周 澤， 姚 拓， 史潭梅, 付衛(wèi)剛， 賀善睦， 楊曉蕾， 高麗珍， 李建宏*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730070； 2.臨潭縣科學(xué)技術(shù)局， 甘肅 甘南 747500)

青藏高原是我國重要的生態(tài)屏障，它的穩(wěn)定關(guān)乎整個國家的生態(tài)環(huán)境安全，而農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)是青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分之一[1]，因其特殊的地理?xiàng)l件，加之人類薄弱的耕地保護(hù)意識,土壤連年耕作，過量施用化肥，出現(xiàn)了肥料增產(chǎn)效應(yīng)降低、土壤貧瘠、退化、穩(wěn)定性差等現(xiàn)象[2]。有數(shù)據(jù)表明，氮肥利用率僅為29.1%～39.0%[3]。

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是一類具有固氮、溶磷、解鉀、分泌植物激素和拮抗植物病害等作用的有益微生物[4]。在植物中施用不同的優(yōu)良植物根際促生菌研制的復(fù)合微生物菌劑，不僅具備以上促生特性，還能減少因生產(chǎn)化肥造成的非再生能源的消耗[5]。因此，近些年有學(xué)者嘗試?yán)弥参锔H促生菌制劑替代部分化肥，并取得了良好的效果[6-7]。榮良燕等[8]在玉米(ZeamaysL.)中施用菌劑，減少了20%～30%的化肥施用量，同時實(shí)現(xiàn)玉米增產(chǎn)9.86%。李永斌等[9]發(fā)現(xiàn)施加菌劑后，在減少10%的尿素使用量下，還能使小麥(Triticumaestivum)增產(chǎn)10.4%。張萬通等[10]在高寒草地施用菌劑部分代替化肥，發(fā)現(xiàn)在減少化肥的施用量的同時，還緩解了因施氮肥引起的物種豐富度下降的情況。目前關(guān)于PGPR替代化肥方面研究，主要集中于替代量的選擇、根際土壤養(yǎng)分的變化、植物生長的改變等方面[11-12]。PGPR菌劑發(fā)揮作用，不僅可以通過代謝作用增加有效養(yǎng)分的含量，還能在一定程度上改善土壤微生態(tài)環(huán)境，從而發(fā)揮促生作用[13]。因此，要全面認(rèn)識PGPR替代化肥的效果，就要了解施用PGPR菌劑對土壤微生物的影響。然而對高寒耕作區(qū)中菌劑部分替代化肥對土壤微生物影響的報道較少。

磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid,PLFA)是活體微生物細(xì)胞膜恒定組分,它對環(huán)境因素比較敏感、能在生物體外迅速降解，特定菌群PLFA數(shù)量改變可反映原位土壤真菌、細(xì)菌的活體生物量以及微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化[14]。因此，本研究在青藏高原耕作區(qū)使用菌劑與化肥配施，通過分析土壤磷脂脂肪酸，測定土壤中自生固氮微生物數(shù)量、脲酶和硝態(tài)氮等指標(biāo)。初步探究微生物菌劑部分替代化肥之后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及固氮菌群的變化，以期為高寒草地微生物菌劑的推廣使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)于2019年在甘南藏族自治州臨潭縣新城鎮(zhèn)進(jìn)行。樣地位于甘肅省東南部、甘南藏族自治州東部(34°30′～35°05′ N，103°10′～103°52′ E)，屬高山丘陵地區(qū)，地勢西高東低，平均海拔高度2 825 m，年平均氣溫為3.2℃，最高溫度29.6℃，最低溫度-27.1℃，相對無霜期65 d，絕對無霜期10 d[15]，年降水量383.2～668.2 mm，年平均日照時數(shù)2 324 h，屬高寒陰濕區(qū)，是典型的高原農(nóng)業(yè)區(qū)[16]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)共設(shè)置5個處理，每個處理3次重復(fù)。試驗(yàn)各小區(qū)面積為25 m2，各小區(qū)之間設(shè)1.5 m隔離帶，隔離帶中不施肥。試驗(yàn)地種植植物為青稞(Hordeumvulgarevar.celesteLinnaeus)，品種為‘藏青’，種子來源于當(dāng)?shù)剞r(nóng)資市場。無機(jī)化肥與菌劑施加量分別為45 kg·hm-2，300 kg·hm-2。供試微生物菌劑由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供(具體配方正在申請專利中)，主要菌株為蕈狀芽孢桿菌Bacillusmycoides Gnyt1(保藏號：CCTCCM 2017177)、枯草桿菌BacillussubtilisLHS11和假單胞菌Pseudomonassimiae240，菌劑有效活菌數(shù)≥1×109cfu·mL-1。無機(jī)化肥為磷酸二胺，總養(yǎng)分(N+P2O5)≥64.0%，購買自當(dāng)?shù)剞r(nóng)資市場。處理1為單施化肥(T1)、處理2為菌劑+75%化肥(T2)、處理3為菌劑+50%化肥(T3)、處理4為菌劑+25%化肥(T4)、處理5為單施菌劑(T5)，空白對照(CK)為不施肥。在土壤表層0～10 cm取樣，去除雜物，裝入無菌樣品采集袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存，用于土壤微生物磷脂脂肪酸等分析。

1.3 土壤微生物PLFA測試

土壤微生物PLFA測試方法為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)法，樣品主要處理流程為提取、分離、酯化[17]。主要試劑為37種脂肪酸混標(biāo)(FAME)(Supelco,USA)和26種脂肪酸混標(biāo)(BAME)(Supelco,USA)。GC-MS分析色譜柱采用Agilent Technologies公司的HP-5MS(60 m，250 mm)。具體步驟為140℃，3 min，以每分鐘4℃升溫至190℃。190℃，1 min，然后以每分鐘3℃升溫至230℃，230℃下1 min，之后再以2℃每分鐘升溫至250℃，1 min后，最后以10℃每分鐘升溫至280℃，280℃，1 min。離子源EI+，MS Scan模式全掃描(范圍50～500)[18]。磷脂脂肪酸采用Frostegard[19]方法命名，PLFA可以作為微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)變化的生物標(biāo)記分子[20]，微生物生物量用各PLFA含量加和表示[21]。磷脂脂肪酸(PLFA)分類結(jié)果見表1。

表1 特征磷脂脂肪酸分類Table 1 Classification of phospholipid fatty acids (PLFA) Signature

1.4 土壤指標(biāo)測定

土壤微生物量氮測定采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法。浸提液中的土壤微生物量氮采用凱氏定氮法，每個土樣重復(fù)3次測定[24]。使用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定土壤脲酶活性[25]。銨態(tài)氮測定采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法(氯化鉀濃度為2 mol·L-1,土水比為1∶5)，土壤硝態(tài)氮測定采用雙波長紫外分光光度校正因數(shù)法，測定結(jié)果均以土壤干質(zhì)量計算[26]。

1.5 土壤自生固氮菌的計數(shù)

好氣性自生固氮菌使用改良阿須貝(Ashby)無氮瓊脂培養(yǎng)基，以平板表面涂布法測定[27]，嫌氣性自生固氮菌使用玉米面培養(yǎng)基，以稀釋法測定[28]。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計計算并繪圖，使用R語言(3.5.1)對土壤微生物指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA統(tǒng)計分析和Duncan極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

2.1.1土壤微生物組成 由表2可知，隨菌劑替代化肥的比例增加，土壤中細(xì)菌數(shù)量逐步增加，各處理間差異顯著(P<0.05)。真菌與放線菌數(shù)量變化趨勢同細(xì)菌相似，整體呈上升趨勢，都隨菌劑替代化肥的比例增加而增加。土壤總PLFA表示土壤中總微生物量，隨菌劑替代化肥的比例增加，土壤總PLFA也呈現(xiàn)上升趨勢，T1-T5之間差異顯著。(P<0.05)。

表2 不同施肥處理土壤微生物組成Table 2 Soil Microbial Composition in Different Fertilization Ratios

2.1.2土壤微生物群落結(jié)構(gòu) 施用菌劑對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了影響。GP整體呈上升趨勢，T5處理下，GP數(shù)值最高，CK與T5(單施菌劑)處理之間差異不顯著。GN變化趨勢隨菌劑替代化肥比例增加而增大，CK與T5之間無顯著差異。GP數(shù)量始終大于GN數(shù)量，GN/GP呈上升趨勢，除CK外，其余處理之間差異顯著(P<0.05)。B/F呈下降趨勢，隨菌劑替代化肥的比例增加，B/F值變小，除CK外，各處理之間差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3 不同施肥處理下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)Table 3 Soil microbial community structure under different fertilization ratios

2.1.3土壤微生物壓力指數(shù) 隨菌劑替代化肥比例的增加，微生物壓力指數(shù)減小。T1(單施化肥)、T2(菌劑+75%化肥)、T3(菌劑+50%化肥)與CK相比，差異顯著(P<0.05)。T4(菌劑+25%化肥)、T5與CK之間無顯著差異。化肥施用比例增加，微生物壓力指數(shù)增大，說明化肥增加了土壤微生物的脅迫程度，導(dǎo)致土壤微生物壓力指數(shù)增大。

2.2 土壤好氣與嫌氣自生固氮菌群數(shù)量

由圖2可知，菌劑替代化肥的比例增加之后，土壤中自生固氮菌數(shù)量也相應(yīng)增加。T1與CK處理下，自生固氮菌數(shù)量較少，同施用菌劑相比，差異顯著(P<0.05)。隨菌劑的比例增大，好氣性自生固氮菌數(shù)量變多，嫌氣性自生固氮菌總體呈增加趨勢。土壤中好氣性自生固氮菌數(shù)量大于嫌氣性自生固氮菌。施用菌劑后，好氣性自生固氮菌數(shù)量增加更加明顯。T4處理下，好氣性自生固氮菌數(shù)較T1處理增長40.07%，嫌氣性自生固氮菌增長11.11%。T5與CK處理相比較，自生固氮菌數(shù)量差異顯著(P<0.05)。單施化肥處理下自生固氮菌數(shù)量小于不施肥處理。

圖1 不同施肥處理下微生物壓力指數(shù)Fig.1 Microbial Pressure Index under Different Fertilization Ratios注：誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:The error line is standard error. Different lowercase letters indicate distinct differences,the same as below

圖2 不同施肥處理下好氣性與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量Fig.2 Number of Aerobic and Suspicious Azotobacter under Different Fertilization Treatments

2.3 土壤酶活性與氮含量

由表4可知，隨菌劑替代化肥比例增加，土壤脲酶活性隨之升高，CK脲酶活性最低，脲酶活性在T4處理下達(dá)到最大值，為0.42 mg·(g·d)-1。微生物量氮隨菌劑比例的增加，呈先上升后下降的趨勢，在T4處理時出現(xiàn)峰值(9.32 mg·kg-1)。CK處理下微生物量氮含量最低。硝態(tài)氮與銨態(tài)氮變化趨勢與微生物量氮相似，呈先上升后下降趨勢，在T4處理達(dá)到最大值，分別為9.66 mg·kg-1，6.84 mg·kg-1。

表4 不同施肥處理下土壤酶活性與氮含量Table 4 Soil enzyme activity and nitrogen content under different fertilization treatments

2.4 不同施肥處理下土壤微生物指標(biāo)相關(guān)性分析

由圖3可知，土壤微生物總磷脂脂肪酸與細(xì)菌磷脂脂肪酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與革蘭氏陰性菌、真菌和放線菌磷脂脂肪酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。細(xì)菌磷脂脂肪酸與革蘭氏陰性菌、真菌的磷脂脂肪酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。真菌磷脂脂肪酸與放線菌磷脂脂肪酸呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)。土壤微生物總磷脂脂肪酸與土壤中微生物的壓力指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。革蘭氏陰性菌和真菌磷脂脂肪酸與土壤微生物壓力指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

圖3 土壤微生物各指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of soil microorganism indexes注:*表示在0.05水平上顯著相關(guān)；**表示在0.01水平上顯著相關(guān)；***表示在0.001水平上顯著相關(guān)。GP,革蘭氏陽性菌；Bacteria,細(xì)菌；Total PLFA,總磷脂脂肪酸；GN,革蘭氏陰性菌；Fungus,真菌；Actinomycete,放線菌；Urease,脲酶；Microbial nitrogen,微生物量氮；Microbial pressure index,微生物壓力指數(shù)；Nitrate-N,硝態(tài)氮；Ammonium-N，銨態(tài)氮Note:*means significant correlation at the 0.05 level;**means significant correlation at the 0.01 level,***means significant correlation at the 0.001 level。GP,Gram-positive bacteria；bacteria，bacteria；Total PLFA,total phospholipid fatty acid；GN,Gram-negative bacteria；Fungus,fungus；Actinomycete,actinomycete；Urease,urease；Microbial nitrogen,Microbial nitrogen;Microbial pressure index,Microbial pressure index;Nitrate-N,Nitrate-N,Ammonium-N

3 討論

3.1 菌劑替代化肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤磷脂脂肪酸可用來表示土壤微生物的生物量以及微生物群落結(jié)構(gòu)[29]，土壤微生物群落多樣性能夠檢測土壤受干擾后的微小變化，描述微生物群落結(jié)構(gòu)的變化和自然或人為干擾對群落的影響[30]。試驗(yàn)表明，對施用菌劑后的土壤進(jìn)行PLFA測試分析發(fā)現(xiàn)，提高菌劑替代化肥的比例，土壤總磷脂脂肪酸增加。說明施用菌劑提高了土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量，且差異顯著。菌劑中微生物為篩選得到的具有促生能力的優(yōu)良菌株，施用于土壤中，能明顯增加土壤中有益微生物的數(shù)量，致使土壤中微生物量碳、氮和磷的含量增加，微生物量碳、氮和磷也是植物能夠吸收利用養(yǎng)分的主要來源之一[31]。在保證作物產(chǎn)量的同時，使用菌劑替代部分化肥，能減少過量施用化肥帶來的不良后果。CK中微生物數(shù)量與全施菌劑處理下微生物總數(shù)差異不顯著，但CK中好氣性自生固氮菌與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量遠(yuǎn)小于全施菌劑(T5)處理。土壤中有益微生物數(shù)量占土壤總微生物數(shù)量的主體地位時，土壤才會向良性方向發(fā)展[32]。在養(yǎng)護(hù)條件相同的情況下，作物的產(chǎn)量能直接體現(xiàn)土壤的肥力大小。土壤的營養(yǎng)狀況還可以通過革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌之間的比值來反映，比值越高表明營養(yǎng)脅迫程度越低[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，提高菌劑替代化肥的比例之后，革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌比值先升高后降低，在T4處理下達(dá)到峰值。說明施用一定量的菌劑能顯著改善土壤的營養(yǎng)狀況。菌劑替代化肥的比例降低之后，土壤微生物的數(shù)量也隨之減少，可能是化肥在一定程度上改變了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，致使微生物數(shù)量下降。增加菌劑替代化肥的比例，土壤微生物數(shù)量增加，這對于土壤肥力的保持，減少化肥的危害量具有重要的意義。細(xì)菌與真菌數(shù)量的比值表示土壤中兩個群落的相對豐度，能夠體現(xiàn)土壤生態(tài)系統(tǒng)對外界緩沖能力，該指標(biāo)越低，表明生態(tài)緩沖能力越高[33]，施用菌劑之后土壤的緩沖能力顯著提高。說明施用菌劑能提高土壤的抗性，增強(qiáng)土壤應(yīng)對脅迫的能力。土壤微生物壓力指數(shù)反映土壤中微生物所受的脅迫程度，本試驗(yàn)中隨菌劑替代化肥的比例增加，微生物壓力指數(shù)減小。說明施用菌劑有利于土壤微生物的生長繁殖，會減少土壤微生物的生存壓力。這與楊淑娜[34]等人的研究結(jié)果相同，使用有機(jī)肥料或菌肥替代部分化肥，減少了微生物壓力指數(shù)，增加了土壤有機(jī)質(zhì)，從而提升了土壤肥力。

3.2 菌劑替代化肥對固氮菌群、土壤酶活性與氮含量的影響

固氮菌能夠利用自身分泌的固氮酶，將空氣中的N2轉(zhuǎn)化為可利用的氮素[35]。土壤中自生固氮菌能夠增加土壤中的氮素，從而減少氮肥的施用量。提高菌劑替代化肥的比例，好氣性自生固氮菌數(shù)量與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量較CK均出現(xiàn)顯著增加，且各處理間差異顯著(P<0.05)。說明施用菌劑能夠提高土壤中固氮微生物的數(shù)量，進(jìn)而增加土壤中氮的含量。由此可見，施肥中增加菌劑或者有機(jī)類肥料的施用比例，減少無機(jī)化肥的施用，對土壤自身肥力的持續(xù)形成具有重要意義。土壤酶在土壤各種養(yǎng)分轉(zhuǎn)化之間發(fā)揮著重要作用，酶活性的大小能間接衡量土壤肥力[36]。脲酶是土壤酶中一類關(guān)鍵的水解酶，其活性能體現(xiàn)出土壤對植物的供氮能力大小。脲酶在土壤的氮素循環(huán)過程中有著不可替代的作用，是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化與能量代謝的必需物質(zhì)。土壤微生物數(shù)量及土壤有機(jī)質(zhì)的含量能夠決定土壤中脲酶的活性[37]。在土壤中施用菌劑或有機(jī)肥能夠提升土壤中脲酶的活性[38]，本試驗(yàn)中，提高了菌劑替代化肥的比例，脲酶的活性相應(yīng)增加。菌劑中的微生物能夠增加土壤有機(jī)質(zhì)，使土壤酶免遭變性或降解，間接增加了土壤脲酶的活性，這也與高佳等人[39]的研究結(jié)果相似。土壤微生物量氮能夠體現(xiàn)出土壤中的氮素含量大小[40]。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是土壤中的氮素形態(tài)之一，含量較低，但卻能夠被植物直接吸收利用，所以土壤中硝態(tài)氮與銨態(tài)氮含量能反映出土壤肥力的大小[41-42]。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨菌劑替代化肥比例的增加，土壤微生物量氮先增加后減小，在替代75%化肥處理下，土壤微生物量氮、硝態(tài)氮以及銨態(tài)氮含量最大。說明在保證土壤養(yǎng)分的同時，使用部分菌劑替代化肥，能有效減少化肥的危害。張萬通[10]等人在高寒草地施用菌劑發(fā)現(xiàn)，過高比例的菌劑施用，不會增加土壤中氮素的含量。因此，菌劑并不能完全替代無機(jī)化肥，在前人的研究結(jié)果中也能得到相應(yīng)的佐證[43]。后續(xù)的研究中，應(yīng)對菌劑的配方進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，依據(jù)土壤的需要，增加菌劑中大量元素或者微量元素的含量，更加有效的提升土壤肥力，以便能減少化肥的施用比例。也應(yīng)該對土壤的肥力進(jìn)行進(jìn)一步的評價，如通過監(jiān)測增加菌劑施用比例或不施肥情況下，作物產(chǎn)量的變化趨勢等。

4 結(jié)論

不同處理下菌劑對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與固氮菌群有顯著影響，菌劑+25%化肥處理下，不僅增加了土壤總磷脂脂肪酸，還顯著提高了土壤中好氣性自生固氮菌與嫌氣性自生固氮菌數(shù)量；相較于單施菌劑處理，菌劑+25%化肥處理下土壤脲酶活性，以及硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和微生物量氮含量最高，但總PLFA與固氮有益菌數(shù)量略低于單施菌劑處理。綜上，菌劑并不能完全替代化肥，但菌劑的施用在提升了土壤肥力的同時，還改善了土壤微生態(tài)環(huán)境，減少了農(nóng)藥化肥的使用，間接降低化肥農(nóng)藥帶來的危害，以及由化肥農(nóng)藥的施用帶來的食品污染與不可再生能源的消耗。