王 蕓，吳 宇，蔣慶鋒，何 焱，蘭小中，張 磊, 2*

? 藥材與資源 ?

翼首草鯊烯合酶（PhSQS2）全長克隆、表達(dá)特性分析及蛋白功能驗(yàn)證

王 蕓1，吳 宇2#，蔣慶鋒3，何 焱2, 4，蘭小中4*，張 磊1, 2*

1. 上海大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)藥創(chuàng)新研發(fā)中心，上海 200444 2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院 藥用植物學(xué)教研室，上海 200433 3. 西藏軍區(qū)總醫(yī)院 醫(yī)療保障中心藥劑科，西藏 拉薩 850000 4. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 西南大學(xué)藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心，西藏 林芝 860000

從匙葉翼首草轉(zhuǎn)錄組中挖掘參與三萜合成的鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）并研究其作用機(jī)制。以翼首草基原植物匙葉翼首草為研究對象，基于前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選克隆基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)觀察PhSQS2亞細(xì)胞定位情況，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析PhSQS2在不同器官中的表達(dá)特征；構(gòu)建原核表達(dá)載體經(jīng)體外酶促反應(yīng)鑒定PhSQS2功能?；蜷_放閱讀框（open reading frame，ORF）區(qū)域全長1242 bp編碼414個(gè)氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為47 400，理論等電點(diǎn)為6.57，總平均疏水性為?0.075，為不穩(wěn)定蛋白。PhSQS2主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；組織分布具有特異性，在根和葉中均有表達(dá)，葉中表達(dá)量顯著高于根中。體外酶促實(shí)驗(yàn)證明PhSQS2催化法尼基焦磷酸生成鯊烯。PhSQS2的功能鑒定為解析翼首草中萜類物質(zhì)生物合成途徑，提高三萜皂苷類成分含量及優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源篩選培育提供了前期理論基礎(chǔ)。

匙葉翼首草；翼首草；鯊烯合酶（PhSQS2）；生物信息學(xué)；表達(dá)特性；基因功能

中藥翼首草系藏族習(xí)用藥材，為川續(xù)斷科植物匙葉翼首草(C. B. Clarke) H?eck的干燥全草[1]，具有解毒除瘟、清熱止痢、祛風(fēng)通痹等功效。作為藏醫(yī)藥常用藥材之一，是二十五味余甘子丸、十二味翼首散等中藥的組方藥，多用于瘟病時(shí)疫、痢疾、熱病發(fā)燒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[2]。富含皂苷類成分是川續(xù)斷科植物的一大特點(diǎn)，化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)翼首草活性成分主要包括五環(huán)三萜類皂苷、環(huán)烯醚萜苷等萜類成分[3]，目前已分離出齊墩果酸、熊果苷酸、匙葉翼首草苷A～D等五環(huán)三萜類化合物[4-5]，馬錢苷等環(huán)烯醚萜苷類化合物[6-7]。其中三萜總皂苷具有抗腫瘤、護(hù)肝、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[8]，環(huán)烯醚萜苷化合物的藥理活性研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗病毒等作用[9]。

萜類化合物是植物體內(nèi)廣泛存在的重要次生代謝產(chǎn)物，由異戊二烯結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成基本骨架，主要通過異戊二烯首尾相接以及環(huán)化2種方式合成。植物胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）和質(zhì)體中的甲基赤蘚醇-4-磷酸（methylerythritol- 4-phosphate，DXP/MEP）2種生物合成途徑[10]催化生成萜類物質(zhì)的基本單元異戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其同分異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）。IPP和DMAPP在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶作用下合成萜類前體異戊二烯焦磷酸鏈，包括單萜前體香葉基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP）、倍半萜前體法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）和二萜前體香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）；其中2個(gè)FPP在鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）作用下縮合生成三萜前體鯊烯。單萜、二萜、三萜等前體在萜類合酶的作用下生成各種萜類骨架，進(jìn)一步經(jīng)氧化、?；疤腔然瘜W(xué)修飾最后形成一系列復(fù)雜萜類化合物[11]。目前已從黃花蒿[12]、刺五加[13]、三七[14]、丹參[15]、白花丹參[16]、雷公藤[17]、黃芪[18]等多種藥用植物中成功篩選克隆基因。三七中鯊烯合酶基因表達(dá)量同三萜總皂苷含量進(jìn)行共分析發(fā)現(xiàn)兩者存在正相關(guān)關(guān)系[14]，提高刺五加中鯊烯合酶基因表達(dá)量可以促進(jìn)總皂苷的積累[13]，而體外重組蛋白酶促反應(yīng)直接證明黃花蒿鯊烯合酶可以催化FPP轉(zhuǎn)化生成鯊烯[12]，由此看出鯊烯合酶是決定著法尼基焦磷酸流向的關(guān)鍵酶，是開啟植物三萜皂苷類生物合成途徑的重要開關(guān)。迄今，有關(guān)翼首草三萜皂苷類物質(zhì)生物合成途徑解析的研究尚未有所報(bào)道，因此發(fā)現(xiàn)并證明翼首草中鯊烯合酶功能對于解析五環(huán)三萜皂苷類物質(zhì)的生物合成途徑（圖1），提高三萜皂苷類等活性成分含量具有重要意義。

圖1 植物五環(huán)三萜生物合成途徑[19-20]

課題組前期從翼首草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到1條鯊烯合酶基因[21]，通過并對其進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及基因功能驗(yàn)證等研究，證明PhSQS2具有鯊烯合酶的功能，為翼首草三萜皂苷類活性成分生物合成途徑解析及提高三萜總皂苷類物質(zhì)的含量奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

匙葉翼首草完整植株采于西藏自治區(qū)林芝市巴宜區(qū)，經(jīng)西藏農(nóng)牧學(xué)院蘭小中教授鑒定為川續(xù)斷科植物匙葉翼首草(C. B. Clarke) H?eck。樣品洗凈后分別收集根和葉，于液氮速凍后保存至?80 ℃冰箱。

2 方法

2.1 翼首草總RNA提取及cDNA合成

采用TransZol Up（全式金公司，中國）法提取翼首草樣品RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)測定RNA純度和濃度。而后依次使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（全式金公司，中國）和Advantage 2 PCR Kit（Clonetech公司，美國）完成雙鏈cDNA擴(kuò)增，最終構(gòu)建翼首草cDNA文庫，于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PhSQS2基因序列數(shù)據(jù)挖掘及克隆

從翼首草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得基因序列全長[21]，通過Primer在線軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物序列見表1。翼首草RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA作為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增完成基因克隆。

表1 引物序列

Table 1 Primers sequences

引物名稱序列（5′→3′）用途 PhSQS2-FATGGGAGGTATGGGAGAAATTTTGA克隆 PhSQS2-RGAAAGCTAACCATGTGTTATGTGAT克隆 PhSQS2-Q-FTTGGCCTCGTGAAATTTGGGqRT-PCR PhSQS2-Q-RCCAATTGCCATGACCTGAGGqRT-PCR PhSQS2-sub-FGACGAGCTGTACAAGGGATCCATGGGAGGTATGGGAGAAATTTTGA亞細(xì)胞定位 PhSQS2-sub-RCTAGAGGATCAATTCGAGCTCGAAAGCTAACCATGTGTTATGTGAT亞細(xì)胞定位 PhSQS2-pET-FGGATCCGAATTCGAGCTCATGGGAGGTATGGGAGAAATTTTGA原核表達(dá) PhSQS2-pET-RGAGTGCGGCCGCAAGCTTGAAAGCTAACCATGTGTTATGTGAT原核表達(dá)

2.3 PhSQS2生物信息學(xué)分析

用ProtParam（http://web.expasy.org/compute）在線軟件分析PhSQS2蛋白基本理化性質(zhì)；通過ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）在線軟件對PhSQS2進(jìn)行親疏水性預(yù)測；利用Pfam32.0 （http://pfam.xfam.org/search）和NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST （CD-Search）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件對PhSQS2蛋白進(jìn)行功能域的預(yù)測；依賴Swiss-Model（http:// www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL. html）在線軟件進(jìn)行蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并用PyMOL實(shí)現(xiàn)PhSQS2三維結(jié)構(gòu)可視化。

2.4 PhSQS2實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

選取翼首草基因作為內(nèi)參基因[22]，使用NovoScript?SYBR One-Step qRT-PCR Kit（近岸公司，上海）試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，使用2?ΔΔCt法進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)使用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并且相對定量時(shí)將目的基因在根中的表達(dá)量設(shè)為“1”。

2.5 PhSQS2亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

選擇H I和I作為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物構(gòu)建- pCAMBIA1301-YFP亞細(xì)胞定位載體，測序正確后將重組定位載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌用作后續(xù)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。p-YFP載體經(jīng)相同處理轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌作為陰性對照。

2.6 PhSQS2亞細(xì)胞定位分析

取200 μL已轉(zhuǎn)入目的基因的農(nóng)桿菌加入5 mL YEB（50 mg/L Rif＋50 mg/L Kan）液體培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min，振蕩培養(yǎng)16 h；5000 r/min，離心10 min，去上清。MS溶液重懸菌體，待菌液值約為0.6時(shí)加入終濃度為10 mmol/L嗎啉乙磺酸和100 μmol/L乙酰丁香酮，室溫靜置3 h；緩慢勻速注射于本氏煙草葉片背面，暗培養(yǎng)植株2～3 d后通過激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

2.7 PhSQS2原核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

選擇I和d III作為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物構(gòu)建PhSQS2-pET-32a+原核表達(dá)載體，測序正確后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞用作后續(xù)蛋白表達(dá)。pET-32a+載體經(jīng)相同處理轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后作為陰性對照。

2.8 PhSQS2重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

取含有PhSQS2-pET-32a+和pET-32a+陽性克隆的菌液各10 μL加入1 mL含有LB（100 mg/L Amp）液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h。取500 μL活化后菌液加入1000 mL 乳酸桿菌（100 mg/L 磷酸腺苷）液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到600為0.6加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，80 r/min，16 ℃過夜培養(yǎng)；4 ℃離心收集菌體，5 mL 1×PBS緩沖液重懸菌體；冰上超聲（功率25%，超聲5 s，間隔5 s）破碎20 min；4 ℃離心收集上清液；使用SDS-PAGE電泳檢測上清液中是否存在目的蛋白表達(dá)。

2.9 PhSQS2體外酶促實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)物檢測

使用Bio-ScaleTM Mini ProfinityTM IMAC Cartridges純化柱進(jìn)行蛋白純化，根據(jù)重組蛋白內(nèi)含有His標(biāo)簽與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合的原理經(jīng)Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測是否表達(dá)最終目的蛋白，使用Bradford Protein Assay Kit（碧云天）測定蛋白濃度。

PhSQS2催化反應(yīng)體系（300 μL）：50 μmol/LFPP；20 mmol/LMgCl2；1 mmol/LDTT；2% Glycine；3 mmol/LNADPH；5 μg純化蛋白；50 mmol/LTris-HCl補(bǔ)齊。30 ℃，300 r/min反應(yīng)過夜；結(jié)束后加入400 μL正己烷淬滅反應(yīng)，400 μL正己烷萃取3次，合并上層有機(jī)相氮吹揮干濃縮，200 μL正己烷復(fù)溶，進(jìn)行GC-MS檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 PhSQS2克隆及序列分析

以翼首草cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在約1200 bp處出現(xiàn)一特異片段（圖2），與基因全長預(yù)期結(jié)果一致。

M-Marker 1-PhSQS2基因克隆條帶

克隆結(jié)果測序后證實(shí)與翼首草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中所獲序列全長完全相同。利用開放閱讀框（open reading frame，ORF）Finder（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder）在線軟件對序列進(jìn)行信息分析，發(fā)現(xiàn)基因ORF序列全長1242 bp，編碼414個(gè)氨基酸。利用DNAMAN軟件將其與其他相似度較高的植物氨基酸序列進(jìn)行多重比對（圖3），分析結(jié)果顯示PhSQS2氨基酸序列與丹參Bunge、黃花蒿L(fēng).相似度均達(dá)到80%以上。

圖3 不同物種SQS氨基酸序列多重比對

3.2 PhSQS2生物信息學(xué)分析

基因ORF區(qū)域編碼414個(gè)氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為47 400，理論等電點(diǎn)為6.57，蛋白總平均疏水性為?0.075，屬于不穩(wěn)定蛋白。采用ProtScale在線分析軟件對翼首草PhSQS2親水性/疏水性進(jìn)行預(yù)測與分析，其中PhSQS2多肽鏈第248位氨基酸分值最低，親水性最強(qiáng)；第398位氨基酸分值最高，疏水性最強(qiáng)，結(jié)果同時(shí)可以看出蛋白疏水區(qū)域大于親水區(qū)域，故PhSQS2屬于疏水蛋白（圖4-A）。

利用Pfam 32.0及BLAST（CD-Search）在線軟件預(yù)測分析翼首草PhSQS2蛋白構(gòu)域，結(jié)果顯示，PhSQS2含有關(guān)鍵的SQS_PSY功能域和PLN02632保守域（圖4-C），采用SWISS-MODEL在線軟件以TcSQS（PDB：3wca）作為模板經(jīng)同源建模預(yù)測PhSQS2蛋白三級結(jié)構(gòu)，經(jīng)PyMOL可視化后結(jié)果見圖4-B。

圖4 翼首草SQS2蛋白親水性/疏水性(A)、蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(B)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域(C)

3.3 PhSQS2組織表達(dá)特異性

使用qRT-PCR檢測在翼首草不同組織（根、莖）中的分布情況。結(jié)果（圖5）顯示在根、葉中的表達(dá)量具有顯著差異，葉中的表達(dá)量約為根中的12.5倍。

3.4 PhSQS2亞細(xì)胞定位特征

構(gòu)建PhSQS2-YFP融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染本氏煙草，通過激光共聚焦顯微鏡掃描YFP黃色熒光信號（514 nm）觀察PhSQS2在煙草中亞細(xì)胞定位結(jié)果。結(jié)果顯示YFP對照組信號（圖6-A～C）分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；PhSQS2-YFP融合蛋白熒光信號（圖6-D～F）在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有存在，據(jù)此判斷PhSQS2-YFP融合蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。

3.5 PhSQS2重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)BL21（DE3）菌株表達(dá)后由SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)情況。如圖7-A所示，含有重組質(zhì)粒PhSQS2-pET-32a+的菌株（PhSQS2目的蛋白相對分子質(zhì)量約為47 400）在65 000附近有蛋白條帶；而pET-32a+空載體對照組菌株在相同位置無蛋白表達(dá)，僅在18 000附近表達(dá)His-Tag標(biāo)簽蛋白，以上結(jié)果表明PhSQS2在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)。

**P＜0.01

圖6 PhSQS2在煙草表皮中的亞細(xì)胞定位

1-Marker 2、4-pET-32a+空載 3、5-PhSQS2重組蛋白

進(jìn)一步利用Western blotting檢測所得蛋白是否為目的蛋白。結(jié)果如圖7-B所示，與空載體對照組相比，檢測到PhSQS2-pET-32a+表達(dá)信號，且條帶單一、純度良好。采用Bradford準(zhǔn)曲線法對PhSQS2- pET-32a+融合蛋白進(jìn)行濃度測定，最后獲得質(zhì)量濃度為3.60 mg/mL的PhSQS2重組蛋白用作后續(xù)酶活實(shí)驗(yàn)。

3.6 PhSQS2體外酶促產(chǎn)物檢測

對純化后的PhSQS2酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS檢測，結(jié)果見圖8。以pET32a+空載表達(dá)的未純化蛋白作為陰性對照組，鯊烯對照品作為陽性對照，氣相色譜結(jié)果顯示PhSQS2酶促反應(yīng)產(chǎn)物和鯊烯對照品在保留時(shí)間9.87 min處出現(xiàn)相同的色譜峰，對該色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，特征離子一致，說明PhSQS2酶促反應(yīng)生成了鯊烯，PhSQS2具有鯊烯合酶的功能。

4 討論

翼首草作為常用傳統(tǒng)藏藥材，在西藏民間具有悠久的用藥史，其需求逐年增長，但因基原植物匙葉翼首草主要生長在西藏、云南、四川等海拔3000 m以上的草地、林間、林緣、高山草甸[23]，嚴(yán)苛的生長環(huán)境制約了其后續(xù)應(yīng)用，目前藥材來源主要以野生采挖為主，長期野生采挖使翼首草的野生資源瀕臨滅絕[24]。近些年對于翼首草的研究主要集中在基原植物匙葉翼首草的人工栽培[25]，翼首草中活性成分生物合成途徑解析、活性成分調(diào)控，以及優(yōu)良種質(zhì)資源的培育等方向。生物合成途徑中的關(guān)鍵酶活性影響活性成分的產(chǎn)量，因此調(diào)控植物中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)是提高活性成分產(chǎn)量、改善中藥材品質(zhì)的重要手段。對于翼首草萜類物質(zhì)途徑解析，本研究主要聚焦于SQS的克隆以及相關(guān)功能研究。體外蛋白功能驗(yàn)證PhSQS2具有鯊烯合酶的功能，可催化鯊烯生成。后續(xù)構(gòu)建PhSQS2過表達(dá)載體或通過激素誘導(dǎo)提高植物體內(nèi)基因表達(dá)量，使法尼基焦磷酸更多地流向三萜類物質(zhì)合成，將有利于三萜皂苷類成分的積累。組織特異性表達(dá)結(jié)果表明PhSQS2在根和葉中均有分布，葉中表達(dá)量顯著高于根中。但已有報(bào)道的翼首草三萜總皂苷代謝數(shù)據(jù)與上述轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)并不一致，比較翼首草不同部位的總皂苷含量，發(fā)現(xiàn)根和葉中均含有豐富的總皂苷類物質(zhì)，但根中含量要高于葉中[26-27]。類似的結(jié)果在三七中也被檢測到，SQS在根中的表達(dá)量要高于蘆頭和莖中，但蘆頭中總皂苷含量最高[14]。分析造成轉(zhuǎn)錄代謝分布不一致的原因，認(rèn)為可能是因?yàn)镾QS位于三萜合成途徑上游，下游其他關(guān)鍵酶如環(huán)氧酶、環(huán)化酶、單加氧酶等在翼首草葉中的表達(dá)影響了皂苷的合成；或是三萜合成途徑中存在著中間體的定向轉(zhuǎn)運(yùn)影響了終產(chǎn)物的分布。但可以明確的是提高鯊烯合酶的表達(dá)量可以提高植物中三萜皂苷的含量[13]，鯊烯合酶在三萜生物合成途徑中具有重要作用。挖掘到翼首草中的鯊烯合酶對于提高三萜皂苷類物質(zhì)含量以及篩選培育翼首草優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源具有重要意義。

A-鯊烯對照品 B-PhSQS2 C-pET-32a+ D-峰1質(zhì)譜圖 E-峰2質(zhì)譜圖

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 四部. 2020: 23.

[2] 中國科學(xué)院西北高原生物研究所. 藏藥志 [M]. 西寧: 青海人民出版社, 2019: 36.

[3] 郭晨旭, 朱國福. 藏藥翼首草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 世界中醫(yī)藥, 2015, 10(9): 1440-1443.

[4] 權(quán)紅, 甄梓娟, 李連強(qiáng), 等. 藏藥匙葉翼首草中齊墩果酸及熊果酸的含量測定 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2016, 18(6): 762-765.

[5] Zeng Y B, Mei W L, Zhao Y X,. Two new epimeric pairs of iridoid from mangrove plant[J]., 2007, 18(12): 1509-1511.

[6] 田軍, 吳鳳鍔, 丘明華, 聶瑞麟. 匙葉翼首花的化學(xué)成分 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2000, 12(1): 35-38.

[7] Graikou K, Aligiannis N, Chinou I B,. Cantleyoside-dimethyl-acetal and other iridoid glucosides from: Antimicrobial activities [J]., 2002, 57(1/2): 95-99.

[8] Zhang L, Hu J J, Lin J W,. Anti-inflammatory and analgesic effects of ethanol and aqueous extracts of(C. B. Clarke) H?eck [J]., 2009, 123(3): 510-514.

[9] 張雪梅, 楊豐慶, 夏之寧. 藏藥翼首草的藥理作用及其質(zhì)量評價(jià)研究進(jìn)展 [J]. 中國藥房, 2012, 23(35): 3356-3358.

[10] Pu X J, Dong X M, Li Q,. An update on the function and regulation of methylerythritol phosphate and mevalonate pathways and their evolutionary dynamics [J]., 2021, 63(7): 1211-1226.

[11] Singh B, Sharma R A. Plant terpenes: Defense responses, phylogenetic analysis, regulation and clinical applications [J]., 2015, 5(2): 129-151.

[12] 李振秋, 王花紅, 王紅, 等. 中藥青蒿鯊烯合酶的大腸桿菌表達(dá)、純化與功能鑒定 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2007, 13(3): 309-312.

[13] 邢朝斌, 龍?jiān)录t, 勞鳳云, 等. 刺五加鯊烯合酶基因的表達(dá)及其對皂苷含量的影響 [J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 2013, 31(1): 25-29.

[14] 吳耀生, 朱華, 李珅, 等. 三七鯊烯合酶基因在三七根、莖、蘆頭中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與三萜皂苷合成 [J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2007, 23(12): 1000-1005.

[15] 馬藝沔, 袁麗釵, 張林甦, 等. 2個(gè)丹參鯊烯合酶基因的克隆和鑒定 [J]. 中草藥, 2014, 45(9): 1307-1312.

[16] 榮齊仙, 姜丹, 查良平, 等. 白花丹參鯊烯合酶SQS2的克隆與原核表達(dá)分析 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(7): 1259-1265.

[17] 劉雨佳, 蘇平, 王秀娟, 等. 雷公藤鯊烯合酶基因全長cDNA克隆及誘導(dǎo)表達(dá)分析 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 51(4): 657-661.

[18] 李振秋, 王曉明, 金亞明, 等. 黃芪鯊烯合酶基因的克隆和序列分析 [J]. 河北林果研究, 2011, 26(1): 16-19.

[19] Misra R C, Maiti P, Chanotiya C S,. Methyl jasmonate-elicited transcriptional responses and pentacyclic triterpene biosynthesis in sweet basil [J]., 2014, 164(2): 1028-1044.

[20] Unland K, Pütter K M, Vorwerk K,. Functional characterization of squalene synthase and squalene epoxidase in[J]., 2018, 2(6): e00063.

[21] 何焱, 李忠玥, 李卿, 等. 藏藥翼首草角鯊烯合成酶的生物信息學(xué)分析 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2020, 39(7): 3139-3150.

[22] 何焱, 李忠玥, 劉江, 等. 翼首草實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選 [J]. 分子植物育種, 2020, 18(9): 2987-2993.

[23] 關(guān)昕璐, 閻玉凝, 任子和, 等. 翼首草的鑒別研究 [J]. 中國中藥雜志, 2004, 29(11): 1027-1030.

[24] 甄梓娟, 徐元江, 廖志華, 等. 藏藥匙葉翼首草及其同屬植物的研究進(jìn)展 [J]. 中藥材, 2016, 39(1): 223-228.

[25] 蘭小中, 周戰(zhàn). 一種高海拔地區(qū)翼首草的高產(chǎn)人工栽培技術(shù): CN103141291A [P]. 2013-06-12.

[26] 林升得, 江道峰, 張藝, 等. 分光光度法測定藏藥翼首草不同藥用部位總皂苷的含量 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(5): 101-104.

[27] 楊榮平, 向春艷, 張小梅, 等. 不同產(chǎn)地翼首草中總皂苷的含量比較 [J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2010, 21(7): 1797-1798.

Cloning, expression pattern and functional analysis of squalene synthase (PhSQS2) in

WANG Yun1, WU Yu2, JIANG Qing-feng3, HE Yan2, 4, LAN Xiao-zhong4, ZHANG Lei1, 2

1. Biomedical Innovation R&D Center, School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China 2. Department of Pharmaceutical Botany, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 3. Pharmacy Department, Medical Security Center, General Hospital of Tibet Military Region, Lhasa 850000, China 4.Animal Husbandry College and TAAHC-SWU Medicinal Plant R&D Centre, Tibet Agricultural and Animal Husbandry University, Nyingchi 860000, China

To explore the squalene synthase (SQS) from the transcriptome ofand investigate its mechanism of action.Takingas research object , thegene was cloned and bioinformatically analyzed based on preliminary transcriptome data; The subcellular localization of PhSQS2 was observed by transient transformation experiments in tobacco, and the expression characteristics of PhSQS2 in different organs were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR; Finally, the prokaryotic expression vector was constructed to identify the function of PhSQS2 by enzymatic reaction.Thegene was screened with the length of open reading frames 1242 bp, encoding proteins 414 amino acids. Bioinformatics analysis showed that it was an unstable hydrophobic protein with a relative molecular weight of 47 400, a theoretical PI of 6.57 and an average hydrophobicity of ?0.075. PhSQS2 was mainly localized in nucleus and cytoplasm;Its tissue distribution was specific,and it was expressed in both roots and leaves, and the expression in leaves were significantly higher than those in roots.enzymatic reactions proved that as a squalene synthase, PhSQS2 catalysed the production of squalene from farnesyl pyrophosphate.The functional identification of PhSQS2 provides a theoretical basis for the further analysis of the terpenoid biosynthesis pathway and the improvement of triterpenoid saponins from, as well as for in-depth research on the screening and cultivation of high-quality germplasm resources.

(C.B.Clarke) H?eck;; squalene synthase (PhSQS2); bioinformatics analysis; expression pattern; gene function

R286.12

A

0253 - 2670(2022)21 - 6840 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.022

2022-04-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31970316）；上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人計(jì)劃（19XD1405000）

王 蕓（1993—），女，助理實(shí)驗(yàn)師。E-mail: ssalvia4444@shu.edu.cn

蘭小中（1973—），男，教授，研究方向?yàn)椴厮庂Y源、中藥資源與品質(zhì)調(diào)控。E-mail: lanxiaozhong@163.com

張 磊（1977—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與品質(zhì)調(diào)控。E-mail: starzhanglei@aliyun.com

#共同第一作者：吳 宇（1988—），女，助教，研究方向?yàn)橹匾钚蕴烊划a(chǎn)物的生物合成與代謝調(diào)控。E-mail: wuyuagnes@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]