普鳳雅，何開瀟，葉建萍，和慶康，谷書杰，何永宏，楊志清，，3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201）

0 引言

薏苡（Coix lacryma-jobiL.）屬于禾本科（Gramineae）玉蜀黍族（Maydeae）薏苡屬（CoixL.）植物，為《中國(guó)藥典》2020年版收載品種。薏苡被認(rèn)為是藥食兼?zhèn)涞恼滟F良藥，其成分具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的藥用價(jià)值，享有“禾谷類保健滋補(bǔ)之王”的美譽(yù)［1］。近年來(lái)，云南省薏苡的種植面積逐漸擴(kuò)大，薏苡產(chǎn)業(yè)迅速崛起，成為農(nóng)民增收致富的支柱型產(chǎn)業(yè)。但因?yàn)殚L(zhǎng)期以傳統(tǒng)的方式栽培，粗放管理，薏苡的病蟲害日益加重［2］。在薏苡的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間，主要病害有黑穗病、葉斑病、葉枯病，其中薏苡葉斑病主要是在下部老葉先出現(xiàn)病斑，逐步向上部嫩葉蔓延，主要危害植株葉部，造成葉片黃枯，最終導(dǎo)致薏苡產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降［3］。目前，主要是利用化學(xué)藥劑對(duì)薏苡葉斑病進(jìn)行防治［4］，但長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑容易使病原菌產(chǎn)生抗性而導(dǎo)致防治效果降低，也會(huì)有大量農(nóng)藥殘留，危害生態(tài)環(huán)境，威脅人類的健康，還會(huì)導(dǎo)致“3R”問(wèn)題［5］。目前對(duì)農(nóng)作物病蟲害的防治，人們提出了很多措施，其中通過(guò)篩選植物內(nèi)生菌中的生防菌進(jìn)行生物防治是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［6］，例如：苑寶潔等［7］篩選出的解淀粉芽孢桿菌ZF57微粉劑對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的田間防治效果高達(dá)97.12%；冶福春等［8］從燕麥生境中分離獲得的1株生防菌株Qh-618對(duì)燕麥葉斑病的防治效果達(dá)65%以上；甘金佳等［9］研究了用枯草芽孢桿菌防治番茄灰霉病、青枯病、早疫病、立枯病、枯萎病和根腐??；王建鵬等［10］通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出3株芽孢桿菌C-01、C-02、C-05，它們對(duì)藜麥葉斑病的抑菌率分別為45.00%、49.33%、48.33%。

生物防治是有效又綠色環(huán)保的防治方法，能在有效提升農(nóng)業(yè)病蟲害防治效果的基礎(chǔ)上推動(dòng)我國(guó)綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［11］。但在對(duì)薏苡葉斑病的防治研究中，有關(guān)生物防治的文獻(xiàn)仍少見。本研究對(duì)具有典型薏苡葉斑病病斑的師薏1號(hào)帶病植株進(jìn)行分離鑒定，通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出對(duì)薏苡葉斑病有生防效果的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，旨在為進(jìn)一步探索薏苡葉斑病病原菌的分類篩選、生物學(xué)特性及微生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)于2020年9月—2021年12月在云南省高校作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試感病植株取自云南曲靖市師宗縣（師薏1號(hào)）。供試薏苡內(nèi)生細(xì)菌由本課題組從薏苡（文薏2號(hào)）的根、莖、葉中分離保存。

供試病原菌：玉米大斑病原真菌大斑凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、玉米小斑病原真菌玉蜀黍離蠕孢（Bipolaris maydis）、禾谷莖腐病原真菌禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、煙草炭疽病原真菌膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、玉米紋枯病原真菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物防治實(shí)驗(yàn)室提供；甘蔗梢腐病原真菌串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1000 mL；固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入瓊脂17 g；均在121 ℃下滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL；固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入瓊脂17 g；均在115 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 薏苡葉斑病的分離鑒定

1.2.1 病原菌的分離純化 采用組織塊分離法［12］，選取薏苡的感病葉片，從病健交界處切取4～5 mm的感病組織，放入75%的酒精溶液中消毒，浸泡約1 min后使用無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干，接入PDA培養(yǎng)基中，在25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。待PDA平板上長(zhǎng)出疑似病原菌的微菌落后，用無(wú)菌接種針挑取菌落邊緣的菌絲塊，在新鮮的PDA平板上純化培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌致病性的檢測(cè) 利用柯赫氏法［13］對(duì)分離物進(jìn)行致病性測(cè)定。

離體葉片培養(yǎng)：將分離物在PDA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5 d后，選取健康的薏苡葉片，表面用75%的酒精消毒，然后用無(wú)菌針在葉片表面刺傷形成傷口，將上述分離純化的分離物打成菌餅倒貼于刺傷處，重復(fù)3次。接種后保濕，在28 ℃下培養(yǎng)，待葉片發(fā)病后，從病部對(duì)病原菌進(jìn)行再分離，觀察所分離物的形態(tài)特征與原分離物的是否一致。

盆栽噴施：將病原菌培養(yǎng)至產(chǎn)孢狀態(tài)，利用無(wú)菌水配制成一定濃度的孢子懸浮液；將孢子懸浮液噴施在薏苡葉片上，觀察植株是否發(fā)?。淮~片發(fā)病后，從病部對(duì)病原菌進(jìn)行再分離，觀察所分離物的形態(tài)特征與原分離物的是否一致。

1.2.3 病原菌的鑒定 將純化的病原菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色和產(chǎn)孢情況。參照OMEGA真菌DNA小量提取說(shuō)明書進(jìn)行病原菌基因組DNA的提取，利用ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 生防菌的篩選

1.3.1 生防菌的初篩 使用平板對(duì)峙培養(yǎng)法［14］，用打孔器將病原菌絲塊處理成直徑為0.50 cm的菌餅，將菌餅接種到直徑為9.00 cm的PDA板的中心，在離中心3.00 cm的四周，接種不同的薏苡內(nèi)生細(xì)菌。以接種無(wú)菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，在28.0 ℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，測(cè)量抑菌帶的大小。

1.3.2 生防菌的復(fù)篩 在初篩中，將抑菌帶平均寬度大于1.50 cm的內(nèi)生細(xì)菌作為復(fù)篩菌株。將復(fù)篩菌株的菌絲塊處理成直徑為0.50 cm的菌餅，然后將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中心，在離中心3.00 cm的四周，接種其拮抗的薏苡內(nèi)生細(xì)菌。以接種無(wú)菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)；3 d后測(cè)量抑菌圈大小，并計(jì)算抑菌率。

1.3.3 生防菌的廣譜性測(cè)定 對(duì)抑菌率最高的內(nèi)生菌進(jìn)行廣譜性測(cè)定，方法與1.3.2節(jié)中的方法相同。

1.4 生防菌的鑒定

將生防效果最好的菌株在LB培養(yǎng)基上劃線，在35 ℃下培養(yǎng)24 h后，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。使用通用引物27F：AGTTTGATCMTGGCT和1492R：GGTTACCTTGTTACGACT，以及持家基因gyrA的引物GyrA-F（5′-CAGTCAGGAAATGCGT ACGTCCTT-3′）和GyrA-R （5′-CAAGGTAATGCT CCAGGCATTGCT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的片段送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與致病性檢測(cè)

如圖1a所示，將病原菌菌餅放在健康的薏苡葉片上，在28 ℃下培養(yǎng)3 d后，發(fā)現(xiàn)薏苡葉片變黃，表面有斑點(diǎn)，而對(duì)照則無(wú)癥狀。通過(guò)組織塊分離法分離后，在PDA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)物的形態(tài)特征與先前分離得到的Y2一樣，鏡檢觀察到的分生孢子也與Y2一致，說(shuō)明菌株Y2可能引起離體的薏苡葉片發(fā)病。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，將Y2菌株配制成孢子懸浮液，并噴施在薏苡葉片上，結(jié)果如圖1b所示，在噴施10 d后，薏苡葉片枯萎，有感病現(xiàn)象;再分離物的形態(tài)特征和孢子結(jié)構(gòu)也均與Y2一致，符合科赫式法則，表明Y2病原菌對(duì)薏苡葉片有致病作用。

圖1 薏苡葉斑病分離病菌的致病性檢測(cè)結(jié)果

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 如圖2所示，分離得到的Y2病原菌的菌落為圓形，菌落灰褐色，絨毛狀，不易產(chǎn)孢，背面呈淡棕色；分生孢子單生，有隔膜，卵形，屈膝狀彎曲。

圖2 薏苡葉斑病病原菌的形態(tài)特征

2.2.2 ITS序列鑒定 用真菌的通用引物ITS1/ITS4對(duì)Y2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增結(jié)果提交給Gen Bank，與序列相似性較高的模式菌株進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，分離得到的Y2菌株與Curvularia coicis（登錄號(hào)：NR_147457.1）在同一個(gè)分支上，相似度達(dá)89%，因此將Y2鑒定為彎孢霉Curvularia coicis。

圖3 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 生防菌的篩選

2.3.1 生防菌的初篩 由表1可知：共篩選到12株對(duì)薏苡葉斑病病原菌有抑制作用的薏苡內(nèi)生細(xì)菌，抑菌帶均大于1.00 cm；其中菌株R24、L21、R26、L47的抑菌帶均在1.50 cm以上，以L47的抑菌效果最好，抑菌帶達(dá)1.76 cm。

表1 內(nèi)生細(xì)菌菌株與薏苡葉斑病菌平板對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果

2.3.2 生防菌的復(fù)篩 對(duì)初篩中抑菌帶在1.50 cm以上的4株內(nèi)生細(xì)菌菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表2和圖4所示，4株細(xì)菌的抑菌率在65%以上；其中分離自文薏2號(hào)莖稈的L47的抑菌率最高，為73.82%；分離自文薏2號(hào)根系的R24的抑菌率最低，只有66.23%。

圖4 生防菌的復(fù)篩結(jié)果

表2 生防內(nèi)生細(xì)菌菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.3.3 生防菌L47的抑菌廣譜性測(cè)定 經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)分離自文薏2號(hào)莖稈的L47菌株的生防效果最好。采用平板對(duì)峙法對(duì)L47菌株進(jìn)行抑菌譜的測(cè)定，結(jié)果如表3和圖5所示，菌株L47對(duì)玉米紋枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷莖腐病菌、煙草炭疽病菌等都有抑制作用，抑菌率在64%～73%之間。

圖5 L47對(duì)幾種病原真菌的抑制作用

表3 菌株L47的抑菌廣譜性測(cè)定結(jié)果

2.4 生防菌的鑒定

生防菌L47的菌落形態(tài)如圖4和圖6所示，菌落圓形，白色，表面粗糙。對(duì)菌株L47進(jìn)行16S rDNA基因片段擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果提交給Gen Bank，與序列相似性較高的模式菌株進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。結(jié)果顯示：菌株L47與Bacillus subtilis（登錄號(hào)：NR 027552.1：34-989）在同一個(gè)分支上（圖7a），相似度達(dá)96%，為枯草芽孢桿菌。將gyrA基因序列的測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示菌株L47與Bacillussp.（登錄號(hào)：OK564471.1：1-921）的gyrA基因序列最為相似，同源性達(dá)94%（圖7b）。

圖6 生防菌L47的菌落形態(tài)

圖7 菌株L47的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

薏苡葉斑病發(fā)病初期在葉片上出現(xiàn)水漬狀半透明小斑點(diǎn)，周邊為淡黃色暈圈，隨后在水漬狀斑點(diǎn)中心出現(xiàn)1個(gè)白色小點(diǎn)；之后病斑繼續(xù)擴(kuò)大，到拔節(jié)期會(huì)大面積發(fā)病，導(dǎo)致葉片枯萎，植株生長(zhǎng)減弱，產(chǎn)量和品質(zhì)下降［15］。章霜紅［16］將薏苡葉斑病的病原菌鑒定為尾孢（Cercosporasp.）。在本研究中，將感病葉片在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將培養(yǎng)物分離純化、進(jìn)行致病性檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)純化培養(yǎng)物能夠使薏苡葉片發(fā)病；再分離感病植株得到的純化物與Y2的形態(tài)特征、孢子形態(tài)一致；通過(guò)ITS序列擴(kuò)增，將其鑒定為Curvularia coicis［17］。這與Dai等［18］從福建薏苡葉斑病病葉上分離純化得到的病原菌一樣。

生物防治具有無(wú)污染、不會(huì)誘發(fā)抗藥性的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了化學(xué)防治的諸多不足［19］?？莶菅挎邨U菌具有防治植物病害的作用，用枯草芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［20－21］?？莶菅挎邨U菌通過(guò)成功定殖在植物體內(nèi)，分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達(dá)到生防的目的［22－23］。

本研究從已經(jīng)分離得到的薏苡內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株生防細(xì)菌L47，L47對(duì)薏苡葉斑病病原菌的抑菌率為73.82%，低于謝林艷等［24］篩選的YC89對(duì)鐮孢炭疽菌的抑菌率，但高于程萍等［25］篩選的B10b對(duì)石斛蘭葉斑病菌的抑菌率。通過(guò)平板對(duì)峙法測(cè)定生防菌的抑菌廣譜性發(fā)現(xiàn)，L47具有較寬的抑菌譜，對(duì)玉米紋枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷莖腐病菌、煙草炭疽病菌等菌的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用，抑菌率為64.29%～73.68%。利用16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)菌株L47與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性達(dá)到96%；結(jié)合gyrA序列分析，最終將菌株L47鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

目前生防菌的研究大部分集中在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，而有些生防菌株在室內(nèi)培養(yǎng)皿上和田間農(nóng)作物上的防治效果大不相同，因此想要得到生防能力高效且穩(wěn)定的菌株，需要將培養(yǎng)皿篩選、盆栽生防效果以及田間生防效果相結(jié)合。此外，還需要對(duì)菌株的生防機(jī)理、生長(zhǎng)環(huán)境以及基因型進(jìn)行研究，從而為生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究篩選得到1株對(duì)薏苡葉斑病有防治效果的內(nèi)生細(xì)菌L47；發(fā)現(xiàn)L47對(duì)玉米紋枯病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、甘蔗梢腐病菌、禾谷莖腐病菌、煙草炭疽病菌等均有一定的抑制效果；將菌株L47鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。