孫敏敏，宋偉豪，吳 鵬，劉心田，齊 潔*

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島266003；2.中國海洋大學三亞海洋研究院海南省熱帶水產(chǎn)種質(zhì)重點實驗室，海南 三亞 572000；3.威海市漁業(yè)推廣站，山東 威海 264400)

引 言

兩性配子發(fā)生包括生殖干細胞有絲分裂、增殖和減數(shù)分裂以及減數(shù)分裂后精子發(fā)生等多個過程[1-2]。DAZ基因家族為這些過程在分子水平上的進化保守性提供了為數(shù)不多的證據(jù)，在脊椎動物和無脊椎動物的雄性和雌性配子的產(chǎn)生中起著重要的作用[3-4]。DAZ家族由基因Daz、Dazl和Boule組成，它們都編碼RNA結(jié)合蛋白，其中包含一個保守的RNA識別基序(RRM)和一個或多個重復的DAZ基序[5]。Boule作為這個家族最古老的成員從原始的基底后生動物到脊椎動物都一直存在[3，6]，而Dazl從Boule進化而來，它從硬骨魚到人都一直存在[7]。Daz只存在于高等靈長類動物中，位于Y染色體上，其序列包含七個DAZ結(jié)構(gòu)域重復[8-9]。Dazl和Boule位于常染色體上[4，10]，它們與Daz基因共同編碼RNA結(jié)合蛋白，在生殖細胞中特異表達，參與調(diào)控生殖細胞的發(fā)育和分化[5，11]。

DAZ基因家族通過調(diào)控 mRNA的翻譯過程影響生殖細胞的發(fā)育分化并且這些蛋白質(zhì)功能的喪失會導致雄性和雌性不育。Dazl和Boule是配子發(fā)生過程中不可缺少的調(diào)節(jié)因子[12-13]。小鼠中Dazl基因的缺失造成生殖細胞和配子的缺失，證實Dazl對于生殖細胞的分化是至關(guān)重要的[14]。在秀麗線蟲中Boule突變體導致卵子發(fā)生障礙[15]。研究發(fā)現(xiàn)小鼠通過Dazl結(jié)合Vasa同源基因(Mvh)的3 '-UTR刺激翻譯，Mvh是一種對雄性配子形成至關(guān)重要的基因，并發(fā)現(xiàn)Dazl缺失小鼠的生殖細胞中Mvh蛋白水平降低，說明Dazl介導的Mvh翻譯調(diào)控對哺乳動物精子形成至關(guān)重要[16]。果蠅突變體缺失Boule使得Twine(一種cdc25型磷酸酶)失活，阻止其進入減數(shù)分裂[17]。研究表明Dazl和Boule基因不僅能直接調(diào)控生殖細胞發(fā)育分化，而且能影響其它生殖細胞相關(guān)基因的表達。在原始生殖細胞(PGCs)的起源、遷移、分化及配子發(fā)生研究中，DAZ基因家族作為標記基因參與生殖質(zhì)mRNA的翻譯。

非洲爪蟾中母體DazlmRNA的特異性缺失，導致PGCs嚴重缺乏且PGC遷移出現(xiàn)障礙，不能從腹側(cè)遷移到背側(cè)內(nèi)胚層，也不能到達背側(cè)腸系膜。Dazl能夠作為一種RNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)介導PGCs遷移的因子的翻譯或表達[11]。

研究人員已經(jīng)在斑馬魚[18]、銀鯽[19]、青鳉、羅非魚[20]、虹鱒[21-22]、尖吻鱸[23]和牙鲆[24]等魚類中對DAZ家族基因進行了克隆并分析了其表達模式，大多數(shù)硬骨魚類Dazl和Boule均僅存在于性腺中，兩者在配子發(fā)生時表現(xiàn)出階段特異性的表達。青鳉[25-26]中關(guān)于Boule和Dazl的RNA表達模式的研究表明Boule和Dazl在有絲分裂和減數(shù)分裂生殖細胞中均有雙性表達的現(xiàn)象。虹鱒[21-22]中，Dazl不僅表現(xiàn)在雌、雄配子發(fā)生的有絲分裂和減數(shù)分裂階段中發(fā)揮作用，還能階段特異性亞細胞定位到巴爾比亞尼體，而Boule沒有定位到巴爾比亞尼體。Boule和Dazl是尖吻鱸成體中的生殖細胞標記物[23]，其在時空表達和亞細胞分布方面存在明顯差異。Boule和Dazl的兩性生殖細胞特異性表達在魚類中一直比較保守。DAZ家族基因的表達與其在生殖系發(fā)育不同階段的具體作用密切相關(guān)，故對DAZ家族基因在低等和高等脊椎動物中的表達比較進行分析，將為研究配子發(fā)生和生殖細胞分化的分子機制提供材料。

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)為卵胎生的巖礁性魚類，是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類和增養(yǎng)殖優(yōu)良品種。由于其卵胎生繁殖方式，人工繁殖尚未實現(xiàn)。因此，對重要的生殖細胞標記基因Dazl和Boule進行研究，對了解許氏平鲉的性別分化和發(fā)育機制具有重要意義。在本研究中，我們通過對Daz基因家族進行了結(jié)構(gòu)分析、進化分析及表達分析，為進一步研究Dazl和Boule在許氏平鲉生殖發(fā)育機制和兩性配子發(fā)生過程中的調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物來源與取樣

本研究中所用的1齡半許氏平鲉成魚來源于威海銀澤生物科技股份有限公司。對許氏平鲉進行麻醉后斷椎處理，取6條健康許氏平鲉成魚(3條雄魚和3條雌魚)的10個組織(心、肝、脾、腎、腦、腸、鰓、肌肉、精巢、卵巢)，立即冷凍于液氮中，-80 ℃保存，用于RNA提取。并各取一塊肌肉組織保存于95%乙醇中，用作DNA提取。我們收集了不同發(fā)育階段(交尾前、交尾后和受精前)的雌性卵巢和不同發(fā)育階段(1細胞期、32細胞期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期和孵化期)的胚胎，液氮速凍并保存在-80 ℃，用于RNA提取。

1.2 總RNA提取、cDNA合成及基因組DNA的提取

許氏平鲉各組織及胚胎總RNA由TRIzol法(Invitrogen)提取，使用DNase I和RNA clean試劑盒去除RNA中的DNA和蛋白質(zhì)，通過分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。cDNA由逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒(TaKaRa)合成，使用許氏平鲉β-actin作為引物進行PCR檢測反轉(zhuǎn)錄效果，并置于-80 ℃保存。

采用酚-氯仿的方法提取許氏平鲉基因組DNA，用分光光度計檢測DNA的濃度，使用電泳檢DNA的質(zhì)量。

1.3 Boule和Dazl氨基酸多重序列比對和系統(tǒng)進化分析

從NCBI和Ensembl網(wǎng)站下載其它物種的Boule和Dazl氨基酸序列，同許氏平鲉的Boule和Dazl氨基酸序列用Genedoc軟件進行氨基酸多序列比對。利用 MEGA7.0 的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)進行聚類分析構(gòu)建進化樹，各物種Boule和Dazl氨基酸序列的 Gene Bank 數(shù)據(jù)庫注冊序列號如下：

斑點雀鱔Lepisosteus_oculatus_Boule：XP_015213794.1；虹鱒Oncorhynchus_mykiss_Boule：ADW41783.1；雞Gallus_gallus_Boule：XP_015144979.1；尖吻鱸Lates_calcarifer_Boule：KC992312.1；密西西比鱷Alligator_mississippiensis_Boule：XP_014449905.1；青鳉Oryzias_latipes_Boule：KC992312.1；人Homo_sapiens_Boule：NP_932074.1；鼠Mus_musculus_Boule：AAK69026.2；海龜Chelonia_mydas_Boule：XP_007072013.1；斑馬魚Danio_rerio_Dazl：NP_571599.1；半滑舌鰨Cynoglossus_semilaevis_Dazl：AGG69476.1；人Homo_sapiens_Dazl：NP_001177740.1；斑點雀鱔Lepisosteus_oculatus_Dazl：XP_015212852.1；大黃魚Larimichthys_crocea_Dazl：KAE8282148.1；非洲爪蟾Xenopus_laevis_Dazl：NP_001081772.1；海龜Chelonia_mydas_Dazl：XP_007053304.1；虹鱒Oncorhynchus_mykiss_Dazl：NP_001233268.1；雞Gallus_gallus_Dazl：NP_989549.1；尖吻鱸Lates_calcarifer_Dazl：ABB76649.1；孔雀魚Poecilia_reticulata_Dazl：XP_008419892.1；青鳉Oryzias_latipes_Dazl：NP_001098269.1；鼠Mus_musculus_Dazl-8：NP_001264792.1；鼠Mus_musculus_Dazl-FL：NP_034151.3；牙鲆Paralichthys_olivaceus_DazlⅠ：AKE14490.1；牙鲆Paralichthys_olivaceus_DazlⅡ：AKE14491.1；人Homo_sapiens_Daz：AAB02393.1。

1.4 Boule和Dazl基因表達分析

將許氏平鲉不同組織、不同發(fā)育階段卵子、以及胚胎發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組TPM數(shù)據(jù)歸一化后用pheatmap程序進行熱圖繪制，紅色越深表示表達量越高，藍色越深表示表達量越低。

2 結(jié)果

2.1 許氏平鲉Dazl和Boule基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)許氏平鲉基因組和轉(zhuǎn)錄組序列，tBlastx獲得Dazl和Boule的cDNA序列且Dazl和Boule含有分別有兩種mRNA存在于許氏平鲉性腺轉(zhuǎn)錄本，BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ。兩種轉(zhuǎn)錄本可能來自同一個拷貝基因，在轉(zhuǎn)錄和mRNA成熟過程中，BouleⅠ保留了10個外顯子，而BouleⅡ由于在第一個外顯子處缺失一部分序列，產(chǎn)生11個外顯子。DazlⅠ保留了8個外顯子，而DazlⅡ缺失外顯子7，它們是可變剪接的產(chǎn)物。BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ在序列的其它部分并沒有差異，也沒有轉(zhuǎn)錄時遺留的內(nèi)含子序列，表明BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ可能都有各自的蛋白產(chǎn)物且具有一定的生理功能。

圖1 Dazl和Boule基因之間的比對。Dazl和Boule各存在兩種剪接型。外顯子由黃色方框表示，內(nèi)含子由實線表示。

2.2 許氏平鲉Dazl和Boule氨基酸的多重序列比對

許氏平鲉BouleⅠ，BouleⅡ的cDNA長度分別為1 032 bp和1 008 bp，分別編碼了343和335個氨基酸，DazlⅠ，DazlⅡcDNA序列開放閱讀框分別為654 bp和603 bp，分別編碼217和200個氨基酸。且Dazl和Boule都包含一個 RNA 識別域(RRM)和一個 DAZ 結(jié)構(gòu)域(圖2)。通過多物種Dazl和Boule的氨基酸序列比對(圖2)，各物種在RRM序列區(qū)域有較高的保守性，其它區(qū)域保守性較低。在Dazl中RRM區(qū)域中非硬骨魚和硬骨魚存在差異的氨基酸，將硬骨魚和其它物種分開(圖2A)。Boule和Dazl基因?qū)儆谕换蚣易?，然而它們編碼的蛋白序列卻相差很大。許氏平鲉中Boule 與Dazl之間的同源性是較低的，在 RNA 識別結(jié)構(gòu)域和 DAZ 重復區(qū)其同源性稍高，分別為 50%和30%。

圖2 許氏平鲉Dazl和Boule與其它物種氨基酸的序列比對

2.3 許氏平鲉Dazl和Boule系統(tǒng)進化分析

利用來自不同物種的Dazl和Boule的氨基酸序列，通過MEGA 7.0程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，進化樹主要分為兩個簇，分別為Dazl和Boule(圖3)。許氏平鲉的Dazl首先與其它硬骨魚的Dazl聚合在一起，然后與四足動物，鳥類或哺乳動物的Dazl聚集成一支。多重序列比對顯示許氏平鲉Dazl先與尖吻鱸、大黃魚、孔雀魚聚集，后與斑馬魚等聚集，最后與青鳉聚為一支。氨基酸序列比對顯示其與尖吻鱸序列最為相近，相似性達89.4%，與青鳉較遠，相似度達73.3%。而許氏平鲉Boule先與尖吻鱸、青鳉聚集，后與斑點雀鱔、虹鱒及哺乳動物聚為一支。氨基酸序列比對顯示其與尖吻鱸序列最為相近，相似性達73.6%，與斑點雀鱔較遠，僅有30.2%。而Boule作為Daz基因家族最古老的基因，進化較為特殊，斑點雀鱔及虹鱒魚先和哺乳動物聚為一支再與許氏平鲉等其它硬骨魚聚為一支。結(jié)果表明，許氏平鲉Dazl和Boule較為保守，與哺乳動物親緣關(guān)系較遠，與其它硬骨魚親緣關(guān)系較近。

圖3 許氏平鲉和其它脊椎動物DAZ基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 許氏平鲉Dazl和Boule基因在成魚各組織、胚胎發(fā)育不同時期表達量分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，許氏平鲉Dazl和Boule在成魚各組織中的表達水平呈現(xiàn)相同的表達模式。Dazl和Boule均只在性腺中特異性表達，其它組織中沒有表達(圖4A)。此外許氏平鲉Dazl和Boule在性腺表現(xiàn)為雌雄兩態(tài)表達模式，許氏平鲉Dazl在卵巢表達水平較精巢高，Boule與Dazl不同，精巢中的表達量明顯高于卵巢。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知Boule與Dazl在配子發(fā)生表達模式相似，均在交配前、交配后和受精前階段較高，而在胚胎發(fā)育的時期幾乎沒有表達(圖4B)，表明Boule與Dazl可能對于早期生殖細胞發(fā)育有重要作用，是配子生成的重要調(diào)控因子。

圖4 通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析許氏平鲉Dazl和Boule基因的表達模式

3 討論

本研究鑒定了DAZ基因家族，該家族包括三個基因：Daz[27]，Dazl[28-29]及Boule基因[30-31]。Daz基因缺失可出現(xiàn)少精子癥或無精子癥，從而導致雄性不育，是原始生殖細胞發(fā)育和生殖細胞分化成熟所必需的[32-33]。Dazl基因的無義突變可引起雌、雄雙性不育，導致原始生殖細胞的缺失從而影響生殖細胞的發(fā)育[11，20]。Boule基因作為DAZ 家族重要的一員，是精子發(fā)生過程中調(diào)控減數(shù)分裂的關(guān)鍵因子[26]。Boule在減數(shù)分裂前后表達，功能較為有限。DAZ蛋白在體內(nèi)外均與RNA結(jié)合，可能參與了mRNA表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。由于Daz基因僅存在于舊大陸猴和類人猿的 Y 染色體中[34-35]，故許氏平鲉中該家族僅包括Dazl和Boule。許氏平鲉Dazl和Boule具有DAZ 家族蛋白保守的 RNA 識別域和 DAZ 結(jié)構(gòu)域[36]；DAZ結(jié)構(gòu)域可能與蛋白質(zhì)交互作用有關(guān)[37]，缺失RRM對其與DAZAPs(deleted in Azoospermia(Daz)-Associated Protein1)的結(jié)合影響不大，而DAZ結(jié)構(gòu)域的缺失則大大減少了其結(jié)合[38]。研究表明，Daz和Dazl主要通過DAZ結(jié)構(gòu)域與DAZAP1/DAZAP2結(jié)合[39]。DAZAP1 是與Daz相互作用的反式作用因子，對mRNA的降解和沉默起關(guān)鍵作用，DAZAP1的磷酸化能破壞其與生殖細胞特異性蛋白Daz的相互作用[40]。

之前研究確定了小鼠中Dazl有兩個剪接型(Dazl_Δ8和Dazl_FL)，在成年小鼠精卵巢和多能細胞中表達。我們發(fā)現(xiàn)，Dazl8號外顯子的選擇性剪接導致缺失17個氨基酸，而其余蛋白結(jié)構(gòu)相對于Dazl_FL是完整的[41]。亞細胞定位研究顯示Dazl_Δ8類似于Dazl_FL蛋白質(zhì)的定位模式。與生殖細胞的翻譯刺激功能相比，Dazl亞型(Dazl_FL和Dazl_Δ8)功能分析證實了Dazl亞型均可在胚胎干細胞中具有翻譯抑制作用。Dazl同源基因里類似的mRNA的可變剪接只發(fā)現(xiàn)于牙鲆[42]，缺失的8號外顯子并不位于重要的RRM結(jié)構(gòu)域，對Dazl功能影響不大，基本的RNA識別功能仍然保留，DazlⅠ和DazlⅡ表達模式相似，且從Dazl靶mRNA預(yù)測兩種蛋白的功能發(fā)現(xiàn)沒有僅受一種Dazl蛋白調(diào)控的mRNA，表明這兩種蛋白沒有明顯的功能差異。而Boule還未發(fā)現(xiàn)有可變剪接的存在。在本研究中許氏平鲉Dazl和Boule均存在兩種可變剪接，從氨基酸序列完整性看BouleⅠ，BouleⅡ以及DazlⅠ，DazlⅡ很可能都有其對應(yīng)的蛋白產(chǎn)物。此外，可變剪接均存在于重要的結(jié)構(gòu)域之外，對Dazl和Boule基本功能可能影響不大。但是可變剪接存在的意義可能在于出現(xiàn)新的功能。由于其基因序列不同，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化相應(yīng)功能也會有所改變，新剪接型的蛋白產(chǎn)物或許即可保留原基因應(yīng)行使的大部分功能，又發(fā)展出不同于基因完整型的新功能，需要進一步研究證實[43-44]。

多重氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹顯示，硬骨魚Dazl和Boule與其它脊椎動物有較大區(qū)別。RRM中數(shù)個氨基酸的改變及Dazl后端氨基酸序列數(shù)目可將硬骨魚和其它高等脊椎動物區(qū)分開。許氏平鲉的Dazl和Boule分別與其它硬骨魚同源基因聚類為一支，說明了許氏平鲉的Dazl和Boule在進化上相對保守，也反映了不同物種Dazl和Boule在的兩性配子發(fā)生過程中及生殖發(fā)育調(diào)控機制具有重要的作用[45-46]。

Dazl和Boule基因的表達模式存在明顯差異。在大多數(shù)已報道的哺乳動物中，Dazl基因只在兩性生殖細胞中特異表達[47]。青鳉中Dazl在胚胎發(fā)生過程中始終存在，而在成魚組織中，DazlmRNA及其蛋白的表達僅位于精巢和卵巢的生殖細胞中[25]。在精巢中，DazlmRNA在減數(shù)分裂前期較低，在減數(shù)分裂期較豐富，但在減數(shù)分裂后期缺失，在卵巢中，DazlmRNA在整個卵子發(fā)生過程中持續(xù)存在。大西洋鮭魚Dazl在性腺中被檢測到，在卵母細胞和隨后的胚胎發(fā)育也檢測到[48]。牙鲆Dazl同樣特異性的表達于精卵巢，且在胚胎發(fā)育的各時期也有檢測到其表達[18]，此外斑馬魚[32]、羅非魚[20]、虹鱒[21]等硬骨魚類Dazl均在兩性生殖細胞中特異表達。在迄今為止所研究的各種生物中，Boule表現(xiàn)出明顯的變異表達模式。哺乳動物[46]及果蠅[49]的Boule僅在雄性生殖細胞中表達，而秀麗線蟲[44]僅在雌性中表達。對于硬骨魚類中的研究顯示，羅非魚Boule基因表現(xiàn)出雙性生殖系特異性表達，并且在兩性配子發(fā)生時表現(xiàn)出階段特異性的表達。虹鱒的Boule在雌雄性腺中均有表達且在精巢中表達量高，卵巢中表達量低[36]，在配子發(fā)生過程中Boule在雄性配子形成中出現(xiàn)在有絲分裂和減數(shù)分裂，而在雌性中表現(xiàn)出減數(shù)分裂特異性[21]。青鳉中Boule在兩性生殖細胞中都有表達，而精子形成的表達模式與Dazl不同，在精子形成的減數(shù)分裂前期和減數(shù)分裂期均有表達，在卵子發(fā)生過程中與Dazl表達模式相似。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析得到許氏平鲉成魚各組織及不同胚胎時期生殖基因Boule和Dazl的mRNA表達模式。我們發(fā)現(xiàn)，許氏平鲉的這兩個基因都在兩性性腺中特異性表達，其中Boule在精巢表達水平明顯高于卵巢而Dazl在卵巢表達明顯高于精巢。兩者只在不同發(fā)育階段卵子表達，而在胚胎發(fā)育時期表達量幾乎檢測不到。通過對不同生物的研究，證實了DAZ家族基因在性腺發(fā)育不同階段的表達模式與其保守的特異性作用，而這種表達模式依賴于性腺和配子發(fā)生的階段。本研究結(jié)果為許氏平鲉生殖和發(fā)育研究提供了重要的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

在本研究中，我們主要進行了許氏平鲉DAZ基因家族的成員鑒定及轉(zhuǎn)錄組表達分析。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)許氏平鲉DAZ基因家族包含兩個成員：Dazl和Boule，分別有兩個轉(zhuǎn)錄本。通過多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，得到Dazl和Boule含有兩個與其他硬骨魚高度保守的功能結(jié)構(gòu)域——DAZ結(jié)構(gòu)域和RRM結(jié)構(gòu)域。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，Dazl和Boule在許氏平鲉各組織中的表達模式相似，只在性腺中表達且存在性別二態(tài)現(xiàn)象。不同卵子發(fā)育階段和胚胎期的表達分析表明，Dazl和Boule主要在配子發(fā)生期起作用。推測許氏平鲉Dazl和Boule影響生殖細胞的發(fā)育分化，是配子發(fā)生不可缺少的調(diào)控因子，為進一步研究Dazl和Boule在許氏平鲉性別分化和性腺發(fā)育中的作用提供參考。