何鵬搏，李詠梅*，朱自萍，何鵬飛，何月秋，吳毅歆，蔡永占，符宗偉，Munir Shahzad，王軍偉，田陽陽，王云月**

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；2.云南省煙草公司 曲靖市公司，云南 曲靖 655000；3.紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100）

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）在自然界普遍分布，廣泛存在于海洋［1］和土壤，營腐生生活［2］，是土壤中優(yōu)勢(shì)真菌之一［3］，其還可以在植物中內(nèi)生［4］，如在白三葉草［5］、蒜頭果［6］、紅茄莓［7］和霸王鞭［8］中內(nèi)生。它對(duì)農(nóng)藥殘留、廢棄農(nóng)用薄膜、蒽污染和農(nóng)作物秸稈都有很好的降解作用［9］。然而，煙曲霉又是一種機(jī)會(huì)致病菌，它在人畜身體較弱時(shí)，也會(huì)引起疾?。?0］，如它會(huì)引起肺曲霉菌?。?1］，導(dǎo)致患者死亡［12-13］，引起角膜炎［14］等。該菌耐高溫，能在55 ℃下生長［15］，在倉貯中易引起煙草霉變［16］，造成重大損失。為了給煙草霉?fàn)€病防控、人畜疾病控制及為有機(jī)肥發(fā)酵提供科學(xué)依據(jù)，本文開展了煙曲霉菌耐高溫能力和引起霉?fàn)€病溫度研究。

1 材料與方法

1.1 煙草品種和煙曲霉

煙草品種為云煙 105，取其中下部葉柄供接種試驗(yàn)。煙曲霉菌Q-1 （Aspergillus fumigatusQ-1，下稱Q-1）為本實(shí)驗(yàn)室于2018年8月分離自云南省宣威市格宜鎮(zhèn)宜興烤煙合作社烤房煙草霉?fàn)€病樣本，且已被證明它是烘烤期煙葉霉?fàn)€病菌之一。

1.2 煙曲霉Q-1的耐熱性試驗(yàn)

1.2.1 常壓下耐熱性試驗(yàn)

1.2.1.1 菌絲體耐熱性 將在PDA上培養(yǎng)好的Q-1，用0.3 cm打孔器打成菌餅，分別置于裝有100 μL的滅菌水和空的PCR管內(nèi)，將PCR管放入PCR儀（型號(hào)L96+，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）中檢測菌體的耐熱性。溫度設(shè)置為40～95 ℃，以5 ℃為1節(jié)點(diǎn)，共12個(gè)溫度節(jié)點(diǎn)，加熱5 min和10 min，每個(gè)節(jié)點(diǎn)6次重復(fù)。處理過的菌餅加入適量的滅菌水，混勻后，涂布于PDA板上，于37 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)存活率。

1.2.1.2 孢子耐熱性 分生孢子耐熱性分：（1）在空氣中耐熱性：取Q-1的分生孢子1 mg，加入PCR管中，于PCR儀中60～90 ℃處理10 min。（2）在水相中耐熱性：將100 μL的1.5×106CFU/mL孢子液裝入PCR管內(nèi)，于PCR儀中50～95 ℃處理5 min和10 min。2種試驗(yàn)后，PCR管中均加滅菌水稀釋，再涂于PDA板上，于37 ℃下黑暗培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)存活率。以上各處理均重復(fù)6次。

1.2.2 在加壓下的耐熱性試驗(yàn) 將在PDA上培養(yǎng)好的Q-1孢子用滅菌水洗下，混入121 ℃下間歇滅菌40 min和未滅過菌的2種煙草地土壤中，分成1 g裝入試管，置于滅菌鍋（型號(hào)LDZX-75KBX，上海申安醫(yī)療器械廠）中，121 ℃、0.105 MPa下滅菌20、30、35、40、45和50 min，10倍稀釋后涂板于加有10 μg/mL的氯霉素（排除細(xì)菌的干擾）PSA平板上，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)煙曲霉菌落數(shù)。以常溫不滅菌處理為對(duì)照。各處理重復(fù)3次，每重復(fù)包括4個(gè)培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3 高溫處理煙曲霉Q-1的致病性試驗(yàn)

取新鮮的煙草葉柄，各切成長約1 cm的組織塊，置于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，每皿3段。培養(yǎng)皿墊有吸水紙，每皿加7 mL滅菌水保濕。接種Q-1的1.5×107CFU/mL孢子懸浮液100 μL于兩端切口處，再分別置于50、60、65、70、80、90和95 ℃的培養(yǎng)箱中處理10 min后，取出后置于37 ℃保濕4 d，取出觀察發(fā)病情況。各處理均重復(fù)3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌體的耐熱性

2.1.1 在培養(yǎng)基上的耐熱性 將Q-1菌餅分別放入有滅菌水和無滅菌水的PCR管中，于PCR儀上40～95 ℃溫度下加熱5 min和10 min，再放入PDA平板上培養(yǎng)，結(jié)果見表1。Q-1在40～95 ℃溫度范圍內(nèi)，2種時(shí)間段分別處理后，再轉(zhuǎn)入37 ℃下培養(yǎng)，所有處理和重復(fù)的菌餅均長出菌絲和分生孢子，即在95 ℃時(shí)，菌餅上的Q-1仍保存著生命力。

表1 煙曲霉Q-1菌絲體在有水和無水PCR管中的耐熱性

2.2 分生孢子的耐熱性

2.2.1 分生孢子在空氣中的耐熱性 將煙曲霉Q-1分生孢子直接放入離心管中，置于PCR儀中60～90 ℃加熱處理10 min后，涂布于平板培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其仍能長出菌落，表明煙曲霉Q-1分生孢子在60～90 ℃下10 min仍能存活，但存活率隨著溫度升高而下降，至80 ℃和90 ℃時(shí)，存活率僅分別0.14%和0.04%（表2）。

表2 煙曲霉Q-1孢子在不同溫度下處理10 min的 存活情況

2.2.2 分生孢子在水相中的耐熱性 將煙曲霉Q-1分生孢子制作成懸浮液，置于50～95 ℃分別處理5、10 min，培養(yǎng)48 h后，結(jié)果見表3。Q-1在70 ℃及以上溫度處理時(shí)，均未長出菌落；處理5 min時(shí)，在68 ℃處理溫度中，孢子存活率僅為6.25×10-6%；在65 ℃處理溫度中，孢子存活率為 8.75×10-4%；在60 ℃處理溫度中，仍有2.69%孢子存活。處理10 min時(shí)，在68 ℃處理溫度中，無孢子存活；在65℃處理溫度中，孢子存活率為1.25×10-4%；在60 ℃處理溫度中，有0.29%孢子存活；在50 ℃處理溫度中，有63.67%孢子存活。即隨著溫度升高和處理時(shí)間的延長，Q-1分生孢子在水相中存活力下降，其最高耐熱率的培養(yǎng)溫度和時(shí)間分別為68 ℃、5 min。

表3 煙曲霉Q-1孢子液在不同溫度下的存活情況

2.3 煙曲霉在加壓下對(duì)溫度的耐受性

在121 ℃溫度和0.105 MPa大氣壓下，滅菌與未滅菌土壤加入煙曲霉孢子液經(jīng)幾種滅菌時(shí)間處理后，煙曲霉的分生孢子死亡率都達(dá)100%。即煙曲霉雖然能耐高溫，但是在121 ℃高溫和0.105 MPa大氣壓下滅菌20 min及以上都不能存活。

2.4 不同溫度處理的煙曲霉Q-1孢子引起煙草葉柄發(fā)病能力

將Q-1分生孢子懸浮液接種到煙草葉柄切口處，分別置于50～95 ℃的培養(yǎng)箱中處理10 min，培養(yǎng)4 d后葉柄處產(chǎn)生霉?fàn)€病癥狀結(jié)果見表4。接種煙草葉柄在涂布經(jīng)80、90、95 ℃處理10 min的孢子懸浮液后未發(fā)病，而涂布經(jīng)50、60、70 ℃處理的孢子懸浮液后均發(fā)生典型霉?fàn)€病，表明煙曲霉在50～70 ℃的煙草葉柄上仍能存活，孢子具有萌發(fā)和侵染能力。

表4 煙曲霉Q-1孢子液在煙草葉柄上于不同溫度處理10 min的發(fā)病情況

3 討論與結(jié)論

煙草霉?fàn)€病多發(fā)于烘烤過程中的高溫高濕期，即變黃期和定色期，且在通風(fēng)條件不好、密閉的烤房霉?fàn)€病愈發(fā)嚴(yán)重。有研究表明煙曲霉亦是烘烤期煙葉霉?fàn)€病病原之一。本研究結(jié)果表明煙曲霉在較高溫度下仍能較好地存活，即使達(dá)95 ℃時(shí)，菌絲體和孢子仍能存活。總體來說，分生孢子耐受高溫的能力弱于菌絲體，如以菌絲塊置于氣相和水相中，即使95 ℃處理10 min，在37 ℃下培養(yǎng)還能長出菌落，但將純孢子置于水相中68 ℃以上，處理10 min后孢子就不能萌發(fā)。在空氣中，分生孢子即使在80 ℃和90 ℃時(shí)，處理10 min后孢子存活率分別達(dá)0.14%和0.04%。然而，即使在80 ℃以上孢子存活率較低，但其對(duì)于產(chǎn)孢子量大的煙曲霉來說，其侵染潛力仍不可小覷。當(dāng)把孢子液接種到煙葉柄切口處，放置于50～70 ℃溫度下處理10 min，再轉(zhuǎn)到37 ℃下，煙葉柄仍能出現(xiàn)典型的煙曲霉霉?fàn)€病。

張晉卿等［18］采用酵母浸膏培養(yǎng)基研究證明煙曲霉最適宜生長溫度為37 ℃，最高生長溫度為52 ℃；65 ℃處理180 min或70 ℃處理120 min均能使煙曲霉完全失活。但本研究采用水相下處理，在68 ℃下處理10 min后，孢子全部死亡；在空氣中于60 ℃和90 ℃下處理10 min，孢子存活率仍達(dá)86.20%和0.04%，而菌絲體在95 ℃下處理10 min仍能存活。上述結(jié)果表明煙曲霉的耐熱性很強(qiáng)，但筆者與張晉卿等的結(jié)論差異可能來自不同菌株及試驗(yàn)方法的不同所致。

由于煙曲霉是實(shí)驗(yàn)室操作中會(huì)經(jīng)常引起污染，本研究證明它不能耐受在121 ℃和0.105 MPa下的滅菌處理，從而證明實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)煙曲霉污染是來自不嚴(yán)格的無菌操作所致，而不是其耐高溫的緣故。

農(nóng)作物附產(chǎn)品是農(nóng)田有機(jī)質(zhì)重要來源，為了加速該類有機(jī)質(zhì)原料的腐熟，添加腐熟菌種是最常見的方法。然而，大多數(shù)有機(jī)肥發(fā)酵的溫度都不會(huì)超過72 ℃，溫度過高引起發(fā)酵菌功能下降，會(huì)延長發(fā)酵周期。本研究證明煙曲霉菌絲在氣相下于70 ℃中仍能存活，在70 ℃下處理10 min，分生孢子仍然不失侵染煙草葉柄引起霉?fàn)€病的能力，展現(xiàn)了其用于發(fā)酵農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的潛力。