of its unique nourishing effect, and its market demand has been expanded continuously. However, the shortage of raw materials and the lack of effective quality control methods lead to the widespread use of fake and inferior gelatinous TCMs and their products, which seriously affect the reputation of the industry and endanger health and safety of people. Therefore, in order to ensure the quality of gelatinous TCMs and promote the healthy development of the industry, investigators have made continuous innovations and breakthroughs around the quality control research of gelatinous TCMs, and established a variety of efficient and sensitive quality detection methods. Research status of quality control of gelatinous TCMs was systematically reviewed from substance composition and quality control method based on discovery and application of characteristic peptide in this paper, in order to provide reference for further constructing and perfecting scientific and reasonable quality control system, and to promote the healthy development of gelatinous TCMs and industry.

gelatinoustraditional Chinese medicine; specific peptide; discovery; application; quality control; biomarkers

R284.191

A

0253 - 2670(2022)21 - 6888 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.028

2022-08-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973450）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2018YFC1706100）；江蘇省高校“青藍(lán)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人；江蘇省第六期“333高層次人才培養(yǎng)工程”第三層次培養(yǎng)對(duì)象

蔡 朔，男，在讀本科，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與開發(fā)。E-mail: Caisure1999@163.com

段金廒，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源化學(xué)與資源循環(huán)利用。E-mail: dja@njucm.edu.cn

劉 睿，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴巹?dòng)物藥資源化學(xué)。E-mail: liurui@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 崔艷麗]