袁 夢，常 巍，楊世麗，周海歐，李翠婷，馬燕梅

（福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建 福州 350002）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）嚴(yán)重威脅著豬養(yǎng)殖業(yè)，其病原體偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種囊膜病毒，其遺傳物質(zhì)是線性雙鏈DNA分子，編碼至少70種蛋白質(zhì)［1－2］，可感染多種動物。研究表明PRV在小鼠體內(nèi)可引起細(xì)胞因子風(fēng)暴以及細(xì)胞炎癥性壞死［3］。豬是PRV的唯一儲存宿主，母豬感染PRV后易出現(xiàn)不孕、流產(chǎn)，仔豬感染PRV后會出現(xiàn)腹瀉、呼吸衰竭甚至死亡［4］。成年豬感染PRV康復(fù)后經(jīng)常形成潛伏感染，帶毒的豬不發(fā)病，但在一定條件下會釋放病毒，成為豬群中的主要傳染源［5］。有研究表明，PRV在中國豬群中依然存在持續(xù)傳播，并且存在跨物種傳播現(xiàn)象［6］。有報道指出PRV可以感染人，導(dǎo)致人眼內(nèi)炎和急性腦炎，并在患者腦脊液中分離出了PRV毒株hSD-1/2019［7］。因此如何準(zhǔn)確、便捷地檢測PRV已成為亟待解決的問題。gE蛋白包含577個氨基酸［8］，是由us8基因編碼形成異二聚體的囊膜糖蛋白［9］；gE是PRV主要的囊膜毒力蛋白［10］，編碼囊膜蛋白gE的基因變異程度低，該蛋白能介導(dǎo)PRV與宿主動物細(xì)胞的融合，促進(jìn)PRV的擴(kuò)散與釋放，導(dǎo)致PRV對宿主體內(nèi)嗜神經(jīng)組織的趨向性，有利于PRV在高級神經(jīng)中樞神經(jīng)突觸間傳遞擴(kuò)散［11－12］。用缺失gE基因的PRV毒株感染動物，病毒在動物鼻腔上皮細(xì)胞中的復(fù)制不受影響，但其在神經(jīng)組織中產(chǎn)生的傷害顯著下降［13］。目前生產(chǎn)上常見的PRV基因缺失株疫苗多缺失gE基因，因此檢測gE可以區(qū)分野毒株和疫苗株［9］。重組PRV gE可用作血清診斷試驗，檢測其特異性抗體并區(qū)分是否為疫苗接種動物［14］，因此制定針對PRV gE抗體的檢測方法具有十分重要的意義。

本試驗先對gE蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并純化，在免疫BALB/c小鼠后制備gE單克隆抗體，建立競爭ELISA抗體檢測方法，制備抗體檢測試劑盒，為獲得一種更廉價有效的檢測方法尋找新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PRV FA株和SP2/0細(xì)胞由本實驗室保存；DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自福州晴百旺生物科技有限公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Viral DNA/RNA Kit、完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購自全式金生物技術(shù)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；DNA純化試劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建以及動物免疫

1.2.1gE基因的擴(kuò)增及質(zhì)粒構(gòu)建 從NCBI上下載PRV FA株的全基因序列（KM189913），用Snapgene軟件根據(jù)PRV gE基因主要抗原表位區(qū)段（561 bp）設(shè)計1對引物：gE-F 5′-CGGGATCCGAGGCC GACGACG-ATGACCTCAA-3′（BamH I）；gE-R 5′-CGGAATTCCGAGAAGAGCTGCGAGTGGAA -3′（EcoR I）。提取PRV-FA株的DNA為模板，以94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在核酸凝膠成像儀的紫外燈下將目的片段切下。

1.2.2 pET-28a-gE表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將目的片段與載體分別用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，載體酶切體系：載體pET-28a 2 μL、BamH I 1 μL、EcoR I 1 μL、10×Buffer 4 μL、ddH2O 32 μL。目的片段酶切體系：目的片段30 μL、BamH I 1 μL、EcoR I 1 μL、10×Buffer 4 μL、ddH2O 4 μL。將經(jīng)金屬?。?7 ℃ 1 h）雙酶切后的載體與目的片段用DNA純化試劑盒純化，然后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系：目的片段 8 μL、載體DNA 2 μL、T4 DNA連 接 酶1 μL、10×Buffer 1.5 μL、ddH2O 2.5 μL。將連接體系在金屬?。?6 ℃）中連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂具有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，第2天挑取菌落至具有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在搖床（37 ℃、200 r/min）上培養(yǎng)12 h，再用無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 重組蛋白gE-6×His的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性鑒定 將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂具有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，第2天挑取菌落至具有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)4 h；用1.2節(jié)中的方法，將菌液作為模板，進(jìn)行菌液PCR鑒定，將陽性菌按菌液∶培養(yǎng)基=1∶100的體積比加入具有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)1～2 h；當(dāng)菌液的OD600值約為0.6時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在25 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)6 h，然后在4 ℃下以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集菌體沉淀，進(jìn)行超聲波破碎，將破碎后的菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色后用清水脫色，觀察目的蛋白條帶。

1.2.4 重組蛋白gE-6×His的純化 使用結(jié)合緩沖液平衡鎳柱，將蛋白樣本通過恒流泵流入鎳柱；再用結(jié)合緩沖液洗滌鎳柱，依次用100、200、300、400和500 mmol/L咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集從鎳柱底端流出的各濃度的洗脫緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色后用清水脫色，觀察蛋白的純化情況。

1.2.5 小鼠免疫 將純化后的蛋白與佐劑按體積比1∶1乳化，然后免疫BALB/c小鼠，采用背部皮下多點注射的方法進(jìn)行免疫，每只小鼠每次免疫注射100 ng重組蛋白gE-6×His，免疫間隔14 d。首次免疫采用完全弗氏佐劑，二免和三免均采用不完全弗氏佐劑，三免后對小鼠進(jìn)行尾部采血，檢測小鼠血清抗體效價。選擇血清效價最高的小鼠，在三免后第14天不用任何佐劑，將100 ng純化后的融合蛋白注射小鼠腹腔，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.3 競爭抑制ELISA檢測方法的建立

1.3.1 最佳反應(yīng)條件的確定 用方陣滴定法確定抗原濃度及免疫鼠血清稀釋度，將融合蛋白進(jìn)行倍比稀釋，包被96孔酶標(biāo)板，將純化后的蛋白用包被緩沖液倍比稀釋到濃度分別為2500、1250、625、312.5、156.25、78.15、39.06、19.53、9.77、4.88和2.44 ng/mL，按100 μL/孔加入酶標(biāo)板。一抗使用的免疫鼠血清的倍比稀釋度為從1∶1000到1∶64000，每個蛋白包被的濃度設(shè)1個PBS陰性對照。二抗使用PBS配制的3%脫脂牛奶的羊抗鼠HRP，稀釋度為1∶2000。顯色后加終止液，測定OD450值，OD450值≈1的孔對應(yīng)的抗原包被濃度和一抗稀釋度為最佳條件。

1.3.2 血清的最佳稀釋度 根據(jù)優(yōu)化后的競爭ELISA條件，分別取陽性和陰性待檢血清，按1∶2、1∶4、1∶8和1∶16進(jìn)行倍比稀釋，用1.3.1節(jié)中的方法進(jìn)行檢測，計算血清抑制率（%），確定待檢血清的最佳稀釋度。

1.3.3 陰陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 對24份PRV陰性血清用已建立的競爭ELISA方法進(jìn)行檢測，計算血清抑制率，并按公式“陰陽性臨界值=X+3×SD”計算陰陽性臨界值，其中X是檢測的陰性血清抑制率的平均值，SD是其標(biāo)準(zhǔn)方差。

1.3.4 臨床檢測 使用建立的ELISA方法檢測32份待測豬血清，同時運用PCR方法進(jìn)行檢測，并比較兩者的檢測結(jié)果。

1.4 單克隆抗體的制備

1.4.1 細(xì)胞融合 在小鼠加強(qiáng)免疫后第3天進(jìn)行細(xì)胞融合，于細(xì)胞融合前1 d取非免疫BALB/c小鼠腹腔的巨噬細(xì)胞，鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。在細(xì)胞融合前將小鼠脫頸處死，于75%乙醇中浸泡5 min，在超凈臺中無菌取小鼠脾臟，在200目細(xì)胞篩上將脾臟研碎，用在4 ℃下儲存的無血清1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞篩，將收集的濾液以2000 r/min離心10 min，棄上清液，加10 mL 1640培養(yǎng)基，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。選狀態(tài)良好的SP2/0細(xì)胞，按SP2/0細(xì)胞∶脾細(xì)胞=1∶5的比例混勻，以2000 r/min離心10 min；棄上清液，在1 min內(nèi)加入40 ℃水浴的50% PEG 4000溶液，滴加同時混勻；在90 s內(nèi)加入37 ℃水浴的無血清1640培養(yǎng)基，加至50 mL時終止融合，將混合細(xì)胞以2000 r/min離心10 min；棄上清，用37 ℃水浴的20% FBS HAT 1640選擇培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至每毫升2×106個脾細(xì)胞，加入96孔板（已有飼養(yǎng)層細(xì)胞），每孔加入100 μL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選 于細(xì)胞融合后第4天，用20% FBS HAT 1640選擇培養(yǎng)基半量換液；在細(xì)胞融合后第8、9和12天，用20% FBS HT 1640選擇培養(yǎng)基半量換液。從第12天到第16天，用1.3.1節(jié)中建立的間接ELISA方法檢測上清抗體，陰性、陽性對照分別為SP2/0上清和免疫鼠血清。用間接ELISA方法檢測上清抗體應(yīng)重復(fù)2～3次，對穩(wěn)定分泌抗體的孔進(jìn)行亞克隆。用有限稀釋法將陽性細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)2～3次的亞克隆，用間接ELISA方法檢測上清抗體，當(dāng)用于篩選的孔中的上清液陽性率達(dá)到100%時，即表明篩選到可以穩(wěn)定產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細(xì)胞。

1.4.3 小鼠單抗腹水誘導(dǎo) 提前1 d向10周齡BALB/c小鼠腹腔注射不完全弗氏佐劑0.5 mL。第2天將處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞吹下，以800 r/min離心5 min，用PBS洗滌3次，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；加適量PBS，調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升2×106個雜交瘤細(xì)胞；向小鼠腹腔注射該液0.5 mL，在注射后7～10 d小鼠腹腔膨大，用注射器收集腹水，以8000 r/min離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃。

1.5 單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體效價的測定 將腹水上清從1∶1000開始稀釋，測定OD450nm值。選擇OD450nm值≥0.2、P/N值≥2.1且最高稀釋倍數(shù)為最佳稀釋度效價。

1.5.2 單克隆抗體的Western-blotting鑒定 提取攻毒PRV的PK15細(xì)胞蛋白樣本，將未攻毒的細(xì)胞樣作為陰性對照，使用Western-blotting鑒定免疫原性。

1.5.3 單克隆抗體的特異性檢測 使用間接ELISA方法檢測單克隆抗體的特異性，以PRV、PRRSV、VSV包被酶標(biāo)板，雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，羊抗鼠HRP為二抗檢測抗體的特異性。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗、成對雙樣本均值分析，與對照組相比，**、****、NS分別表示P＜0.01、P＜0.0001、不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白純化

2.1.1gE基因的擴(kuò)增及pET-28a-gE表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以PRV PK-15培養(yǎng)物為模板，用設(shè)計的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。在圖1A中，擴(kuò)增片段PRV gE主要抗原表位區(qū)段約為573 bp，符合預(yù)期；用內(nèi)切酶BamH I和EcoR I酶切重組質(zhì)粒，證明pET-28a-gE構(gòu)建完成。圖1B是pET-28a-gE的酶切結(jié)果，得到預(yù)期大小的條帶（目的片段大小約為573 bp）。質(zhì)粒送擎科公司測序，結(jié)果正確。

圖1 gE基因的擴(kuò)增及pET-28a-gE表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.2 重組蛋白gE-6×His的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性鑒定 pET-28a-gE表達(dá)融合蛋白gE-6×His是在25 ℃、0.5 mmol/L IPTG、150 r/min的條件下誘導(dǎo)6 h后獲得的。與pET-28a-gE誘導(dǎo)前的表達(dá)產(chǎn)物比較，pET-28a-gE誘導(dǎo)后出現(xiàn)了1條25～35 kDa的條帶，大小約為25.7 kDa（圖2A），符合預(yù)期，說明融合蛋白gE-6×His誘導(dǎo)表達(dá)成功。從圖2B可以明顯看出融合蛋白gE-6×His在上清中。

圖2 重組蛋白gE-6×His的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性鑒定結(jié)果

2.1.3 重組蛋白gE-6×His的純化 融合蛋白誘導(dǎo)后超聲破碎，進(jìn)行g(shù)E-6×His和gH-6×His鎳親和層析，圖3是可溶性融合蛋白gE-6×His的純化結(jié)果，可見純化后條帶單一，可用作抗原進(jìn)行免疫。

圖3 融合蛋白gE-6×His的純化結(jié)果

2.2 競爭抑制ELISA檢測方法的建立

2.2.1 棋盤滴定法確定最佳反應(yīng)條件 通過方陣滴定試驗，以PRV做抗原包被，以gE單克隆抗體做檢測抗體，結(jié)果顯示，當(dāng)PRV包被的稀釋度為1.25 μL/mL、單克隆抗體的稀釋度為1∶400時，OD450值為0.95（表1）。

表1 競爭ELISA檢測方法的優(yōu)化結(jié)果（OD450值）

2.2.2 待檢血清最佳稀釋度的確定 通過方陣滴定試驗，以PRV做抗原包被，以gE單克隆抗體做檢測抗體，試驗結(jié)果如表2所示，當(dāng)血清的稀釋度為1∶2時，陽性、陰性的抑制率均最高，分別為49%和5%。

表2 血清最佳稀釋度的確定結(jié)果（抑制率） %

2.2.3 陰陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定 用以上建立的競爭ELISA方法檢測24份gE多抗陰性血清，其抑制率平均值（X）為9.98，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）為2.83，根據(jù)公式：陰陽性臨界值=X+3×SD，得出gE多抗血清的陰陽性臨界值為18.47。

2.2.4 臨床檢測 用gE單克隆抗體建立的競爭ELISA抗體檢測方法檢測32份血清，檢出7份陽性、25份陰性（表3），與PCR檢測結(jié)果（圖4）相符。

表3 臨床檢測結(jié)果

圖4 32份血清的PCR檢測結(jié)果

2.3 單克隆抗體的制備

2.3.1 間接ELISA檢測鼠血清抗體方法的優(yōu)化 用方陣滴定法確定抗原包被的濃度和抗體的稀釋度。當(dāng)融合蛋白gE-6×His包被的濃度為0.63 μg/mL、陽性血清的稀釋度為1∶128000時，OD450值為1.01（表4）。

表4 間接ELISA檢測鼠gE抗體方法的優(yōu)化結(jié)果（OD450值）

2.3.2 間接ELISA檢測雜交瘤細(xì)胞株 通過間接ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞株上清的抗體效價，得到了7株細(xì)胞，將其分別命名為1C1、1B2、1D5、3D6、3G6、3E7、3C10。

2.3.3 陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆 細(xì)胞融合后的陽性孔中通常有不止1種雜交瘤細(xì)胞，為了得到單克隆雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法篩選單個雜交瘤細(xì)胞，結(jié)果得到2株能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞1B2和3E7（圖5）。

圖5 雜交瘤細(xì)胞的形態(tài)

2.4 單克隆抗體的鑒定

2.4.1 單克隆抗體效價的測定 取過度培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水，從1∶10開始稀釋，用間接ELISA方法檢測效價，結(jié)果細(xì)胞上清的抗體效價為1∶2560，小鼠腹水的抗體效價為1∶5120（表5）。

表5 單克隆細(xì)胞培養(yǎng)基抗體效價的檢測結(jié)果（OD450值）

2.4.2 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性的鑒定 雜交瘤細(xì)胞凍存可能會影響其產(chǎn)生抗體的能力，為了確定其能否穩(wěn)定產(chǎn)生抗體，用間接ELISA方法對復(fù)蘇后的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)凍存前和復(fù)蘇后產(chǎn)生抗體的能力變化小，單克隆細(xì)胞3E7的抗體分泌能力更穩(wěn)定（圖6）。

圖6 雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性的檢測結(jié)果

2.4.3 單克隆抗體的特異性檢測 用間接ELISA方法檢測單克隆抗體的特異性，以PRV、PRRSV、VSV包被酶標(biāo)板，以雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，結(jié)果表明，單克隆抗體具有特異性（圖7）。

圖7 間接ELISA方法檢測單克隆抗體的特異性

2.4.4 單克隆抗體的Western-blotting鑒定 將PK15細(xì)胞作為陰性對照，用Western-blotting鑒定單克隆抗體的特異性，結(jié)果顯示PK15 PRV-FA培養(yǎng)物出現(xiàn)了1條大小約120 kDa的單一條帶，而陰性對照沒有條帶，說明單克隆抗體能特異性地與PRV結(jié)合，特異性高（圖8）。

圖8 單克隆抗體的Western-blotting鑒定結(jié)果

3 討論

生豬集約化養(yǎng)殖現(xiàn)今已成為人類獲取可食用豬肉的主要方式，豬皮也可制成皮革，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，豬產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為經(jīng)濟(jì)發(fā)展和日常生活中不可或缺的一部分［15］。PRV在國內(nèi)外都有報道，且有多種PRV疫苗用于預(yù)防該病毒［16］。在臨床上區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬對于近年來的豬場PRV凈化工作有重要意義［17］。目前有多種方法可檢測PRV，有多重RT-PCR檢測技術(shù)［18］、動物接種法、血清學(xué)實驗等。由于進(jìn)口的PRV抗體ELISA試劑盒價格高，難以應(yīng)用于大面積檢測，因此開發(fā)特異、敏感、簡捷且價格低廉的PRV抗體檢測試劑盒十分必要。

gE蛋白是PRV的囊膜蛋白，有暴露于表面的抗原位點，其中g(shù)E是PRV主要的囊膜毒力蛋白［19］，可介導(dǎo)PRV與宿主細(xì)胞的融合。現(xiàn)有研究表明在PRV疫苗開發(fā)中，重組疫苗已成為新趨勢［20－21］。由于該蛋白的基因高度保守，多數(shù)PRV缺失株缺失gE蛋白，于是本研究選取了含有g(shù)E 5個主要抗原表位區(qū)段的基因（561 bp），通過PCR的方法將PRV FA株的gE 5個主要抗原表位區(qū)段成功擴(kuò)增并構(gòu)建至pET-28a（+）載體上，轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21（DE3），通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了融合蛋白gE-6×His。

經(jīng)鎳柱親和層析后獲得了純化的融合蛋白gE-6×His；將gE-6×His與免疫佐劑乳化后免疫BALB/c小鼠，建立了間接ELISA方法，以檢測免疫后血清效價，融合后也用此方法篩選雜交瘤細(xì)胞。將不完全弗氏佐劑注入小鼠腹腔，1 d后向腹腔中注射雜交瘤細(xì)胞懸液，約7 d后取小鼠腹水。本試驗用的小鼠腹水誘導(dǎo)方法更快捷，且不完全弗氏佐劑更容易引起特異性免疫應(yīng)答［22］，注射后1 d即可注射雜交瘤細(xì)胞，縮短了腹水誘導(dǎo)的時間，與楊國平等［23－24］使用的降植烷和石蠟相比更加快速。用Western-blotting鑒定單克隆抗體，可見在約120 kDa處有1個明顯條帶，與吳桐［25］制備的gE單克隆抗體的條帶位置相近，但本研究制備的單克隆抗體Western-boltting條帶更單一，特異性更強(qiáng)。

本研究采用PRV-FA作為抗原包被酶標(biāo)板，以gE單克隆抗體作為檢測抗體，建立了PRV的競爭性ELISA檢測方法，并優(yōu)化了檢測條件，這為開發(fā)特異、敏感、簡捷且更廉價的PRV檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)，對當(dāng)下偽狂犬病的凈化工作有一定的指導(dǎo)意義。