師 聲,張 靜,胡 岳,劉義慶,褚福祿,蘭文軍*

1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 生物工程學院,山東 濟南 250353；2.山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗部,山東 濟南 250021

結(jié)直腸癌是一種起源于結(jié)腸或直腸的胃腸道惡性腫瘤,是世界上發(fā)病率第三高的惡性腫瘤,(185萬新發(fā)病例/年；占惡性腫瘤總數(shù)的10.2%)。人口老齡化、高收入導致的飲食習慣變化以及缺乏體育鍛煉、過度肥胖和不良嗜好等因素導致結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升。目前0～74歲人群的累積發(fā)病風險為2.27%,而年齡在50歲至85歲之間患病率增加了10倍以上。與女性相比,男性的風險高出了50%以上(男性女性0～74歲的風險分別為2.75%和1.83%)[1]。大約35%的患者在診斷時表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性疾病,多達50%的非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者最終表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性疾病[2]。由于伴隨診斷技術的應用,轉(zhuǎn)移性CRC(mCRC)的個性化治療已經(jīng)取得了顯著進展。

大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(RAS)中的單核苷酸變異被分類為Kirsten RAS(KRAS)、Neuroblastoma RAS(NRAS)和Harvey RAS(HRAS),已被確定為指導轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療藥物使用的生物標志物。癌基因RAS編碼一種三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白(GTPase),并在表皮生長因子受體(EGFR)觸發(fā)的RAS-RAF-MEK-ERK信號級聯(lián)中占據(jù)重要地位。驅(qū)動腫瘤生長,致癌轉(zhuǎn)移和免疫抑制[3-4]。KRAS[5]、NRAS[6]和HRAS[7]突變率分別為40%、4%和<1%。此外,KRAS突變也與姑息性原發(fā)性腫瘤切除術(PTR)手術中不可切除的mCRC患者的生存結(jié)果相關[8]。

利用堿基錯配、并在突變鑒別反應孔和參考反應孔中使用共水解探針和反向引物,基于單重引物等位基因鑒別分析[9]以及多重引物等位基因鑒別分析[10]的KRAS基因突變檢測已有報道。然而,我們發(fā)現(xiàn)上述多重分析中的ΔCq值(突變檢測與參考檢測閾值周期的差異)并不能正確關聯(lián)結(jié)果。在鎖定核酸(LNA)和不對稱擴增的輔助下,本研究設計、優(yōu)化和評價了一種檢測KRAS突變的多重引物等位基因識別(MPmAD)分析,可用于指導mCRC治療中anti-EGFR單克隆抗體的給藥。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

ABI 7500 熒光定量PCR儀(美國applied biosystems公司)；5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；IMPLEN 5186超微量分光光度計(德國Implen公司)；epMotion 5075自動移液工作站(德國Eppendorf公司)；DYY-6C 核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；EVOS M7000全自動活細胞成像系統(tǒng)(美國Thermofisher公司)；NuGenius 凝膠成像系統(tǒng)(英國syngene公司)。

1.2 實驗材料

多重前向引物、參考前向引物、反向引物和探針自行設計,并由生物工程(上海)股份有限公司合成。所有引物和探針序列如表1、表2所示。

表1 多重檢測體系引物/探針序列

表2 參考體系引物/探針序列

使用外周血基因組DNA提取試劑盒(天根,DP304-02)提取野生型基因組DNA。本研究福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本取自山東大學齊魯醫(yī)院、山東第一醫(yī)科大學。使用QIAamp DNA石蠟組織試劑盒(No.1080391)提取福爾馬林固定石蠟包埋組織DNA。超微量分光光度計檢測提取DNA濃度,提取DNA于-20 ℃保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 KRAS突變檢測設計策略

為檢測KRAS突變(G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V和G13D),多重檢測體系中使用了等位基因特異性(AS)正向引物、FAM-BHQ1標記的水解探針和反向引物,參考體系中使用了參考正向引物、FAM-BHQ1標記的探針和反向引物,設計策略如圖1所示。通過計算ΔCq值(多重檢測試驗和參考試驗之間閾值循環(huán)數(shù)的差異),以確定陰性和陽性。由于鎖核酸(LNA)引物在多重檢測體系中表現(xiàn)出更高的識別能力和特異性[11],我們在引物3′端利用LNA修飾了多重前向引物。在本研究中,內(nèi)參被省略,參考分析中的擴增子起到模板質(zhì)量控制的作用。

圖1 KRAS突變的MPmAD分析策略

2.1.2 核酸實時擴增

想要避免一味比較的習慣，真正有效的辦法不是禁止做某事，而是用做另一件事來替代。如果我們要減少有害的比較，就得讓自己去做有益的比較。

多重檢測擴增反應體系為20 μL,包含10 μL 2×TaqMan master mix,0.4 μmol/L鎖核酸修飾的前向引物(F PCR primer-G12R-G13D)、0.4 μmol/L反向引物(R PCR primer),0.2 μmol/L水解探針(PCR probe)和50 ng DNA模板。參考擴增反應體系則使用0.4 μmol/L參考前向引物(F-reference PCR primer)代替鎖核酸修飾的前向引物。使用ABI 7500儀器進行反應,采用兩步法,95 ℃預變性1 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸30 s,反應進行40循環(huán)。每組實驗至少包括一個陽性對照和一個不含DNA的陰性對照。

2.1.3 預估閾值

重復測量10個野生型基因組DNA樣本,獲取多重反應與參考反應擴增循環(huán)數(shù)差值ΔCq,ΔCq檢測閾值=ΔCq最小值-1。當ΔCq檢測閾值<11時,KRAS檢測為陽性。

2.1.4 一致性分析

FFPET標本送至青島派森諾基因生物技術有限公司進行Sanger測序,使用Kappa系數(shù)檢驗本方法與Sanger測序兩種方法學的一致性。

2.2 結(jié)果

2.2.1 靈敏度

以突變型質(zhì)粒分子模型對檢測體系進行靈敏度分析。在50 ng野生型基因組DNA背景下,制備KRAS 12/13密碼子10.0%、3.0%、1.0%和0.3%突變型質(zhì)粒分子模型,并用MPmAD檢測方法分析質(zhì)?；旌蠘颖尽閮?yōu)化分析靈敏度,多重分析采用不對稱擴增法,將F-primer G12C、G12D和G12V的濃度分別調(diào)整為1.0、1.2和1.0 μmol/L。如圖2顯示,KRAS突變的檢測限(LOD)至少為3%。

圖2 MPmAD分析靈敏度

按照多重檢測方法進行普通PCR反應。將50 ng野生型基因組DNA背景的10% KRAS突變質(zhì)粒的擴增子在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,驗證其特異性。電泳結(jié)果顯示,質(zhì)?；旌衔镉袛U增條帶,而野生型基因組DNA沒有擴增條帶,如圖3A所示。

A—10%的KRAS突變型質(zhì)粒分子模型擴增子的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖(NTC:陰性野生型基因組DNA；NC:無DNA陰性對照)；B— 3%的KRAS突變型質(zhì)粒多重檢測反應和參考反應擴增圖(a,b,c,d,e,f,g:G13D,G12A,G12V,G12C,G12R,G12S和G12D)。圖3 MPmAD分析靈敏度

圖3B顯示,與有野生型基因組DNA(negative control with wild-type genomic DNA,NTC)或沒有野生型基因組DNA的陰性對照(negative control without DNA,NC)相比,3%突變KRAS12/13密碼子的混合質(zhì)粒樣本顯著擴增。

2.2.3 精密度

通過檢測3%突變的KRAS 12/13密碼子質(zhì)粒來評估檢測試劑精密度。此外,我們還檢測了2個攜帶KRAS 12/13密碼子上突變的FFPET樣本。2人操作5天內(nèi)每天使用兩批次進行測試,每個標本每批次進行8個重復測試(n=80/標本),共收集80個ΔCq值,計算變異系數(shù)(CV)=標準差/平均值×100%。精密度評估顯示,3%G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13DKRAS質(zhì)粒樣本CV值分別為:7.74%、5.89%、8.20%、7.95%、7.33%、8.16%、7.39%；NO.42 FFPET、NO.5 FFPET樣本變異系數(shù)分別為:10.94%、6.79%。所有天數(shù)、樣本、重復品、操作人員和試劑批次組合的CV值均<15%。

2.2.4 交叉實驗

本研究通過判斷同源質(zhì)粒的存在是否影響KRAS突變檢測來評價交叉反應。對野生型基因組DNA樣本和野生型基因組DNA背景的3%突變質(zhì)粒樣本,分別混合3%的KRAS同源(KRAS12/13密碼子假基因、NRAS2號外顯子及HRAS2號外顯子)質(zhì)粒。結(jié)果表明,同源質(zhì)粒在本實驗中無交叉反應。

圖4 MPmAD分析交叉實驗結(jié)果

2.2.5 一致性分析

本檢測方法與Sanger測序?qū)RAS突變的鑒別無統(tǒng)計學差異(k=0.946；p<0.001)。在包含115個FFPET樣本中,共有70個樣本被本檢測方式檢測為陽性。其中有3例陽性樣本被本方法檢出,而Sanger測序顯示為陰性。以Sanger測序為參考,計算出的陽性一致性為100.00%(95%CI 93.51%～100%),陰性一致性為93.75%(95%CI 82.53%～98.49%),一致性結(jié)果如表3,圖5A、B所示。

表 MPmAD與Sanger測序?qū)RAS基因檢測的一致性分析

圖5 MPmAD代表擴增與Sanger測序圖

3 討 論

在人類DNA單核苷酸多態(tài)性靶點的多重AS-PCR中,LNA引物具有更高的特異性。本研究的AS引物在多重檢測體系中中用LNA修飾。LNA是一種帶有2′-O,4′-C-亞甲基的核酸衍生物[12]。生成的雙環(huán)結(jié)構將核糖部分鎖定為C3′-endo構象,這可以增強雜化Tm[13]和雜交特異性[14]。特異性的提高可能是由于具有3′LNA末端的AS引物形成了較少的模板連接,并影響了DNA聚合酶底物的利用[15]。

由于從FFPET中提取的DNA容易降解為100～200 bp的片段,本研究使用ΔCq值來決定結(jié)果,以避免假陰性。在這項研究中,不對稱擴增也用于提高G12C、G12D、G12V和Q61R的分析靈敏度。結(jié)果顯示,KRAS檢測靈敏度至少為3%。檢測115例FFPET樣本,有3例陽性樣本可被本方法檢出,而Sanger測序顯示為“陰性”,這可能是由于Sanger測序靈敏度(10%)較低所致。本研究表明,與Sanger測序與融解曲線分析法(cobas?KRAS Mutation Test,Roche Diagnostics)相比,鎖核酸和不對稱擴增輔助的多重引物等位基因識別分析更敏感。

由于在實時熒光PCR中共擴增時,目標反應可能強于內(nèi)控反應。本研究省略了內(nèi)參對照品,將參考反應擴增子用于ΔCq值的獲取和模板的質(zhì)控。

伴隨診斷試劑盒的非臨床評價的分子模型主要包括:(i)基因組DNA背景下的質(zhì)?；旌希?ⅱ)細胞系/FFPET的突變和野生型DNA的混合物。由于突變的細胞系和FFPET標本不易收集,本研究采用了質(zhì)?；旌衔颷16]評估分析的靈敏度、交叉反應性和重現(xiàn)性。

據(jù)COSMIC數(shù)據(jù)庫,12/13密碼子上的7個KRAS熱點突變占所有KRAS突變的92%以上。研究證明,7個KRAS熱點突變可以清楚地預測西妥昔單抗聯(lián)合FOLFOX/folfiri治療的反應[17-18]。這些數(shù)據(jù)表明,檢測7個KRAS熱點突變足以在mCRC中指導anti-EGFR單克隆抗體的使用。

本研究開發(fā)了一種基于鎖核酸和不對稱擴增輔助多重引物等位基因分析方法,可用于指導anti-EGFR單克隆抗體在mCRC治療中的靶向給藥,該方法具有簡潔和低成本的優(yōu)點。與多探針等位基因鑒別分析相比[19],本研究中描述的檢測方法更加經(jīng)濟,尤其適用突變體比例可能很低的FFPET樣本[20]。