張瑋琦，脫 穎

免疫組化是病理診斷過程中的重要組成部分，是病理醫(yī)師作出準確診斷的重要基石與技術保障[1]。近年來，隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，免疫組化技術在幫助評估疾病的易感性及發(fā)病風險，協助制定個性化治療方案等方面發(fā)揮越來越重要的作用[2]。由于免疫組化技術步驟繁多，影響因素復雜，其結果容易受到各種因素的影響，因此設置合理的對照體系至關重要[3]。目前免疫組化對照的制作方法多種多樣，不同方法制作的對照各有優(yōu)缺點。本文分享一套實用的多組織對照體系，該對照體系制作簡單，涵蓋抗體范圍廣，經過本科室長時間驗證取得令人滿意的效果，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 構建多組織對照體系根據日常工作中各抗體的使用頻率，標本組織獲取的難易程度，結合自身工作經驗總結出各種蛋白在不同組織中的表達情況，并結合2015年國際特設專家委員會對免疫組化陽性對照標準的專家共識，設計出三種不同的多組織對照蠟塊構成一套對照體系。1號對照包括扁桃體、闌尾、胎盤、子宮肌瘤、肝臟、脾臟；2號對照包括闌尾、胃黏膜、結腸黏膜，胰腺、結腸腺癌；3號對照包括甲狀腺、肺、輸卵管、腎臟。該對照體系可以為我科超過180種常見抗體提供對照(表1)。結合2015年國際特設專家委員會推薦的18種病理診斷常用抗體對照組織及其染色結果判斷標準，選取代表性的抗體對該對照體系效果進行評估。

表1 三種對照內各組織所對應的抗體

1.2 材料組織標本來源于中山大學附屬第一醫(yī)院病理科臨床診斷結束后剩余的組織，所有組織均經10%中性緩沖福爾馬林固定24～48 h。

1.3 試劑與儀器CK一抗試劑購自福州邁新公司，CDX-2一抗試劑購自Dako公司，Pax-8一抗購自基因科技(上海)公司；二抗免疫組化試劑盒均購自羅氏公司；免疫組化染色采用羅氏Ventana BenchMark XT全自動免疫組化染色儀。

1.4 多組織蠟塊制作方法對收集到的組織進行預處理，其中胃與結腸只取黏膜并修成面積1.2 cm×1.2 cm的黏膜塊，肝臟、脾臟等實性組織修成大小1.2 cm×1.2 cm×0.3 cm的組織塊，闌尾與輸卵管組織橫切為高約0.3 cm圓柱體，所有組織于全自動脫水機中常規(guī)脫水浸蠟。將浸蠟完成的各組織塊用取材刀切成邊長2～3 mm的小組織塊，將切好的各小組織塊按照設計分組進行包埋，包埋時應選用較小的包埋模具以方便與待檢測組織貼在一張玻片上。包埋時注意將組織埋平，闌尾、輸卵管等管狀或半管狀組織以及胃腸黏膜需直立包埋(圖1)。

圖1 三種多組織對照蠟塊

1.5 多組織對照的制片與染色組織蠟塊3 μm厚切片，貼于黏附性載玻片上1/3處，將待測組織貼于同一黏附性玻片對照的下方(圖2)，玻片放入68 ℃恒溫烤箱中烤1 h，在全自動免疫組化染色儀上染色。切完片后剩余的多組織對照蠟塊可以放入-20 ℃冰箱長期保存。

圖2 三種多組織對照與待測組織貼于同一玻片：A.1號對照與待測組織；B.2號對照與待測組織；C.3號對照與待測組織

2 結果

在1號對照中，CKpan在幾乎所有的闌尾柱狀上皮細胞、扁桃體鱗狀上皮細胞、胎盤滋養(yǎng)層上皮細胞中呈中～強陽性胞質染色；在絕大部分肝細胞中呈中～強陽性胞質染色并伴膜深染；在脾臟、子宮肌瘤中呈陰性(圖3)。在2號對照中，CDX-2在幾乎所有闌尾上皮細胞、結腸上皮細胞、結腸癌細胞中呈強陽性胞核染色；在大部分胰腺閏管上皮細胞中呈弱～中度陽性胞核染色；在胃上皮細胞中呈胞核陰性染色(圖4)。在3號對照中，Pax-8在幾乎所有的甲狀腺濾泡上皮細胞/輸卵管非纖毛黏液細胞中呈強陽性胞核染色；在腎小管上皮細胞中呈中至強陽性胞核染色；在肺中呈陰性(圖5)。

圖3 A.CKpan在1號對照中的表達情況；B.CKpan在扁桃體鱗狀上皮細胞種呈中至強陽性胞質染色，羅氏Ventana BenchMark XT全自動免疫組化 圖4 A.CDX-2在2號對照中的表達情況；B.CDX-2在闌尾上皮細胞中呈強陽性胞核染色，羅氏Ventana BenchMark XT全自動免疫組化 圖5 A.Pax-8在3號對照中的表達情況；B.Pax-8在幾乎所有輸卵管非纖毛黏液細胞中呈強陽性胞核染色，羅氏Ventana BenchMark XT全自動免疫組化

3 討論

在免疫組化操作流程中，對照的合理使用是其結果準確、穩(wěn)定、可信的重要保證，因此一套全面、合理且實用的對照體系在免疫組化日常工作中至關重要。

目前免疫組化對照的制作方法多種多樣，每種對照都有其特點，也同時存在一些局限[4]。在常見的各種對照形式中，單組織對照需要為每種抗體單獨設立對照，費時費力；組織芯片陽性對照制作流程復雜，成本較高；多組織羊膜卷蠟塊對照對操作要求高，且其中部分組織收集困難；碎片懸液陽性對照可以為某些腫瘤中高表達的蛋白抗體提供對照，但對于非腫瘤疾病的診斷存在一定局限。

本科室構建的這套多組織蠟塊對照體系具有以下優(yōu)點：(1)涵蓋抗體范圍廣，三種多組織對照蠟塊可以為我科開展的超過180種常見抗體提供穩(wěn)定對照，節(jié)省人力與蠟塊存放空間；(2)每一種多組織蠟塊可以為同一抗體提供多種強度的陽性對照及多種陰性對照，使檢測結果更準確、更穩(wěn)定；(3)所選組織大多為常見的正常組織，較易獲取與制作；(4)每種多組織蠟塊中含4～6種組織，組織數量合適，較易包埋與制片，且制片大小適中，可以與待測組織貼于一張玻片上共同檢測。鑒于以上優(yōu)點，推薦臨床工作中推廣使用。