姜 武，李亞萍，陳家棟，陶正明, *

基于ISSR和SRAP分子標(biāo)記的黃精種質(zhì)遺傳多樣性研究

姜 武1，李亞萍2，陳家棟1，陶正明1, 2*

1. 浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005 2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 臨安 311300

研究黃精居群遺傳多樣性，為黃精藥材資源保護(hù)和新品種培育提供依據(jù)。以4個(gè)居群22個(gè)種源47份黃精種質(zhì)資源為材料，選用14條ISSR和11對(duì)SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)、遺傳多樣性比較和聚類分析，揭示黃精種質(zhì)的遺傳多樣性及地理分布特征。ISSR引物和SRAP引物分別擴(kuò)增出186和142條清晰帶數(shù)，其中多態(tài)性條帶數(shù)分別為185和140，多態(tài)性比率（percentage of polymorphic bands，PPB）分別為99.46%和98.59%；遺傳多樣性分析顯示，ISSR和SRAP標(biāo)記下基因分化系數(shù)（st）分別為0.279 9和0.231 6，即黃精遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，居群間基因流（m）分別為1.286 4和1.659 3，遺傳相似系數(shù)在0.053 3～0.948 1和0.032 8～0.967 7。聚類結(jié)果顯示，相同黃精藥材基原種質(zhì)聚在一起，ISSR和SRAP標(biāo)記分別將黃精居群分為5和3大類群，且以ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果更符合實(shí)際地域分布。黃精種質(zhì)遺傳多樣性豐富，ISSR和SRAP標(biāo)記可適用于黃精親緣性鑒定，研究結(jié)果可為黃精資源的保護(hù)和育種提供一定參考。

黃精；分子標(biāo)記；遺傳多樣性；種質(zhì)資源；ISSR；SRAP

黃精為百合科黃精屬多年生草本植物，我國(guó)對(duì)黃精的食用和藥用歷史已逾2000年[1]。黃精歷來被視為益壽延年的珍品，又名“仙人余糧”[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃精具有補(bǔ)中益氣、潤(rùn)心肺、強(qiáng)筋骨等功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃精具有增強(qiáng)免疫功能、調(diào)血脂、降血糖、延緩衰老等多種藥理作用[3]。據(jù)《中國(guó)藥典》年2020版收載，藥材黃精為黃精Delar. ex Redoute、滇黃精Coll. et Hemsl或多花黃精Hua的干燥根狀莖[4]。黃精主產(chǎn)于河北、內(nèi)蒙古、陜西等省；滇黃精主產(chǎn)于貴州、廣西、云南等??；多花黃精主產(chǎn)于貴州、湖南、云南、安徽、江西、福建、浙江等省[5-6]。黃精藥材的需求量及栽培規(guī)模逐年遞增，已是林藥種植產(chǎn)業(yè)重要發(fā)展品種。因此，黃精不僅具有極高的保健價(jià)值，而且經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益顯著[7]。

當(dāng)前，研究人員對(duì)不同基原黃精藥材的種子休眠機(jī)制、有效成分合成途徑、藥理功效等方面已有較多研究[8-13]，而對(duì)黃精藥材品種選育研究相對(duì)缺乏。優(yōu)良品種選育研究的滯后，不僅易導(dǎo)致黃精栽培種質(zhì)混亂，部分基地存在使用非藥典規(guī)定物種混雜栽培，且以消耗大量的藥材資源為代價(jià)存在種性退化問題，不利于黃精產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。黃精種質(zhì)資源是其優(yōu)良品種選育的基礎(chǔ)材料，育種成效不僅取決于種質(zhì)資源圃的數(shù)量，還取決于對(duì)各種質(zhì)資源多樣性的遺傳規(guī)律掌握。分子標(biāo)記能夠直接在DNA水平檢測(cè)個(gè)體間差異，具特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高及微量、快速等優(yōu)點(diǎn)[14]，已廣泛應(yīng)用于中藥材相關(guān)育種工作中，是資源遺傳多樣性研究的重要手段[15-16]。本研究基于分子標(biāo)記技術(shù)闡明黃精藥材遺傳多樣性和地理分布特征，有助于深入開展黃精藥材的新品種選育研究。

近年來，已有較多科研人員將各種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在黃精屬植物親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究領(lǐng)域，吳世安等[17]運(yùn)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（restriction fragment length polymorphism，RFLP）對(duì)黃精屬13個(gè)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析；王世強(qiáng)等[18]采用簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR）對(duì)鑒定32個(gè)野生黃精種質(zhì)親緣關(guān)系；陳友吾等[19]基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)鑒定多花黃精優(yōu)良品種SSR標(biāo)記；劉躍均等[20]利用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性分子標(biāo)記（start codon targeted polymorphism，SCoT）對(duì)19份不同種源黃精材料進(jìn)行遺傳多樣性分析；劉新等[21]采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（inter simple sequence repeat，ISSR）對(duì)20個(gè)種源多花黃精進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳變異規(guī)律研究。然而，尚未見相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）在黃精屬資源分析中的應(yīng)用，對(duì)同時(shí)使用多個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行黃精種質(zhì)遺傳多樣性分析比較也未見報(bào)道。本研究基于ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)采自10省22個(gè)種源47份黃精種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行比較和綜合分析，后續(xù)可有針對(duì)性選擇具有優(yōu)良性狀親本并進(jìn)行基因型鑒別，對(duì)進(jìn)一步利用分子標(biāo)記縮短育種年限有現(xiàn)實(shí)意義。研究結(jié)果將為黃精藥材的植物資源鑒定、科學(xué)保護(hù)和新品種開發(fā)選育提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

2016年4月至2019年10月，收集浙江、福建、江西、安徽、云南、貴州、湖南、四川、陜西、河北省的3種黃精藥材基原植物帶芽根莖，浙江省亞熱帶作物研究所經(jīng)陶正明研究員鑒定為黃精為黃精Delar. ex Redoute、滇黃精Coll. et Hemsl或多花黃精Hua，具體信息見表1。樣品根據(jù)采集地來源分4個(gè)居群：華東（HD）29個(gè)；華中（HZ）4個(gè)；西南（XN）11個(gè)；北方（BF）3個(gè)。

1.2 儀器

ETC821型東勝龍PCR儀（蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司）；Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）；NanoDrop One型微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；JY300型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；JY-SPCT型水平電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Milli-Q Academic A10型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；H3-18KR型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試劑

PlantDNAzol植物基因組DNA提取試劑（杭州萊楓生物科技有限公司）；引物由有康生物科技有限公司合成；DL2000 DNA marker（Takara Bio公司）；2×PCR Solution Premix PrimerSTAR HS高保真聚合酶（R010A，Takara Bio公司）；瓊脂糖（111806，西班牙Biowest Agrose）；Gelred核酸染料（41003，美國(guó)Biotium）；乙醇（AR）、異丙醇（AR）、三氯甲烷（AR）等購(gòu)自上海賢鼎生物科技有限公司。

表1 黃精種質(zhì)采集信息

Table 1 Collected informations of Polygonati Rhizoma germplasm

編號(hào)采樣點(diǎn)樣品數(shù)基原經(jīng)度（E）緯度（N）海拔/m居群 ZJTS1浙江泰順1多花黃精119.79°27.70° 229華東 ZJCA2～3浙江淳安2多花黃精118.95°29.50° 169華東 ZJYJ4浙江永嘉1多花黃精120.79°28.44° 919華東 ZJJD5浙江建德1多花黃精119.15°29.43° 300華東 ZJOH6浙江甌海1多花黃精120.64°28.00° 10華東 ZJYQ7浙江樂清1多花黃精121.06°28.39° 123華東 ZJQY8～14浙江慶元7多花黃精119.24°27.59° 943華東 ZJSY15浙江松陽1黃精119.15°28.23° 606華東 ZJSY16～17浙江松陽2多花黃精119.15°28.24° 145華東 ZJLQ18～20浙江龍泉3多花黃精119.08°28.30° 671華東 ZJJN21～22浙江景寧2多花黃精119.69°27.89°1190華東 HBBD23～24河北保定2黃精115.36°39.16° 103北方 FJZH25～26福建政和2多花黃精118.53°27.21° 519華東 FJFZ27福建福州1多花黃精119.40°26.06° 789華東 SXLT28陜西臨潼1多花黃精109.19°34.36° 454北方 HNAH29～32湖南安化4多花黃精111.43°28.35° 149華中 SCBZ33～34四川巴中2多花黃精106.45°31.25° 441西南 GZTR35～36貴州同仁2多花黃精108.49°27.74°1394西南 YNDG37～40云南大關(guān)4多花黃精103.53°27.64°2611西南 AHQM41～42安徽祁門2多花黃精117.57°29.68° 487華東 JXWY43～44江西婺源2多花黃精117.51°29.19° 183華東 YNPE45～47云南普洱3滇黃精101.30°24.00°1280西南

2 方法

2.1 樣品的處理

每個(gè)種質(zhì)10份單株以上，采挖間隔5 m以上，帶采集地土移栽統(tǒng)一種于泰順縣司前鎮(zhèn)溪口村浙江省亞熱帶作物研究所黃精種質(zhì)資源圃。結(jié)合花型、根莖、葉片等形態(tài)學(xué)指標(biāo)，采集生長(zhǎng)良好的黃精幼嫩葉片于變色硅膠密封袋中干燥保存，用于后續(xù)DNA提取，一個(gè)樣品為同一采樣地的5叢不同植株葉片共同研磨提取所得。

2.2 基因組DNA提取

黃精藥材基因組DNA采用plant DNAzol試劑進(jìn)行提取。取100～500 mg葉片加液氮破碎后進(jìn)行DNA沉淀、DNA清洗、DNA溶解去雜，每份黃精樣品逐一提取DNA，稀釋至20 ng/μL后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量后置于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物篩選及PCR擴(kuò)增

在加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布100條ISSR隨機(jī)引物中的50條引物中和近年來已發(fā)表論文中較常用的88對(duì)SRAP引物中，分別篩選得到擴(kuò)增條帶多、背景清晰、多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的14條ISSR引物和11對(duì)SRAP引物，引物序列見表2。

ISSR和SRAP-PCR反應(yīng)體系設(shè)定：12.5 μL的takara公司2×預(yù)混型Taq酶，1 μL濃度為10 mmol/L的引物，模板DNA含量40～60 ng，補(bǔ)水至25 μL。引物最佳退火溫度設(shè)52 ℃。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、2 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳，5×TBE緩沖液，150 V跑膠40 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)、保存。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

選取清晰可辨的電泳條帶，在相同遷移位點(diǎn)有條帶的記“1”，缺失記“0”，分別統(tǒng)計(jì)ISSR、SRAP和二者混合數(shù)據(jù)（ISSR＋SRAP）的0/1矩陣。采用PopGen 32.0軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、等位基因數(shù)（number of alleles，a）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，e）、Nei′s基因多樣性指數(shù)（gene diversity，）、Shannon′s多態(tài)性信息指數(shù)（Shannon′s information index，）、Nei′s基因分化系數(shù)（coefficient of gene differentiation，st）、居群總基因多樣性（total gene diversity，t）、居群內(nèi)基因多樣性（gene diversity with provenances，s）、基因流（estimate of gene flow fromst，m）和Mantel檢驗(yàn)地理距離和遺傳距離相關(guān)性，采用Ntsys 2.1軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 ISSR、SRAP多態(tài)性分析

ISSR多態(tài)性研究結(jié)果如表2所示，共擴(kuò)增出186條條帶，其中多態(tài)性條帶185條，14條引物擴(kuò)增出9～20條數(shù)目不等的條帶，平均每條引物擴(kuò)增13.29條，各引物檢測(cè)到的PPB為92.86%～100%，平均為99.46%。13條引物多態(tài)性比例達(dá)100%，中UBC835擴(kuò)增多態(tài)性比例最低，為92.86%。在SRAP多態(tài)性研究中（表2），11對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，各引物檢測(cè)到的PPB為87.50%～100%，共檢測(cè)得到142條特異性條帶，其中多態(tài)性條帶140個(gè)，平均PPB為98.59%，且以ME6＋EM9組合的多態(tài)性位點(diǎn)最少，僅6個(gè)。

基于14條ISSR引物和11對(duì)SRAP引物建立了相應(yīng)的黃精藥材DNA指紋圖譜，以ISSR中的引物UBC840和SRAP中引物ME2＋EM3為例，擴(kuò)增條帶清晰，DNA片段相對(duì)分子質(zhì)量大多為100～2000 bp，多態(tài)性信息豐富（圖1）。

表2 ISSR引物和SRAP引物組合的擴(kuò)增結(jié)果

Table 2 Amplification results of ISSR primers and combinated SRAP primers

ISSR引物序列（5′-3′）擴(kuò)增條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)PPB/% UBC807(AG)8T1919100.00 UBC808(AG)8C1515100.00 UBC812(GA)8A2020100.00 UBC815(CT)8G1111100.00 UBC817(CA)8A1010100.00 UBC818(CA)8G1414100.00 UBC822(TC)8A1313100.00 UBC830(TG)8G1111100.00 UBC835(AG)8YC1413 92.86 UBC840(GA)8YT1212100.00 UBC844(CT)8RC1313100.00 UBC856(AC)8YA1111100.00 UBC868(GAA)6 9 9100.00 UBC873(GACA)41414100.00 平均值 13.29 13.21 總計(jì) 186185 99.46 SRAP引物序列（5′-3′）擴(kuò)增條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)PPB/% ME2+EM3BAGCAGCD1616100.00 ME2+EM6BAGCDGCA1313100.00 ME2+EM8BAGCDAGC1010100.00 ME2+EM9BAGCDACG1313100.00 ME4+EM3BACCDGAC1616100.00 ME4+EM11BACCDTCG1010100.00 ME5+EM9BAAGDACG1614 87.50 ME6+EM4BTAGDTGA1212100.00 ME6+EM9BTGTDACG 6 6100.00 ME8+EM4BTGCDTGA1414100.00 ME8+EM9BTDCDACG1616100.00 平均值 12.91 12.73 總計(jì) 142140 98.59

R＝(A, G); Y＝(C, T); B＝TGAGTCCAAACCGG; D＝GACTGCGTACGAATT

3.2 ISSR、SRAP遺傳多樣性分析

基于分子標(biāo)記的“0/1”賦值矩陣統(tǒng)計(jì)黃精居群遺傳多樣性，結(jié)果如表3、4所示。在ISSR研究中，總體物種水平的a為1.994 6，e為1.343 1，為0.224 2，為0.363 4。4個(gè)居群的a變化幅度1.397 8～1.908 6，平均1.592 7；e變化幅度1.246 6～1.310 1，平均1.280 8；變化幅度0.145 5～0.200 2，平均0.172 7；變化幅度0.217 9～0.326 6，平均0.267 4；PPB變化幅度39.78%～90.86%，以華東居群多態(tài)位點(diǎn)比率最高，22個(gè)種源平均PPB為59.27%，小于物種多態(tài)性比率99.46%。4個(gè)居群之間的t為0.239 8，s為0.172 7，st為0.279 9，即居群間遺傳變異占居群遺傳變異的27.99%，72.01%的遺傳變異在種內(nèi)進(jìn)行；種群間的m為1.286 4，表明黃精居群間存在一定的基因流動(dòng)。

圖1 ISSR引物UBC840 (A)和SRAP引物ME2＋EM3 (B) 對(duì)47份黃精DNA的擴(kuò)增結(jié)果

表3 黃精居群遺傳多樣性

Table 3 Genetic diversity of Polygonati Rhizoma

居群NaNeHIPPB/% ISSR 華東（HD）1.908 6±0.289 01.302 9±0.282 40.200 2±0.152 00.326 6±0.208 390.86 北方（BF）1.397 8±0.490 81.263 4±0.364 50.152 6±0.197 40.225 9±0.286 039.78 華中（HZ）1.403 2±0.491 91.246 6±0.348 20.145 5±0.190 80.217 9±0.277 340.32 西南（XN）1.661 3±0.474 51.310 1±0.329 20.192 4±0.179 80.299 0±0.257 666.13 居群水平1.592 71.280 80.172 70.267 459.27 物種水平1.994 6±0.073 31.343 1±0.287 40.224 2±0.148 90.363 4±0.195 099.46 SRAP 華東（HD）1.887 3±0.317 31.266 2±0.287 30.176 4±0.152 80.292 4±0.209 888.73 北方（BF）1.408 5±0.493 31.289 5±0.387 90.163 5±0.206 50.239 3±0.296 440.85 華中（HZ）1.507 0±0.501 71.286 8±0.348 30.172 9±0.189 20.262 5±0.275 350.70 西南（XN）1.676 1±0.469 61.316 9±0.332 20.196 1±0.180 30.304 7±0.257 367.61 居群水平1.619 71.289 90.177 20.274 761.97 物種水平1.985 9±0.118 31.311 0±0.287 40.205 4±0.148 50.337 5±0.196 798.59 ISSR+SRAP 華東（HD）1.899 4±0.301 31.287 0±0.284 70.189 9±0.152 60.311 8±0.209 3 89.94 北方（BF）1.402 4±0.491 11.274 7±0.374 50.157 4±0.201 10.231 7±0.290 240.24 華中（HZ）1.448 2±0.498 11.264 0±0.348 30.157 4±0.190 30.237 2±0.276 944.82 西南（XN）1.667 7±0.471 81.313 0±0.330 00.194 0±0.179 80.301 5±0.257 166.77 居群水平1.604 41.284 70.174 70.270 6 物種水平1.990 9±0.095 31.329 2±0.287 40.216 1±0.148 80.352 2±0.195 899.09

表4 黃精居群基因多樣性

Table 4 Gene diversity of Polygonati Rhizoma

分子標(biāo)記HtHsGstNm ISSR0.239 80.172 70.279 91.286 4 SRAP0.230 60.177 20.231 61.659 3 ISSR＋SRAP0.235 80.174 60.259 41.427 3

在SRAP研究中，4個(gè)居群多態(tài)位點(diǎn)比率PPB變化幅度40.85%～88.73%，平均61.97%，小于物種多態(tài)性位點(diǎn)比率98.59%。與ISSR結(jié)果一致，PPB由高到低順序?yàn)槿A東＞西南＞華中＞北方；總的基因多樣度t為0.230 6，種源內(nèi)基因多樣度s為0.177 2，基因分化系數(shù)st為0.231 6，即76.84%的遺傳變異發(fā)生在種內(nèi)。

為揭示更精細(xì)的黃精種質(zhì)基因遺傳多樣性，本研究繼續(xù)采用ISSR＋SRAP的“0/1”矩陣數(shù)據(jù)相結(jié)合分析基因變異。結(jié)果顯示，物種水平的a為1.990 9，e為1.329 2，為0.216 1，為0.352 2，PPB為99.09%；各居群的a變化幅度1.402 4～1.899 4，平均1.604 4；e變化幅度1.264 0～1.313 0，平均1.284 7；變化幅度0.157 4～0.194 0，平均0.174 7；變化幅度0.231 7～0.311 8，平均0.270 6；居群之間的t為0.235 8，高于種間遺傳多樣性s為0.174 6，st為0.259 4，即居群間遺傳變異占居群遺傳變異的25.94%，74.08%的遺傳變異在種內(nèi)進(jìn)行，居群間的m為1.427 3（m＞1）。

3.3 遺傳距離及聚類分析

Nei′s遺傳相似系數(shù)及遺傳距離和UPGMA聚類圖結(jié)果分別如圖2和表5所示。ISSR數(shù)據(jù)中居群之間的遺傳距離變化范圍為0.053 3～0.194 5，遺傳相似系數(shù)0.823 3～0.948 1，華東居群和西南居群相似系數(shù)最大，表明這2個(gè)居群的親緣關(guān)系較近，遺傳相似程度最高，而北方居群和華中居群相似系數(shù)最小。利用ISSR矩陣數(shù)據(jù)得到的UPGMA聚類圖（圖2-A）顯示，47份種質(zhì)被分成5類。分類結(jié)果有較顯著的地域特征，來自浙江、福建、安徽和江西的華東居群緊緊聚成一類，來自云南、貴州、四川的西南居群聚成一類，來自河北的北方居群?jiǎn)为?dú)成一類，而來自浙江松陽居群ZJSY15單獨(dú)為一類。

圖2 42份梔子種質(zhì)居群的UPGMA分析（ISSR，A；SRAP，B；ISSR＋SRAP，C）

表5 基于ISSR和SRAP分子標(biāo)記黃精4個(gè)居群的Nei′s遺傳相似系數(shù)（右上角）和遺傳距離（左下角）

Table 5 Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of four Polygonati Rhizoma populations based on ISSR and SRAP molecular markers

居群華東（HD）北方（BF）華中（HZ）西南（XN） ISSR 華東（HD）****0.870 80.948 10.946 4 北方（BF）0.138 3****0.823 30.855 8 華中（HZ）0.053 30.194 5****0.911 5 西南（XN）0.055 10.155 70.092 7**** SRAP 華東（HD）****0.894 10.945 60.967 7 北方（BF）0.111 9****0.847 70.910 0 華中（HZ）0.055 90.165 2****0.917 5 西南（XN）0.032 80.094 40.086 1**** ISSR+SRAP 華東（HD）****0.880 90.946 90.955 7 北方（BF）0.126 8****0.833 70.879 1 華中（HZ）0.054 60.181 9****0.914 0 西南（XN）0.045 30.128 80.089 9****

基于SRAP數(shù)據(jù)的遺傳距離結(jié)果與ISSR數(shù)據(jù)類似，遺傳距離變化范圍為0.032 8～0.165 2，遺傳相似系數(shù)0.847 7～0.967 7，相似系數(shù)以華東居群和西南居群最高，北方居群和華中居群遺傳距離最大。UPGMA聚類圖（圖2-B）顯示，47份種質(zhì)被分成3類，分類結(jié)果基本按黃精藥材基原植物聚類。來自華東、華中、西南居群的多花黃精聚在一起，且四川巴中（SCBZ33～34）和云南大關(guān)（YNDG39）的親緣性更緊密，北方居群河北保定（HBBD23～24）的黃精聚在一起。

基于ISSR＋SRAP數(shù)據(jù)，居群間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離結(jié)果與ISSR和SRAP的結(jié)果一致，但UPGMA聚類圖則有更精細(xì)科學(xué)的分類（圖2-C）。47份種質(zhì)被分成3大類，第I大類是以華東、華中居群的多花黃精種質(zhì)為主，云南普洱（YNPE45～47）的滇黃精種質(zhì)則緊密聚合在一起，嵌在第I大類中；第II類為西南居群（SCBZ33～34、GZTR36、YNDG37～40）多花黃精種質(zhì)，第III大類是北方居群河北保定（HBBD23～24）。遺傳相似系數(shù)值為0.696時(shí)，第I大類的種質(zhì)有較明顯的地域特征，可分為4小類。以皖、贛、浙的黃精種質(zhì)為分析對(duì)象，浙北地區(qū)淳安（ZJCA2～3）和建德（ZJJD5）聚在一起，屬于千里崗山脈種質(zhì)；分別來自皖南和贛北的安徽祁門（AHQM41～42）和江西婺源（JXWY43～44）居群聚在一起，屬于皖贛交界處的五龍山脈種質(zhì)；來自浙江松陽（ZJSY17）和景寧（ZJJN22）居群聚在一起，屬于洞宮山脈種質(zhì)；雁蕩山脈的浙南（溫州樂清、永嘉、泰順、甌海，麗水慶元、景寧、龍泉）和武夷山脈種質(zhì)的閩北（福建政和）多花黃精聚成一小類，種質(zhì)親緣性近。

4 討論

本研究對(duì)來自華東、華中、西南和北方4個(gè)居群22個(gè)種源47份黃精種質(zhì)進(jìn)行分子標(biāo)記分析，選用14條ISSR和11對(duì)SRAP分別擴(kuò)增出185和140條多態(tài)性性條帶，PPB分別達(dá)到99.46%和98.59%，表明黃精種群間有豐富的遺傳多樣性。從擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)上看，ISSR標(biāo)記更優(yōu)于SRAP標(biāo)記。華東居群的黃精種質(zhì)遺傳多樣性變異水平最高，北方居群變異性最低。一方面這可能與采樣數(shù)量有關(guān)，另一方面是北方居群的黃精藥材基原植物主要是黃精，而華東居群的黃精居群，以浙江為例，基原植物以多花黃精為主外，還有引種的滇黃精和未入藥典黃精藥材目錄的長(zhǎng)梗黃精，且浙西南和皖、贛交界處山脈眾多，豐富的氣候、土壤和環(huán)境形成了華東居群豐富的遺傳多樣性，也預(yù)示這該產(chǎn)區(qū)的黃精種質(zhì)抗逆性和抗風(fēng)險(xiǎn)能力強(qiáng)。

遺傳分化系數(shù)st可用于判斷種群間的遺傳分化程度，且在st＞0.25時(shí)，居群間分化程度則較高?；贗SSR＋SRAP數(shù)據(jù)，4個(gè)居群st＝0.259 4，說明25.94%的遺傳分化存在于居群內(nèi)，各居群之間有較高程度的分化。基因流m＝1.427 3，表明基因流防止了遺傳漂流引起的種群之間的遺傳分化。一方面地理隔離，另一方面可能和黃精的授粉方式相關(guān)，黃精藥材尤其是多花黃精，屬于自花授粉，花絲比花柱稍長(zhǎng)，花冠較長(zhǎng)使得花柱不伸出[22]。因此，自然遷移和自然雜交率程度都較低。

從聚類結(jié)果看，ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果更符合實(shí)際地域分布，SRAR標(biāo)記的聚類結(jié)果則將北方居群黃精與其他黃精藥材區(qū)分開?；趦蓸?biāo)記混合數(shù)據(jù)（ISSR＋SRAP）的聚類結(jié)果不僅能較好的區(qū)分不同基原植物，而且呈現(xiàn)一定地域性分布規(guī)律：華東多花黃精居群和華中多花黃精居群聚成一類，西南居群和北方黃精居群則分別聚成一類。聚類結(jié)果顯示華東居群和華中居群親緣性近，這一研究結(jié)果和近年來2個(gè)產(chǎn)區(qū)大力發(fā)展林藥種植有關(guān)。黃精產(chǎn)業(yè)是踐行“兩山”理念，助力鄉(xiāng)村振興的重要載體，華東產(chǎn)區(qū)和華中產(chǎn)區(qū)交流較為密切，可能存在較多的種源引種交流。另一方面，華東產(chǎn)區(qū)的黃精種質(zhì)聚類結(jié)果顯示存在較明顯的地域分布特征，主要被分成千里崗山脈系（浙西北）、五龍山脈系（皖南贛北）、洞宮山脈系（浙西南）、雁蕩山脈系（浙東南）、武夷山脈系（浙西南＋閩北）。其中浙西南的黃精種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性，松陽、龍泉、慶元、景寧雖同屬麗水產(chǎn)區(qū)，但由于山脈眾多可能產(chǎn)生一定地理隔離，導(dǎo)致一定程度遺傳分化。

黃精為我國(guó)藥食兩用藥材，來源3種基原植物，產(chǎn)區(qū)分布廣泛，近年來全國(guó)范圍內(nèi)大力發(fā)展林下經(jīng)濟(jì)，林下黃精的栽培面積逐漸擴(kuò)大，相互引種也逐漸頻繁，因此黃精的種質(zhì)資源遺傳多樣性高。本研究首次基于2種分子標(biāo)記方法研究主要黃精產(chǎn)區(qū)各居群的遺傳多樣性，揭示了黃精重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)華東居群的種質(zhì)地域分布特征，明確了浙西南地區(qū)黃精種質(zhì)和武夷山脈系的閩北居群親緣關(guān)系近，且遺傳多樣性豐富，本研究結(jié)果可為浙產(chǎn)黃精資源保護(hù)和選育開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 姜程曦, 洪濤, 熊偉. 黃精產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題及對(duì)策研究 [J]. 中草藥, 2015, 46(8): 1247-1250.

[2] 蘇文田, 劉躍鈞, 蔣燕鋒, 等. 黃精產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與可持續(xù)發(fā)展的建議 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2018, 43(13): 2831-2835.

[3] 姜程曦, 張鐵軍, 陳常青, 等. 黃精的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2017, 48(1): 1-16.

[4] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 23.

[5] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志 [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006: 126.

[6] 姜武, 葉傳盛, 吳志剛, 等. 黃精的本草考證 [J]. 中藥材, 2017, 40(11): 2713-2716.

[7] Chen D H, Han Z G, Si J P. Huangjing () is an emerging crop with great potential to fight chronic and hidden hunger [J]., 2021, 64(9): 1564-1566.

[8] 陳怡, 楊賦祺, 陳松樹, 等. 多花黃精種子萌發(fā)過程的內(nèi)源激素含量變化研究 [J]. 中藥材, 2020, 43(3): 523-527.

[9] 姜武, 翁國(guó)杭, 陳家棟, 等. 基于LC-MS代謝組學(xué)的紅桿與綠桿型多花黃精化學(xué)成分比較研究 [J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2021, 37(17): 32-38.

[10] Li L, Thakur K, Liao B Y,. Antioxidant and antimicrobial potential of polysaccharides sequentially extracted from[J]., 2018, 114: 317-323.

[11] Wang S, Wang B, Hua W,. De novo assembly and analysis oftranscriptome and identification of genes involved in polysaccharide biosynthesis [J]., 2017, 18(9): E1950.

[12] Shen W D, Li X Y, Deng Y Y,.Hua polysaccharide exhibits anti-fatigue activity via regulating osteocalcin signaling [J]., 2021, 175: 235-241.

[13] Wang C K, Peng D Y, Zhu J H,. Transcriptome analysis ofHua: Identification of genes involved in polysaccharide biosynthesis [J]., 2019, 15: 65.

[14] 王剛, 曹佩, 韋學(xué)敏, 等. 分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2019, 21(11): 1435-1444.

[15] 姜武, 吳志剛, 陶正明, 等. 基于ISSR和SRAP標(biāo)記的梔子種質(zhì)遺傳多樣性研究[J]. 中草藥, 2019, 50(2): 510-516.

[16] 岑曉霞, 孫健, 沈曉霞, 等. 基于SRAP和ISSR標(biāo)記的栽培麥冬起源和遺傳多樣性研究 [J]. 中藥材, 2021, 44(3): 555-561.

[17] 吳世安, 呂海亮, 楊繼, 等. 葉綠體DNA片段的RFLP分析在黃精族系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用 [J]. 植物分類學(xué)報(bào), 2000, 38(2): 97-110.

[18] 王世強(qiáng), 王立儒, 劉帥, 等. 基于SSR標(biāo)記的黃精品種(系) DNA指紋圖譜庫(kù)構(gòu)建 [J]. 分子植物育種, 2018, 16(6): 1878-1887.

[19] 陳友吾, 廖榮俊, 葉碧歡, 等. 多花黃精轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分析及分子標(biāo)記開發(fā) [J]. 中草藥, 2020, 51(1): 182-189.

[20] 劉躍鈞, 張媛, 蔣燕鋒, 等. 黃精種質(zhì)資源遺傳多樣性研究 [J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 33(6): 1085-1091.

[21] 劉新, 斯金平, 段承俐, 等. 多花黃精遺傳多樣性和遺傳變異規(guī)律研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2835-2841.

[22] 劉佳, 王文祥, 朱翔, 等. 多花黃精開花動(dòng)態(tài)及傳粉方式研究 [J]. 種子, 2017, 36(4): 41-45.

Genetic diversity analysis ofbased on ISSR and SRAP molecular markers

JIANG Wu1, LI Ya-ping2, CHEN Jia-dong1, TAO Zheng-ming1, 2

1. Zhejiang Institute of the Subtropical Crops, Wenzhou 325005, China 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Resources Protection and Innovation of Traditional Chinese Medicine, Zhejiang A&F University, Lin′an 311300, China

To analysis the genetic diversity of Huangjing (), and to provide the evidences for resource protection and new variety breeding of.Taking 47 germplasm resources from 22 provenances of four community as materials, 14 ISSR and 11 SRAP markers were used for polymorphism detection, genetic diversity comparison and cluster analysis, to reveal the genetic diversity and geographical distribution characteristics of germplasm.A total of 186 and 142 clear bands were amplified by ISSR and SRAP primers, and the number of polymorphic bands was 185 and 140, respectively;The percentage of polymorphic bands (PPB) was 99.46% and 98.59%, respectively. The genetic diversity analysis showed that the coefficient of gene differentiation (st) of ISSR and SRAP markers were 0.279 9 and 0.231 6, respectively, indicating that the genetic variation was mainly within the population, and the interpopulation gene flow (m) value was 1.286 4 and 1.659 3, respectively. The genetic similarity coefficients ranged from 0.053 3 to 0.948 1 and 0.032 8 to 0.967 7. The clustering results showed that the populations were divided into five and three groups by ISSR and SRAP markers, respectively, and the clustering results of ISSR markers were more consistent with the actual regional distribution.The germplasm ofis rich in genetic diversity, ISSR and SRAP markers can be used to identify the phylogeny of. The results can provide some reference for the conservation and breeding of.

; molecular labeling; genetic diversity; gemplasm resources; ISSR; SRAP

R286.12

A

0253 - 2670(2022)21 - 6865 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.025

2022-03-06

浙江省中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2021E10013）；溫州市農(nóng)業(yè)新品種選育協(xié)作組項(xiàng)目（2019ZX003-1）

姜 武（1987—），男，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幉男缕贩N選育及開發(fā)。E-mail: jiangwu8888@163.com

陶正明（1970—），男，研究員，研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源評(píng)價(jià)利用。Tel: (0577)88526876 E-mail: zmtao2002@aliyun.com.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]