趙策朗 杜志文 鄭 爽 張晨宇 秦秀麗

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院 吉林·吉林 132101）

蛹蟲草是著名的食藥用菌，其菌體內蛋白質含量豐富，氨基酸種類齊全，含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、甘露醇、SOD、微量元素及維生素等多種生物活性物質，具有顯著提高免疫力、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、補肺益腎、補虛損、益精氣的作用[1-2]，以良好醫(yī)療保健等功效深受人們青睞，廣泛用于食品、醫(yī)藥、保健等領域。

開菲爾是由乳酸菌與酵母菌等多種有益微生物形成的顆粒狀結構的共生體，能夠將牛奶中的乳糖經(jīng)發(fā)酵獲得乳酸、檸檬酸、少量的乙醇和CO2等多種代謝產(chǎn)物，同時獲得細膩柔軟的凝乳，形成獨特開菲爾風味的乳酸飲料[3]，比普通發(fā)酵乳具有更豐富營養(yǎng)，并且具有降血壓、降膽固醇、提高免疫力、緩解乳糖不耐癥等功能[4-5]，因此開菲爾又被稱為“健康飲品”。目前發(fā)酵乳制品多以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑，以開菲爾為發(fā)酵劑生產(chǎn)的發(fā)酵乳制品在市場上還是鳳毛麟角，開發(fā)開菲爾發(fā)酵乳飲料在我國具有廣闊的市場前景。

目前開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳飲料還沒有相關報道，本試驗對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳飲料工藝條件進行研究，為開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳保健飲料的生產(chǎn)及開發(fā)提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：蛹蟲草試管菌種（由我校生物與制藥工程學院微生物實驗室提供）。

開菲爾：開菲爾粒從陜西的西安，宏圣堂健康產(chǎn)品有限公司購買。原料乳：蒙牛純牛奶（全脂滅菌乳）。

其它原料：葡萄糖、瓊脂粉、KH2PO4、MgSO4、蔗糖酯、白砂糖、果膠、檸檬酸鈉為市售及化學純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛹蟲草菌種的活化：配制PDA加富斜面試管培養(yǎng)基，在無菌條件下，將蛹蟲草菌種轉接到培養(yǎng)基上，24℃條件下培養(yǎng)7d，選擇菌絲萌發(fā)較快，菌絲長勢旺盛，濃密無污染的試管菌種備用。

1.2.2 蛹蟲草菌絲體的制備：配制蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為馬鈴薯200g（煮沸后過濾取汁），葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸粉10g，MgSO41.5g，KH2PO41.5g，pH值6.0，水1000mL。裝入500mL三角瓶，裝量為300mL，在120℃下滅菌30min，在無菌條件下接入蛹蟲草斜面試管菌種后，放入24℃、轉速為120r/min電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，然后將菌絲體過濾出來，再用無菌水沖洗數(shù)次，放入容器打碎成糊狀備用。

1.2.3 開菲爾發(fā)酵劑的活化：將冷藏的開菲爾粒取出，以純牛奶為培養(yǎng)液，在純牛奶中加入5%蔗糖，以1∶10（開菲爾∶牛奶，g/mL）比例混合，然后在28℃下培養(yǎng)24h，按上述操作連續(xù)多次培養(yǎng)活化，直到形成新顆粒為止[6]。

1.2.4 開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳的工藝流程：原料乳預熱60℃→混合（加入蛹蟲草菌絲、白砂糖、蔗糖酯）→均質（65℃、20Mpa）→殺菌（95℃、5min）→冷卻（28℃左右）→接種（開菲爾發(fā)酵劑）→發(fā)酵(溫度、時間)→冷卻→無菌灌裝→成品→感官評價及質量檢測。

1.2.5 開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳的單因素試驗

（1）制作發(fā)酵乳制品，要加入適量的穩(wěn)定劑，使乳酸凝固物穩(wěn)定，改變產(chǎn)品的硬度和黏度。本試驗以蔗糖酯為穩(wěn)定劑，在原料乳中加入5%的白砂糖和15%的蛹蟲草菌絲體，再分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的蔗糖酯，按照上述工藝流程進行操作，接入8%的開菲爾發(fā)酵劑，在30℃下培養(yǎng)24h，以沉淀率為指標，確定開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳中蔗糖酯適宜的添加量。

（2）在原料乳中加入5%白砂糖和0.6%蔗糖酯，再分別添加5%、10%、15%、20%、25%的蛹蟲草菌絲體，按照上述工藝流程進行操作，開菲爾發(fā)酵劑接種量、培養(yǎng)溫度、時間與（1）相同，以感官評分和酸度為指標，確定開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳中蛹蟲草菌絲體適宜的添加量。

（3）在原料乳中加入15%的蛹蟲草菌絲體和0.6%蔗糖酯，再分別添加2%、4%、6%、8%、10%的白砂糖，按照上述工藝流程操作。開菲爾發(fā)酵劑接種量、培養(yǎng)溫度、時間與（1）相同，以感官評分和酸度為指標，確定開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳中白砂糖適宜添加量。

（4）在原料乳中加入15%蛹蟲草菌絲體、6%白砂糖、0.6%蔗糖酯，按照上述工藝流程操作，分別接入2%、4%、6%、8%、10%開菲爾發(fā)酵劑，培養(yǎng)溫度、時間與（1）相同，以感官評分和酸度為指標，確定開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳中開菲爾發(fā)酵劑適宜接種量。

（5）在原料乳中加入15%蛹蟲草菌絲體、6%白砂糖、0.6%蔗糖酯，按照上述工藝流程進行操作，開菲爾發(fā)酵劑接種量、培養(yǎng)時間與（1）相同，分別在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃下培養(yǎng)，以感官評分和酸度為指標，確定開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳最適的發(fā)酵溫度。

（6）在原料乳中加入15%蛹蟲草菌絲體、6%白砂糖、0.6%蔗糖酯，按照上述工藝流程進行操作，開菲爾發(fā)酵劑接種量、培養(yǎng)溫度與（1）相同，分別培養(yǎng)12h、16h、20h、24h、28h，以感官評分和酸度為指標，確定開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳最適的發(fā)酵時間。

1.2.6 開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳正交試驗：在單因素試驗基礎上，以開菲爾接種量、蔗糖添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為試驗因素，設計L9（34）正交試驗，確定開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳飲料最佳工藝條件。

1.2.7 沉淀率和酸度的測定方法：沉淀率的測定方法參考文獻[7]；酸度的測定方法參考文獻[8]，采用吉爾涅爾度（°T）。

1.2.8 感官評分標準：開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳的感官評定參照GB19302-2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》[9]，選8名具有食品感官評分經(jīng)驗的員按表1進行打分，取平均值，確定最佳因素水平。

表1 開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳飲料感官評分標準Table1 sensory scoring standard of kefir Cordyceps militaris fermented milk beverage

1.2.9 微生物學檢驗：按照GB 19302-2010發(fā)酵乳食品安全國家標準進行微生物學檢測[9]。

2 結果與分析

2.1 蔗糖酯添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響

沉淀率越小，說明發(fā)酵乳的穩(wěn)定性越高。由圖1可知，不同濃度的蔗糖酯添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳穩(wěn)定性是不同的。

圖1 蔗糖酯添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳穩(wěn)定性的影響figure1 effect of sucrose ester on the stability of kefir Cordyceps militaris fermented milk

隨著蔗糖酯添加量的增加，沉淀率呈現(xiàn)先降后升的趨勢，當蔗糖酯添加量為0.6%時達到最小，制得的發(fā)酵乳的組織狀態(tài)均勻細膩，凝集性較好。確定蔗糖酯添加量為0.6%時開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳穩(wěn)定性最佳。

2.2 蛹蟲草菌絲體添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響

由圖2可知，不同菌絲體添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質有一定的影響。隨著蛹蟲草菌絲體添加量的增加，感觀評分曲線開始逐漸上升，當添加量達到15%時感官評分最高，然后隨著添加量增加，感官評分曲線逐漸下降。從乳酸度的曲線可以看出，曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)的下降趨勢，表明菌絲體的添加量對乳酸度的影響不大，在制作開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳飲料選擇15%菌絲體添加量。

圖2 蛹蟲草菌絲體添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響figure2 effect of mycelium addition on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.3 白砂糖添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響

由圖3可知，白砂糖添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質有較大影響。隨著白砂糖添加量的增加，感官評分和乳酸度二條曲線都呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當添加量為4%時乳酸度最高，此時發(fā)酵乳的口感較酸，感官評分不高，當添加量達到6%時，乳酸度降低，但感官評分最高，發(fā)酵乳酸甜適中，口味最佳。當白砂糖添加量超過6%時，發(fā)酵乳的酸度和感官評分逐漸下降。

圖3 白砂糖添加量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響figure3 effect of white granulated sugar on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

分析其原因主要是當白砂糖添加量不足時，乳酸菌的產(chǎn)酸量低，粘度較差，當白砂糖添加量過大時，原料中的滲透壓增高，抑制乳酸菌的生長繁殖，使酸乳的粘度下降。因此在正交試驗中選擇4%、6%、8%為白砂糖添加量的三個水平。

2.4 開菲爾接種量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響

由圖4可知，開菲爾接種量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質有較大的影響。隨著開菲爾接種量的增加，乳酸度逐漸增加，當接種量為6%時，感官評分最高，當接種量超過6%后，乳酸度增加較快，口感酸味越來越重，感官評分也越來越低。分析其原因主要是隨著接種量的增加，開菲爾中乳球菌分解乳糖產(chǎn)乳酸量越來越多，當接種量達到6%時，發(fā)酵乳飲料酸甜適中，口感較好。當乳酸度較高時，造成凝乳中蛋白質脫水收縮嚴重，使乳清析出，出現(xiàn)分層，同時較多的接種量，會導致大量的酵母菌體早衰和自溶，產(chǎn)生發(fā)酵臭，從而影響開菲爾的風味[4]。因此在正交試驗選擇4%、6%、8%為開菲爾接種量的三個水平。

圖4 開菲爾接種量對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響figure4 effect of kefir inoculation amount on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.5 發(fā)酵溫度對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響

由圖5可知，發(fā)酵溫度對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質有較大的影響。隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵乳的感官評分先快速升高后略有下降。當發(fā)酵溫度為30℃時感官評分最高，當超過30℃時感官評分略有下降，但從感官評分曲線上看，當溫度為28℃和35℃時，與30℃時感官評分接近，變化不大。乳酸度曲線一直呈上升趨勢。分析其原因主要是發(fā)酵溫度低，乳酸菌的活力下降，凝乳能力降低，隨著溫度升高，乳球菌繁殖速度加快，代謝活性增強，乳糖分解產(chǎn)生大量的乳酸，使發(fā)酵乳的酸度不斷升高。當溫度為超過30℃時，感官評分達到最高。因此在正交試驗中選擇28℃、30℃、35℃為發(fā)酵溫度的三個水平。

圖5 溫度對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響figure5 effect of temperature on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.6 發(fā)酵時間對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響

由圖6可知，發(fā)酵時間對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質有較大的影響。隨著發(fā)酵時間的延長，乳球菌分解乳糖產(chǎn)生的乳酸量增加，乳酸度曲線逐漸升溫高，而感官評分曲線呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當發(fā)酵時間達到24h時感謝官評分最高，超過24h后，感官評分曲折線下降。分析其原因主要是由于發(fā)酵時間較長，乳酸度的過高，發(fā)酵乳的口感過酸。因此在正交試驗中選擇16h、20h、24h為發(fā)酵時間的三個水平。

圖6 發(fā)酵時間對開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳品質的影響figure6 effect of fermentation time on the quality of kefir Cordyceps militaris fermented milk

2.7 開菲爾蛹蟲草發(fā)酵乳正交試驗的結果及分析

在以上單因素試驗基礎上設計L9（34）正交試驗，試驗設計見表2，試驗結果見表3。通過對試驗結果的分析可知，最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即白砂糖的添加量為6%，開菲爾接種量為6%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間24h。正交試驗結果極差R值可知，開菲爾蛹蟲草發(fā)酵飲料品質影響主次因素為發(fā)酵溫度＞B發(fā)酵時間＞開菲爾接種量＞白砂糖添加量。

表2 L9（34）正交試驗設計Table2 L9（34)orthogonal experimental design

表3 L9（34）正交試驗結果Table3 L9（34）orthogonal test results

3 產(chǎn)品的質量標準

3.1 感官指標

本產(chǎn)品的色澤為乳白色，具有光澤，具有發(fā)酵乳的香味，無異味，酸甜適口，組織均勻細膩。

3.2 理化指標

總固形物≥12%，蛋白質≥1.3%，酸度為65～80°T。

3.3 微生物學指標

大腸菌群：無檢出；致病菌：無檢出。

4 結論

通過試驗確定開菲爾蛹蟲草保健飲料生產(chǎn)的最佳工藝參數(shù)為蛹蟲草菌絲體的添加量為15%，蔗糖酯添加量0.6%，白砂糖的添加量為6%，開菲爾接種量為6%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為24h；L9（34）正交試驗影響產(chǎn)品品質的主次因素為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞開菲爾接種量＞白砂糖添加量。本產(chǎn)品為乳白色或微黃色，組織細膩，酸甜適口，具有開菲爾發(fā)酵乳的獨特風味。