姜云鴿,席曉萌,黃相中,田 凱

云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500

乙型肝炎是乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染人體引起的高傳染性疾病。病毒入侵人體后會(huì)持續(xù)復(fù)制,造成肝臟病變,進(jìn)而引發(fā)肝硬化、肝細(xì)胞癌等疾病[1],乙肝是十大致死疾病之一[2-3],目前沒有徹底治愈乙肝的方法,一般將抑制病毒持續(xù)復(fù)制作為治療方案[4]。臨床治療乙肝的藥物大多被發(fā)現(xiàn)存在降低耐藥屏障、耐藥變異、腎毒性、停藥反彈等情況,難以徹底清除病毒,且對人體機(jī)能產(chǎn)生較大的負(fù)面影響[5-6],因此尋找更高效安全的新型抗乙肝病毒藥物是十分必要的。

黃酮類化合物以2-苯基色原酮為骨架構(gòu)建[7],常連接醇羥基、甲基等官能團(tuán),可分為黃酮、異黃酮類、黃烷酮類等15種類別之多[8],取代基的位置和數(shù)目都會(huì)影響其抗病毒活性[9],其普遍存在于天然植物、中藥材當(dāng)中,毒副作用小,具有抗炎、防氧化、抗過敏等多種功能[10-12]。研究證明,黃酮類化合物有降血壓、防治心腦血管疾病、體內(nèi)外抗病毒等多種藥理活性,藥用價(jià)值高[13-15]。這類化合物可抑制HBV表面抗原分泌、阻斷DNA的復(fù)制及合成、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),從而減緩感染進(jìn)程[16]。

本研究共使用35個(gè)黃酮類化合物小分子進(jìn)行對接,這些化合物均由云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在辣木、半育耳蕨、野番豆等天然中藥材中獲取有效活性成分及相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu),用于后續(xù)對接。根據(jù)文獻(xiàn)查閱,發(fā)現(xiàn)35個(gè)化合物中大部分都具有較好的護(hù)肝抗炎的作用,例如:7-O-甲基圣草酚、櫻花素、球松素具有較好的抗病毒和抗炎活性,而且球松素還具有較好的修復(fù)肝損傷的作用；紫鉚黃酮具有抗肝纖維化作用與保肝作用,還能激活PI3K-Akt信號通路[17]；漆黃素可以抗肝炎,且對肝臟炎性損傷具有保護(hù)作用；羥基蕪花素對肝癌細(xì)胞的增殖等具有明顯的抑制作用等[18]。安全低毒、新型高效抗病毒的藥物是目前治療乙肝藥物研發(fā)的主流目標(biāo),根據(jù)黃酮類化合物具有的特性,可以將其作為研制新型抗乙肝病毒藥物的活性成分。

分子對接(molecular docking)基于“鎖鑰原理”,確定配體與受體的取向、位置與結(jié)合模式,研究其構(gòu)象及變化[19-20]。在藥物設(shè)計(jì)中,分子對接技術(shù)可以高效準(zhǔn)確地篩選出與受體蛋白有較好親和力的類藥小分子,從中發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的先導(dǎo)化合物,在新藥設(shè)計(jì)中具有重要意義[21]。分子對接可同時(shí)進(jìn)行大批量快速篩選,縮短實(shí)驗(yàn)周期,成本低且準(zhǔn)確率高,能減少科研的盲目性與偶然性,已成為研發(fā)新藥物的基礎(chǔ)[22],利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)幫助新藥研發(fā)也成為科研熱點(diǎn)之一。本文采用Discovery Studio 2.5軟件的Libdock模塊進(jìn)行對接分析。

本文將目前臨床使用較為廣泛的三種抗乙肝病毒藥物恩替卡韋、拉米夫定與乙肝病毒蛋白進(jìn)行對接,獲取對接比分及活性位點(diǎn),再將實(shí)驗(yàn)室獲取的黃酮類化合物與乙肝病毒蛋白進(jìn)行分子對接,最后將黃酮類化合物與抗乙肝病毒藥物的對接結(jié)果進(jìn)行比對,篩選出對接結(jié)果較好的黃酮類化合物,分析實(shí)驗(yàn)室獲取的黃酮類化合物是否具有抗乙型肝炎病毒的作用,為新型乙型肝炎抑制劑藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 配體小分子的預(yù)處理

本實(shí)驗(yàn)中,拉米夫定、恩替卡韋、阿德福韋酯三種藥物的結(jié)構(gòu)可以直接通過有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem下載MDL SDfile(*.sdf)格式文件,將35個(gè)黃酮類化合物的平面結(jié)構(gòu)直接用ChemDraw Ultra 14.0軟件分別畫出,保存為(*.sdf)格式文件。再將小分子結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入Discovery Studio 2.5中,進(jìn)行加氫、能量優(yōu)化等操作,并重新保存文件。通過DS將35個(gè)文件整合,對接時(shí)一次性選擇所有配體結(jié)構(gòu),完成批量對接操作[23]。

1.2 受體蛋白的預(yù)處理

在本文的計(jì)算過程中,所使用的乙型肝炎病毒蛋白結(jié)構(gòu)是通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲取的。以“Hepatitis B virus”作為關(guān)鍵詞,檢索并下載相應(yīng)PDB格式的蛋白結(jié)構(gòu)。本文使用的是人類乙型肝炎病毒衣原體蛋白(PDB:1QGT)進(jìn)行后續(xù)分子對接研究,將1QGT結(jié)構(gòu)導(dǎo)入DS軟件中,去水加氫、去除蛋白多構(gòu)象、補(bǔ)充非完整氨基酸殘基,保存作為對接受體蛋白。

1.3 分子對接仿真運(yùn)行

進(jìn)行對接之前,需將處理后的蛋白定義為受體。軟件會(huì)自動(dòng)篩選出受體的潛在有效結(jié)合位點(diǎn),對接時(shí)需定義位點(diǎn)的球形區(qū)域進(jìn)行后續(xù)對接。每個(gè)位點(diǎn)須單獨(dú)定義,球形區(qū)域之間不能重疊且要完全包含結(jié)合位點(diǎn)的前提下盡量小,這樣有助于提高對接的準(zhǔn)確度還能盡量縮短仿真分子對接的計(jì)算時(shí)間。

通過DS軟件中的Protocols面板的Dock Ligand(Libdock)模塊對預(yù)處理后的乙肝病毒受體蛋白與三種抗乙肝藥物、復(fù)合黃酮類化合物小分子文件分別進(jìn)行分子對接,設(shè)定對接參數(shù),最后進(jìn)行結(jié)果分析。

2 對接結(jié)果與分析

DS軟件會(huì)自動(dòng)查找并篩選出所有潛在的活性位點(diǎn)并按照活性大小由高向低排序,并通過內(nèi)置算法評估每個(gè)位點(diǎn)區(qū)域與受體蛋白的結(jié)合程度,并給出對接比分Libdock Score。Libdock Score是對能量、幾何形狀、化學(xué)環(huán)境綜合評價(jià)的參數(shù),分?jǐn)?shù)越高,證明配體與受體的結(jié)合程度越好且結(jié)合模式較優(yōu),相互作用也越強(qiáng)。

2.1 抗乙肝病毒藥物與受體蛋白對接結(jié)果與分析

DS軟件一共獲取了受體蛋白的8個(gè)位點(diǎn),分別構(gòu)建球形區(qū)域?qū)印＠肈S軟件分別選取三種藥物的結(jié)構(gòu)作為配體與受體蛋白1QGT進(jìn)行對接,經(jīng)過分子仿真模擬對接后,發(fā)現(xiàn)在與三種抗乙肝藥物的對接中,只有Site 3這一位點(diǎn)與三種藥物小分子對接分?jǐn)?shù)(吻合度Libdock Score)較高,因此選取Site 3的對接結(jié)果分析,最高分如表1示。由表1得,在位點(diǎn)Site 3中,阿德福韋酯分子與1QGT對接分?jǐn)?shù)最高,說明二者結(jié)合程度最好,有很強(qiáng)的相互作用。為便于觀察與分析相互作用,將三種藥物對接結(jié)果最高分進(jìn)行二維與三維可視化。

表1 三種抗乙肝病毒藥物對接最高分

圖1為阿德福韋酯與1QGT對接結(jié)果圖。阿德福韋酯與蛋白殘基TRP102、SER106、SER121、THR128形成5個(gè)氫鍵,具有極強(qiáng)的氫鍵作用；與TRP125、LEU140、TYR132形成碳?xì)滏I；PRO134、ARG133的陽離子與苯環(huán)π電子間存在p-π共軛效應(yīng)；ARG127、PRO25、LEU30、VAL124、PHE110、ILE105、TYR38、LEU37與烷基產(chǎn)生了π-烷基作用；阿德福韋酯與氨基酸PHE122、PRO138、SER141、ILE139、TYR118、THR142、VAL120、PHE23、THR109、THR33、PHE18、PHE24、PRO129存在較強(qiáng)的疏水作用,推測THR128、PRO134、VAL124、PRO25、LEU30可能在阿德福韋酯分子與1QGT的相互作用中起到關(guān)鍵作用。

圖1 阿德福韋酯與1QGT Site3對接二維圖與三維圖

圖2為恩替卡韋與1QGT對接結(jié)果圖。恩替卡韋與蛋白殘基TRP102、LEU140、SER106形成3個(gè)氫鍵,有很強(qiáng)的氫鍵作用；與TYR132、TRP102形成碳?xì)滏I；PRO25和LEU30的陽離子與苯環(huán)π電子間存在p-π共軛效應(yīng)；PHE23、PRO129與烷基產(chǎn)生了π-烷基作用；恩替卡韋與氨基酸ILE139、THR128、PHE24、TYR118、ARG133、LEU101、ILE105、VAL124、ASP29、THR33、ARG127存在較強(qiáng)疏水作用,推測LEU140、TRP102、PRO25可能在恩替卡韋分子與1QGT的相互作用中起到關(guān)鍵作用。

圖2 恩替卡韋與1QGT Site3對接二維圖與三維圖

圖3是拉米夫定與1QGT對接結(jié)果圖。拉米夫定與蛋白殘基TYR118、LEU140、PHE23、THR128形成4個(gè)氫鍵,具有極強(qiáng)的氫鍵作用；與TYR132、PRO129形成碳?xì)滏I；PHE23、PRO25、LEU140的陽離子與苯環(huán)π電子間存在p-π共軛效應(yīng)；TRP102的陰離子與配體苯環(huán)形成共軛效應(yīng)；拉米夫定與氨基酸ARG133、ILE139、PRO134、TRP125、VAL124、SER106、PHE24存在較強(qiáng)的疏水作用,推測PHE23、LEU140可能在拉米夫定分子與1QGT的相互作用中起到關(guān)鍵作用。

圖3 拉米夫定與1QGT Site3對接二維圖與三維圖

2.2 黃酮類化合物與乙肝病毒蛋白對接結(jié)果

經(jīng)過黃酮類化合物文件和受體蛋白的分子仿真模擬對接,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物與三種抗乙肝病毒藥物一樣,都與Site 3位點(diǎn)結(jié)合分?jǐn)?shù)最高,35個(gè)黃酮類化合物對接最高分結(jié)果如表2示。由表2知,在Site 3中,HT28與1QGT的對接分?jǐn)?shù)最高,說明二者結(jié)合程度最好,其次表中HT10、HT1等配體的對接比分也都較高,說明它們與受體蛋白也有較強(qiáng)的相互作用。為便于觀察與分析相互作用,將排名前三的結(jié)果進(jìn)行二維與三維可視化(見圖4)。

表2 黃酮類化合物Site3對接結(jié)果分?jǐn)?shù)表

圖4 35個(gè)黃酮類小分子與1QGT蛋白3號位點(diǎn)分子對接示意圖

圖5為HT28與1QGT對接結(jié)果圖。HT28與蛋白殘基ILE139、VAL124、THR33、PRO134形成碳?xì)滏I；PRO25、LEU140和LEU30的陽離子與苯環(huán)π電子間存在p-π共軛效應(yīng)；HT28與氨基酸ARG133、TYR132、TYR118、PHE23、PHE24、THR128、SER106、TRP102、PRO129、ALA34、ILE105、LEU101、ASP29、PHE18、ARG127、PHE110、TRP125、GLY123存在較強(qiáng)疏水作用,推測LEU140、PRO25、LEU30可能在HT28與1QGT的相互作用中起到關(guān)鍵作用。

圖5 HT28與1QGT Site3對接二維圖與三維圖

圖6為HT10與1QGT對接結(jié)果圖。HT10與蛋白殘基PHE23、TYR118形成2個(gè)氫鍵,具有較強(qiáng)的氫鍵作用；與LEU30、PRO25形成了一些較弱的碳?xì)滏I；PRO25、ILE105、LEU30、PRO129的陽離子與苯環(huán)π電子間存在p-π共軛效應(yīng)；PHE23與配體芳香環(huán)形成穩(wěn)定的π-π疏水堆積作用；HT10與氨基酸TYR132、ILE139、LEU140、SER106、TRP102、VAL124、ARG127、ASP29、THR33、ALA34、LEU101、THR128、PHE24、PHE110存在較強(qiáng)疏水作用,推測PHE23、PRO25、LEU30可能在HT10與1QGT的相互作用中起到關(guān)鍵作用。

圖6 HT10與1QGT Site3對接二維圖與三維圖

圖7為HT1與1QGT對接結(jié)果圖。HT1與蛋白殘基PHE23、TYR118形成2個(gè)氫鍵,具有較強(qiáng)的氫鍵作用；與LEU30、PRO25形成了一些較弱的碳?xì)滏I；PRO25、ILE105、LEU30、PRO129的陽離子與苯環(huán)π電子間存在p-π共軛效應(yīng)；PHE23與配體芳香環(huán)形成穩(wěn)定的π-π疏水堆積作用；HT1與氨基酸TYR132、ILE139、LEU140、SER106、TRP102、VAL124、ARG127、ASP29、THR33、ALA34、LEU101、THR128、PHE24存在較強(qiáng)疏水作用,推測PHE23、PRO25、LEU30可能在HT1與1QGT的相互作用中起到關(guān)鍵作用。

圖7 HT1與1QGT Site3對接二維圖與三維圖

3 結(jié) 論

本文主要基于分子對接技術(shù),將應(yīng)用廣泛的三種抗乙肝病毒藥物與乙肝病毒蛋白進(jìn)行對接,通過對接軟件確定潛在活性位點(diǎn),探究了藥物分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合模式與相互作用關(guān)系,再將35種實(shí)驗(yàn)室獲得的黃酮類化合物與人類乙型肝炎病毒衣原體蛋白1QGT進(jìn)行對接模擬計(jì)算,從而探究黃酮類化合物是否具有抗乙肝病毒的作用。通過對結(jié)果的分析比較,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物與三種抗乙肝病毒藥物進(jìn)行作用的乙肝病毒蛋白位點(diǎn)相同且作用殘基大部分都是相同的,其中與受體相互作用種類多且作用較強(qiáng)的共同殘基主要有:PHE23、LEU140、PRO25、PRO134等,推斷它們可能為受體的活性位點(diǎn)殘基；通過進(jìn)一步篩選對接結(jié)果,發(fā)現(xiàn)HT28、HT10、HT11這3個(gè)黃酮類化合物與乙肝病毒蛋白的對接最高分?jǐn)?shù)都在127分以上,均遠(yuǎn)超過了拉米夫定與恩替卡韋兩種藥物的對接最高分,僅次于藥物阿德福韋酯,說明這3個(gè)黃酮類化合物可能對乙肝病毒起到較強(qiáng)的抑制作用,是比較好的抗乙肝病毒的活性成分,可以用于新藥物的后續(xù)研發(fā)。而其他分?jǐn)?shù)略高于拉米夫定和恩替卡韋兩種藥物的黃酮類化合物如HT11、HT23、HT24等,通過結(jié)構(gòu)的修飾改性,或許在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中也能有比較好的抗病毒效果。通過上述結(jié)果分析,我們能夠合理推測,實(shí)驗(yàn)選取的部分黃酮類化合物作為乙型肝炎病毒抑制劑具有一定的可行性,或許未來黃酮類化合物能夠成為新型抗乙肝病毒藥物的活性成分。這也說明利用分子對接方法進(jìn)行藥物的虛擬篩選從而進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)是可靠的,能為研發(fā)新型抗乙肝病毒藥物提供一定的理論依據(jù)。