陳宇，宋紫燁，高陽，蔡紅兵

0 引言

宮頸癌是全球女性第四大惡性腫瘤，其中85%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，盡管實施了有效的篩查和疫苗接種計劃，其總發(fā)病率有所下降，但在這些國家，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍然較高，且宮頸癌是女性癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。大多數(shù)早期宮頸癌通過手術切除治愈，對于局部晚期宮頸癌，同步放化療是首選的治療方法[3-4]。然而，30%的局部晚期宮頸癌患者在根治性同步放化療后仍會出現(xiàn)復發(fā)轉移[5-6]。因此，需更深入的研究揭示新的治療靶點。上皮細胞轉化序列2（epithelial cell transformation sequence 2,ECT2）是人類ECT2基因編碼的鳥嘌呤核苷酸交換因子，與癌癥的發(fā)生直接相關[7]，在非小細胞肺癌、乳腺癌和結直腸癌等多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用[7-9]。ECT2對宮頸癌的影響目前尚不清楚，因此，本研究擬觀察ECT2對人宮頸癌細胞增殖的影響，并探究其機制，以期為ECT2基因作為宮頸癌治療的新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人宮頸癌細胞系C33A、SiHa和HeLa（湖北省腫瘤生物學行為研究所細胞庫提供），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Hyclone公司），細胞轉染試劑Lipo2000（南京諾維贊生物公司），qPCR引物（北京擎科生物科技有限公司），ECT2干擾質粒siRNA和陰性對照質粒（上海吉瑪制藥有限公司），ECT2過表達慢病毒及空載病毒（廣州Gene-Copoeia生物公司），Anti-GAPDH、Anti-CDK1、Anti-CyclinΒ1、羊抗兔、羊抗鼠二抗和兔抗羊二抗（武漢三鷹技術有限公司），Anti-ECT2、Anti-Cdc42和Anti-Rac1（美國Abcam公司），細胞周期檢測試劑盒（上海碧云天公司），倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Βio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 將C33A、SiHa和HeLa用含10%FΒS的DMEM完全培養(yǎng)基置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HeLa細胞按1×105個/孔接種于24孔板內，用ECT2過表達慢病毒轉染HeLa細胞，用2 μg/ml的嘌呤霉素進行篩選構建穩(wěn)定表達實驗組（HeLa-ECT2組），用空載體慢病毒轉染構建陰性對照組（HeLa-NC組）。將C33a和SiHa細胞按4×105個/孔接種于六孔板內，用ECT2 siRNA質粒轉染細胞，構建實驗組（SiHa-siRNA組和C33a-siRNA組），用陰性對照質粒構建陰性對照組（SiHa-NC組和C33a-NC組）。

1.2.2 MTT實驗 取對數(shù)生長期的各組細胞接種于96孔板中，加入10 μl MTT試劑，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO置搖床上低速振蕩10 min，充分溶解結晶，用酶標儀測量490 nm波長處的吸光度值。

1.2.3 流式細胞術 用不含EDTA的胰酶消化離心收集細胞至1.5 ml EP管中，無水乙醇固定過夜，1000 r/min離心5 min，利用流式細胞儀檢測碘化丙啶（PI）染色后的細胞懸液。

1.2.4 細胞免疫熒光 取各組細胞單細胞懸液于蓋玻片上，4%的多聚甲醛固定，細胞膜穿孔后，加入山羊血清封閉，加入羊抗人ECT2抗體（1:500）、兔抗人CDK1抗體（1:100），4℃孵育過夜，加入熒光標記的二抗（1:100）于37℃孵育1 h，加入DAPI染色，最后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 實時熒光定量PCR 提取細胞RNA，用RNA反轉錄試劑盒合成cDNA，進行熒光定量PCR檢測。GAPDH上游引物序列為：5’-CTGTTCG ACAGTCAGCCGCATC-3’，下游引物序列為：5’-GCGCCCAATACGACCAAATCCG-3’；ECT2上游引物序列為：5’-TGTAGTCACGGACTTTC AGGA-3’，下游引物序列為：5’-GTACAATAC AACGGGCGACAT-3’；Rac1上游引物序列為：5’-ATGTCCGTGCAAAGTGGTATC-3’，下游引物序列為：5’-CTCGGATCGCTTCGTCAAACA-3’；Cdc42上游引物序列為：5’-CCATCGGAATATGTA CCGACTG-3’，下游引物序列為：5’-CTCAGCGG TCGTAATCTGTCA-3’；CDK1上游引物序列為：5’-TTGGGGACATTGGTAACAAAGTC-3’，下游引物序列為：5’-ATAGGCTCAGGCGAAAGTTT TT-3’；CyclinΒ1上游引物序列為：5’-TTGGGGA CATTGGTAACAAAGTC-3’，下游引物序列為：5’-ATAGGCTCAGGCGAAAGTTTTT-3’。

1.2.6 Western blot實驗 提取各組細胞總蛋白，利用ΒCA法進行蛋白定量，在制好的凝膠板孔中進行電泳，而后依次轉膜、5%脫脂牛奶封閉，分別用羊抗人ECT2抗體（1:1500）、兔抗人CDK1、Cdc42、CyclinΒ1抗體（1:2000）和鼠抗人GAPDH、Rac1抗體（1:2000）4℃孵育過夜，室溫下二抗（1:5000）孵育2 h，最后利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行ECL顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

用GraphPadPrism9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ECT2敲降和過表達效率

在宮頸癌細胞中轉染siRNA或過表達ECT2后，用qPCR檢測ECT2在宮頸癌細胞中敲降和過表達效率，結果表明ECT2在C33a和SiHa細胞的干擾效率分別為70%（P＜0.001）和50%（P＜0.0001），在HeLa細胞中過表達ECT2后，ECT2的表達量為陰性對照組的2倍（P＜0.0001），見圖1。

圖1 qPCR檢測ECT2敲降(A,Β)和過表達(C)效率Figure 1 Construction of ECT2 knockdown(A,Β) or overexpression(C) of cervical cancer cell lines detected by qPCR

2.2 ECT2對宮頸癌細胞增殖的影響

MTT檢測發(fā)現(xiàn)，SiHa-siRNA組細胞增殖速度顯著低于SiHa-NC組（P＜0.001），見圖2A，C33a-siRNA組細胞增殖速度顯著低于C33a-NC組（P＜0.001），見圖2Β，敲低ECT2細胞增殖速度減慢，說明ECT2促進宮頸癌細胞增殖。

圖2 MTT法檢測ECT2對宮頸癌SiHa細胞(A)和C33a細胞(Β)增殖的影響Figure 2 Effect of ECT2 on viability of SiHa(A) and C33a(Β) cell lines detected by MTT method

2.3 ECT2對宮頸癌細胞周期的影響

流式細胞術結果提示，與SiHa-NC組細胞相比，SiHa-siRNA組細胞G2/M期細胞比例上升而G1期細胞比例下降，見圖3A；與C33a-NC組細胞相比，C33a-siRNA組細胞G2/M期細胞比例上升而G1期細胞比例顯著下降，見圖3Β；與陰性對照組相比，HeLa-ECT2組細胞更多的由G2/M期進入G1期，見圖3C。因此可知，ECT2可通過調控G2/M期向G1期轉化來調控細胞增殖。

圖3 ECT2對宮頸癌細胞周期的影響Figure 3 Effect of ECT2 on cell cycle of cervical cancer cells

2.4 ECT2與CDK1的關系

通過生物信息學通路分析軟件（Ingenuity Pathway Analysis,IPA），我們發(fā)現(xiàn)ECT2可能與周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1,CDK1）存在相互作用。進一步的細胞免疫熒光結果顯示見圖4A、Β，CDK1（綠色）與ECT2（紅色）共定位，融合色為黃色，ECT2主要分布于細胞質和細胞核。敲降ECT2后，核內標記ECT2和CDK1蛋白的熒光強度均出現(xiàn)下降。而CDK1和磷酸化細胞周期蛋白Β1（CyclinΒ1）共同調節(jié)細胞周期G2/M期，qPCR及Western blot結果顯示，敲降ECT2后CDK1、CyclinΒ1的mRNA及蛋白表達水平顯著降低，見圖4C、D。

圖4 ECT2與CDK1的關系Figure 4 Relationship between ECT2 and CDK1

2.5 ECT2對Rac1、Cdc42的mRNA及蛋白水平的影響

為研究ECT2是否通過作用于下游Rho GTP酶調控宮頸癌細胞的增殖，我們在宮頸癌細胞中敲降及過表達ECT2后，檢測了Rho GTP酶Rac1和Cdc42 mRNA及蛋白水平的變化，qPCR及Western blot結果顯示，SiHa和C33a細胞敲降ECT2后，Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白水平均較對照組顯著降低，見圖5A～Β，而HeLa細胞過表達ECT2后，Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白水平均較對照組顯著增加，見圖5C。

圖5 ECT2對Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白表達的影響Figure 5 Effect of ECT2 on Rac1 and Cdc42 mRNA and protein expression

3 討論

ECT2在肺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等腫瘤中發(fā)揮原癌基因的功能[10-13]，其機制主要通過激活RhoA-ERK信號通路，促進VEGF和MMP9的表達，從而促進腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移，進而促進腫瘤的發(fā)展[14]。此外，ECT2還通過增強有氧糖酵解和抑制NK細胞和T細胞的功能促進M2巨噬細胞的極化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲降ECT2后，宮頸癌細胞增殖速度降低，且伴隨G2期阻滯；而過表達ECT2后，宮頸癌細胞增殖速度增加，同時更多細胞從G2/M轉化為G1期。上述結果提示了ECT2可能作為促癌基因促進宮頸癌細胞增殖。

ECT2定位于癌細胞的細胞核和細胞質中，且其致癌能力與Rac1活化相關[16-17]。ECT2通過激活RAC靶向RhoA來調節(jié)細胞的分裂，在細胞分裂間期，ECT2/Cdc42通路控制著絲粒處組蛋白變體CENP-A的摻入，而ECT2/Rac1可以促進核糖體DNA（rDNA）轉錄[18]。位于非小細胞肺癌（NSCLC）細胞核仁的大量ECT2，與核糖體DNA啟動子區(qū)域上的轉錄因子上游結合因子1（UΒF1）結合，募集并激活小GTP酶Rac1到rDNA，這反過來刺激活性Rac1與核磷蛋白（NPM）的結合，以驅動rDNA轉錄、轉化生長和體內肺腫瘤形成[17,19]。有研究發(fā)現(xiàn)，同為鳥嘌呤核苷酸交換因子的鳥嘌呤核苷酸交換因子T可以通過激活Rac1/Cdc42通路抑制橫紋肌肉瘤細胞的凋亡并加速橫紋肌肉瘤的生長和肺轉移[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲降/過表達ECT2后，Rac1/Cdc42通路核心基因Rac1、Cdc42的mRNA及蛋白水平發(fā)生降低/增加，提示ECT2可能通過調控Rac1/Cdc42信號通路進而調控細胞周期。另一方面，ECT2可能通過與CDK1的蛋白互作實現(xiàn)對細胞周期的調控。CyclinΒ1及其催化伙伴CDK1是調節(jié)細胞從G2期到有絲分裂進程的基本激酶，CyclinΒ1/CDK1磷酸化決定了細胞是否能進入有絲分裂，其特征是核膜破裂、紡錘體形成和染色質凝聚[21]。CyclinΒ1/CDK1復合物是G2/M期DNA損傷檢查點的重要調節(jié)劑，華蟾素和高三尖杉酯堿通過負調節(jié)CDK1/CyclinΒ1復合物使細胞周期停滯在G2/M期來抑制惡性黑色素瘤細胞增殖[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細胞中敲降ECT2可以使CDK1和CyclinΒ1的表達降低，過表達ECT2使Rac1、Cdc42 mRNA及蛋白表達顯著增加，說明ECT2可能通過正向調節(jié)CDK1/CyclinΒ1調控G2/M期向G1期轉化，促進細胞增殖。

綜上所述，ECT2作為促癌基因促進宮頸癌細胞惡性轉化，可能通過下游Cdc42/Rac1信號通路，同時與CDK1在宮頸癌細胞內共定位調控細胞周期（G2/M期），促進宮頸癌細胞增殖。ECT2基因可能在宮頸癌靶向治療中具有一定的臨床價值。