劉 悅， 字學(xué)娟*, 陳 婷， 孫 蓉， 李 茂， 湯 凱

(1. 海南大學(xué)林學(xué)院， 海南 儋州 571737; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 海南 儋州 571737； 3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江試驗站， 海南 湛江 524000； 4.海南大學(xué)食品學(xué)院， 海南 海口 570228)

微生物活動是青貯發(fā)酵的本質(zhì)，原料表面附著微生物多樣性、菌種的生理生化特性以及外界環(huán)境等因素均能影響青貯發(fā)酵品質(zhì)[1]。因此，調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)是保證青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要舉措之一。一般來說，乳酸菌作為優(yōu)勢菌群的青貯發(fā)酵容易成功，通過產(chǎn)生乳酸和一些抗真菌代謝產(chǎn)物，可起到改善青貯飼料品質(zhì)的作用[2]。

當(dāng)前，研究人員發(fā)現(xiàn)通過篩選并添加不同種類的乳酸菌來可提高青貯成功率[3]，韋慶旭等[4](陜西)從構(gòu)樹青貯飼料、玉米青貯飼料中分離出植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)4種可飼用菌種；張玉琳等[5](新疆)從雜交構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)青貯飼料中最終分離得到植物乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、糞腸球菌和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，此外，李榮榮等[6](北京)從紫花苜蓿自然青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌，能夠有效促進乳酸發(fā)酵、抑制梭菌生長、顯著改善高水分苜蓿青貯品質(zhì)。Peng等[7](貴州)收獲包括紫羅蘭、高粱、玉米等12種青貯原料進行青貯，篩選得到的優(yōu)勢菌株布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)添加到青貯飼料中有效地改善了溫暖潮濕氣候區(qū)紫花苜蓿青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量；Wang等[8]從青藏高原普通野豌豆、高羊茅和多年生黑麥草中分離得到的植物乳桿菌和商業(yè)植物乳桿菌MTD—1對比，發(fā)現(xiàn)在10℃和15℃的低溫環(huán)境下，3種菌均可不同程度的改善意大利黑麥草青貯發(fā)酵品質(zhì)。此外，Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)與商用植物乳桿菌菌株相比，篩選得到的菌株戊糖片球菌在20℃下對改善柱花草青貯品質(zhì)最為有效。因此，不同區(qū)域不同飼草附著乳酸菌種類和特性差異較大，從不同來源分離鑒定和篩選本土優(yōu)良乳酸菌菌株具有重要意義。

在全球變暖的背景下，日均最高氣溫≥40℃的天數(shù)也在增加。高溫是熱帶地區(qū)影響青貯品質(zhì)的重要環(huán)境因素，高溫會增加青貯飼料pH值和干物質(zhì)損失，降低其乳酸含量和有氧穩(wěn)定性，極大的影響飼用價值[10]。乳酸菌特性在熱帶和溫帶有明顯差異[10]，商品化乳酸菌制劑不能很好地適應(yīng)熱帶的氣候，發(fā)揮預(yù)期效果[11]。海南島為熱帶季風(fēng)氣候，夏季長達6個月(月平均溫度≥30℃)且無冬季，而天然飼草青貯飼料中乳酸菌的分離及鑒定鮮有報道，因此，本研究以分布廣泛、可用作飼草為標(biāo)準(zhǔn)選取海南島的野生草本植物斑茅(Saccharumarundinaceum)、蔓生莠竹(Microstegiumvagans)和木本植物銀合歡(Leucaenaleucocephala)、構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)為材料，并在5個氣候區(qū)東部濕熱區(qū)、西部干旱區(qū)、南部暖潮濕區(qū)、北部半濕熱區(qū)、中部山地潮濕區(qū)采樣對比，篩選高溫條件下適合熱帶牧草的優(yōu)良乳酸菌菌株，旨在豐富對我國熱帶地區(qū)乳酸菌菌群多樣性認(rèn)知和促進熱帶飼草青貯添加劑的研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑及儀器

供青貯的原料為從?？?110°11′E，19°54′N，年均溫24.1℃，年均降水量1 788 mm，海拔160 m)、瓊中(109°34′E，19°1′N，年均溫22.4℃，年均降水量2 350 mm，海拔560 m)、萬寧(110°25′E，18°54′N，年均溫23.9℃，年均降水量2 420 mm，海拔30 m)、三亞(109°34′ E，18°19′ N，年均溫26.9℃，年均降水量1 716 mm，海拔40 m)、昌江(108°58′ E，19°19′ N，年均溫24.6℃，年均降水量1 680 mm，海拔90 m)、儋州(109°30′ E，19°30′ N，年均溫23.8℃，年均降水量1 870 mm，海拔160 m)野外采集的草本植物斑茅、蔓生莠竹和木本植物銀合歡、構(gòu)樹。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Es-cherichiacoli)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)來自海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實驗室。

De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)瓊脂培養(yǎng)基、De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)肉湯培養(yǎng)基：購自杭州百思生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管：購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1青貯制備 將采集得到的飼草切碎至2～3 cm，自然晾曬24 h后裝入聚乙烯青貯袋中，每袋200 g，每個處理重復(fù)3次。用抽真空包裝機抽真空后密封，于室內(nèi)35℃～40℃環(huán)境下儲存發(fā)酵60 d。

1.2.2菌體分離及菌種純化 將青貯樣品按草：水=1:10比例浸泡在錐形瓶中，然后進行梯度稀釋，選取3個適宜梯度，各吸100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基(含1.5% CaCO3)上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱下厭氧培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)[12]等，挑取溶鈣圈明顯且較大的單菌落，于MRS固體培養(yǎng)基劃線3～4次，保存于—80℃超低溫冰箱，同時進行革蘭氏染色、過氧化氫酶檢驗。

1.2.3優(yōu)勢菌MRS液體培養(yǎng)基初篩 將純化后的乳酸菌菌液濃度調(diào)至108cfu·mL-1搖勻接100 uL至裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8，16，36 h后測定發(fā)酵液的pH值。測600 nm處OD(Optical density,吸光度)值，選取pH≤4且OD≥2[13]的菌株為初篩代表菌株。

1.2.4高溫條件下MRS液體培養(yǎng)基優(yōu)勢菌復(fù)篩及耐酸能力測定 按初篩同樣的方法接100 ul至裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管，分別置于40，45，50℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測發(fā)酵液600 nm處OD值。同上述方法再將乳酸菌接入pH為3.0，3.5，4.0，6.0，8.0，9.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，測發(fā)酵液600 nm處OD值。

1.2.5測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 篩選所得優(yōu)勢菌株進行16S rDNA測序(華大基因)，在NCBI數(shù)據(jù)庫搜索并選擇序列同源性較高菌株16S rRNA基因序列，采用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法為鄰接法(Neighbor-joining，NJ)[14]。

1.2.6生理生化試驗 采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，嚴(yán)格按照說明書操作，接菌方法為從MRS平板挑取單菌落到生化管，封口，放置于恒溫培養(yǎng)箱[15]。

1.2.7乳酸菌的生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定 將復(fù)篩后選出的優(yōu)良乳酸菌稀釋定菌數(shù)(按上述方法)并接種置于37℃恒溫培養(yǎng)，在0—24 h每隔2 h取出1批樣品于600 nm處分別測定MRS培養(yǎng)基的OD值，同時用pH測定儀測定MRS培養(yǎng)基的pH值[16]，分別用來表征乳酸菌的生長速率和產(chǎn)酸速率。

1.2.8抑菌能力的測定 將指示菌株的活化劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h。調(diào)整菌體濃度為1×107cfu·mL-1作為指示菌懸液；以1%(V∶V)的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)12 h，10 000 r·min-1離心2 min后取上清液，4℃保存作為上清液備用；利用牛津杯法測定抑菌性能，首先傾注15 mL將2%營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(滅菌)于培養(yǎng)皿，待水平靜置凝固后，打入100 μL指示菌菌液，涂布均勻后備用，均勻放置牛津杯垂直于培養(yǎng)基表面，在其中加入乳酸菌上清液100 μL，4℃擴散2 h后再37℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑大小來判斷結(jié)果[17]。

1.2.9數(shù)據(jù)分析 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用Excel 2019處理，用Oringin 2018軟件作圖，用MEGA 7繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從青貯樣品中分離得到127株乳酸菌，98株菌株革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫觸酶試驗均為陰性，初步鑒定為乳酸菌。

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸能力和生長能力初篩

就產(chǎn)酸能力而言，發(fā)酵36 h后，98株菌株中，pH≤4的有39株，占比為39.8%，其中，產(chǎn)酸能力最強的1株菌pH為3.91，以上菌株在8 h和16 h時也表現(xiàn)較好，8 h時39株中有一半以上pH≤5，而16 h時pH又進一步下降，39株中有95%左右pH≤4.5；此外，發(fā)酵36 h時，4

在生長能力方面，30.77%的菌株8 h時OD≥2，所有菌株均OD≥0.5；發(fā)酵36 h時，pH≤4的菌株同時滿足OD≥2。以36 h的pH≤4且OD≥2為條件，篩選得到39株優(yōu)勢菌，同時以8 h和16 h的結(jié)果為參考，發(fā)現(xiàn)所選菌株均滿足生命力強且產(chǎn)酸能力強的要求。

2.3 乳酸菌的耐高溫能力和耐酸能力復(fù)篩

對初篩優(yōu)勢菌39株進行耐高溫能力和耐酸能力復(fù)篩，以T=50℃條件下的生長情況為依據(jù)，以T=40℃和T=45℃時的OD值為參考，選出OD值最大的15株為復(fù)篩優(yōu)勢菌，去掉測序結(jié)果中重復(fù)的菌種，最終得到4株優(yōu)勢菌，并對其進行耐酸能力的實驗。隨著溫度的上升，所有菌株的OD值都呈現(xiàn)下降的趨勢，在T=50℃時，菌株10D，13C，15B的OD值為1.72，菌株14B的OD值為1.77；以pH=6為界，pH值越小則越抑制乳酸菌的生長，這種抑制作用在pH=3時最為明顯，僅14B的OD≥0.5，10D，13C，15B的OD分別為0.39，0.38，0.4。(表1)。

2.4 優(yōu)良乳酸菌的生理生化、16S rDNA序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹、生長速率及產(chǎn)酸速率和抑菌效果

從表2中可以看出，所選菌株能利用廣泛的糖源，但利用種類和能力有差別。所有的菌株七葉苷和苦杏仁苷生化管反應(yīng)都呈陽性，七葉苷水解試驗陽性說明該乳酸菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素；苦杏仁苷陽性則說明該該乳酸菌含β-葡萄糖苷酶可催化苦杏仁苷水解為兩分子葡萄糖和1分子杏仁腈；另外，所有的菌株都能利用纖維二糖、葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蕈糖、蔗糖、鼠李糖、木糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖，但利用能力不一，其中，15B對乳糖的利用能力較弱；14B對蜜二糖的利用能力較弱；13C，14B，15B對甘露醇的利用能力較弱；14B，15B則對L-阿拉伯糖的利用能力較弱；10D，15B對木糖和屬李糖的利用能力較弱；10D，13C，14B對半乳糖的利用能力較弱；然而，所有的菌株都不能利用山梨醇、淀粉且硝酸鹽反應(yīng)呈陰性，說明所選菌株不含硝酸還原酶和淀粉水解酶；10D不能利用棉子糖、甘露醇。

表1 4株優(yōu)勢菌株耐受性實驗結(jié)果Table 1 Tolerance of four representative strains to acid and high temperature

表2 4株優(yōu)勢菌株生理生化實驗結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of four representative strains

將代表菌株進行16S rDNA測序后，將序列結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫對相似性進行比對，結(jié)果見表3。菌株10D和植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarumstrain Heal19)同源性最高，菌株13C和植物乳桿菌(LactobacillusplantarumSN13T)同源性最高，菌株14B和植物乳桿(Lactiplantibacillusplantarumstrain 202195) 同源性最高，菌株15B和乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticistrain CACC 537)同源性最高，所有菌種的同源性和標(biāo)準(zhǔn)菌株序列覆蓋率均達到100%，E值都為0。E值代表在隨機狀態(tài)時，目標(biāo)序列與其他序列的相似度大于本條序列的可能性。表中所列E值均為0，說明比對結(jié)果可靠。

表3 4株優(yōu)勢菌株的16S rDNA序列同源性比對結(jié)果Table 3 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from four typical isolates

表4可知，4株代表菌株抑菌效果均較明顯，表現(xiàn)在其對所有致病菌抑菌圈的直徑均大于10 mm。其中10D和13C對大腸桿菌的抑制作用更強；13C對金黃色葡萄球菌的抑制效果更好；10D對沙門氏菌的抑制作用較好；菌株10D，14B和15B對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑大小較為接近且數(shù)值較高，說明對該致病菌有更強的抑制能力。

表4 4株優(yōu)勢菌株的抑菌能力Table 4 Antibacterial activity of four representative strains

圖1所示，4株優(yōu)勢菌株呈現(xiàn)出相似的生長情況，0～2 h菌株生長緩慢，處于遲滯期；2 h后迅速生長繁殖，進入對數(shù)生長期；到10 h后，生長速率減緩；22 h后趨于穩(wěn)定，基本不再生長，曲線趨向“S”型。在對數(shù)期，相比其他菌種，菌株13C長勢較快，菌株15B在2～4 h相對平緩；在穩(wěn)定期，菌株13C生長情況最好，其余菌株長勢相似。

圖1 在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的4株乳酸菌于600 nm 處的光密度值Fig.1 The optical density values at 600 nm of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

圖2所示，菌株10D培養(yǎng)2～12 h產(chǎn)酸速率較快，12～24 h產(chǎn)酸效率減??；菌株13C和14B在2～6 h時pH迅速下降，在6～24 h時pH有所下降但幅度變小；菌株15B在2～8 h時產(chǎn)酸速率較快，8～22 h產(chǎn)酸效率減小，22 h時趨于穩(wěn)定期，pH值基本保持不變。在產(chǎn)酸速率上，菌株13C較其他菌株更快；在產(chǎn)酸能力上，菌株10D最強。

圖2 4株乳酸菌于MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 pH值變化Fig.2 The pH values of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

由圖3可知，菌株10D，13C，14B與植物乳桿菌(GenBank登錄號：MT229370.1)和植物乳桿菌HBUAS52250(GenBank登錄號MH472975.1)聚于一枝，親緣關(guān)系最近，故將這3株菌株鑒定為植物乳桿菌。由圖4可知，菌株15B與乳酸片球菌(GenBank登錄號MW425291.1)聚于一枝，親緣關(guān)系最近，因此，將其鑒定為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。

圖3 利用16S rDNA序列對植物乳桿菌進行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree for Lactobacillus plantarum based on their 16S rDNA sequences

圖4 利用16S rDNA序列對乳酸片球菌進行構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for Pediococcus acidilactici based on its16S rDNA sequence

3 討論

青貯發(fā)酵的微觀層面是由飼草表面附著微生物的活動所主導(dǎo)的[18]，其中，乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)等在青貯飼料發(fā)酵中起關(guān)鍵作用[19]。乳酸菌的迅速繁殖會使得發(fā)酵體系中的pH值迅速下降，抑制大部分好氧細(xì)菌、大腸桿菌和霉菌等不利于青貯發(fā)酵的微生物繁殖[20]，使得發(fā)酵品質(zhì)更佳。因此，從青貯飼料中篩選優(yōu)良乳酸菌對改善青貯發(fā)酵品質(zhì)具有重要意義。

本研究以不同氣候區(qū)以及草本、木本飼草為微生物富集材料，為分離純化更豐富的菌株提供了基礎(chǔ)。有學(xué)者總結(jié)，在青貯中若要作為添加劑使用，乳酸菌需具備兩個條件1)耐酸能力強，活性高，生長迅速；同時大量產(chǎn)酸，迅速使得pH≤4，其它微生物的生長因此而受到抑制；2)除了乳糖外，可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖等，最好可以發(fā)酵戊糖[21]。從初篩結(jié)果和生理生化實驗結(jié)果來看，大部分乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)液的pH≥4，這表明這些菌株的產(chǎn)酸能力較低，自然青貯難以取得良好效果，而優(yōu)勢菌10D，13C，14B和15B 在2 h即進入對數(shù)生長期，在36 h時pH降至4.0以下，且均可發(fā)酵多種糖源，因此，所選優(yōu)勢菌株都有潛力作為乳酸菌添加劑來改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。篩選到的優(yōu)勢菌10D，13C，14B和15B比付浩等[22]從玉米青貯飼料中篩選得到的短乳桿菌和戊糖片球菌(12～20 h為對數(shù)生長期)生長更快，但其優(yōu)勢菌株36 h左右pH達到3.6，最終的產(chǎn)酸能力較本實驗所篩的優(yōu)勢菌稍強。

此外，青貯微生物受溫度影響比較大，熱帶的高溫環(huán)境會影響細(xì)菌細(xì)胞酶的活性，從而影響其生長代謝。而生活在這種環(huán)境中的菌株，會改變生理生化特性以達到適應(yīng)環(huán)境的目的，形成特定的氣候生態(tài)型。本研究旨在分離純化出適應(yīng)熱帶氣候的優(yōu)勢乳酸菌，使本土優(yōu)良菌種種質(zhì)資源得以合理利用。因此在復(fù)篩時采用T=50℃下的生長情況較好(OD值高)為篩選原則，得到了4株耐高溫同時耐酸能力良好的優(yōu)勢菌株，此前，研究人員從貴州省[7]青貯飼料中篩選得到的布氏乳桿菌(L.buchneri)和西南高溫高濕地區(qū)[10]青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)在pH=3.5和T=45℃的條件下均可生長，對高溫和酸性環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。從蘭州市[23]玉米秸稈和白菜尾菜混貯料中分離純化得到的12株乳酸菌可以在pH=4.5和T=45℃條件下生長。而本實驗分離純化得到的乳酸菌對高溫脅迫的耐受性更強，能在50℃的環(huán)境下生長繁殖。

對微生物的16S rDNA序列進行分析可以達到初步分類鑒定的目的，基于其構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可以確定菌種在進化中的位置。一般認(rèn)為，在種分類水平上，2個分類單位間16S rDNA序列同源性高于97.5%則屬于同一個種。經(jīng)16S rDNA測序，結(jié)合糖發(fā)酵結(jié)果，10D，13C，14B為植物乳桿菌，15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。其中，植物乳桿菌被發(fā)現(xiàn)可以從多種飼草中篩選得到，新鮮仙人掌植物和青貯飼料中最常見的乳酸菌是植物乳桿菌(65%)[24]；Li等[25]從玉米秸稈青貯飼料中分離出的植物乳桿菌ZZU 203和204具有抗菌活性，可用作青貯添加劑，以抑制青貯過程中不良微生物的增殖并保存青貯飼料的營養(yǎng)；袁潔等[26]從自然青貯多花黑麥草中篩選出的優(yōu)質(zhì)菌株中80%為植物乳桿菌。乳酸菌可以通過產(chǎn)生大量的有機酸、過氧化氫等物質(zhì)來抑制致病菌的生長，是否具有抑菌作用和抑菌作用的強弱是評價乳酸菌的重要內(nèi)容。結(jié)果顯示4株菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑均大于10 mm，具有很強的抑制作用，說明從青貯飼料分離的這4株乳酸菌對常見病原菌具有抑制作用。

4 結(jié)論

本研究從海南島不同地區(qū)不同植物樣本中共分離到98株乳酸菌，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，得到4株優(yōu)勢菌株并進行16S rDNA測序。經(jīng)鑒定，10D，13C，14B為植物乳桿菌，15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)，4株代表菌株中，菌株13C長勢較好且產(chǎn)酸速率較快，菌株10D產(chǎn)酸能力較強。耐受性試驗中，菌株14B在pH=3.0環(huán)境下生長較好，耐酸能力較好；所有菌株在50℃環(huán)境下生長良好，耐高溫能力強，在抑菌試驗中，所選優(yōu)勢菌株均可有效抑制致病菌的生長，其中，菌株10D可以有效的抑制大腸桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，菌株13C則對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用。