李玉玲，王 勇，蘇來(lái)曼·艾則孜，孫 鋒，伍國(guó)紅

（新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善 838200）

雜交育種技術(shù)既是現(xiàn)代葡萄栽培育種工藝的一項(xiàng)常規(guī)手段，又是目前國(guó)內(nèi)外采用最為普遍、應(yīng)用范圍最為廣泛、有效率高的一種育種技術(shù)［1-2］。雜交后育種取得成功的首要前提就是能夠保證其父本花粉有一定的產(chǎn)量和生活力，因此花粉活力的強(qiáng)弱被認(rèn)為是選取父本的必備條件之一，研究表明,采用花粉離體培養(yǎng)后的萌發(fā)方法所測(cè)定的各種花粉活力的數(shù)據(jù)更加科學(xué)可靠［3-4］。離體萌發(fā)法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)的花粉活力較接近，這一結(jié)論已在許多雜交植物的花粉活力檢測(cè)中得到了驗(yàn)證，該方法是目前雜交育種中花粉活力測(cè)定的首選方法［5-6］。本試驗(yàn)通過(guò)研究溫室和露地條件下葡萄品種不同時(shí)期的花粉活力以及不同貯藏溫度、貯藏時(shí)間對(duì)葡萄品種花粉活力的影響，確定采集花粉的最佳時(shí)期，探討葡萄品種花粉最佳保存時(shí)期和保存條件，為葡萄雜交育種的父本選擇及花粉保存提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄花粉取自新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所葡萄資源與育種課題組溫室和葡萄種質(zhì)資源圃，品種分別為火焰無(wú)核（Flame Seedless)、愛(ài)神玫瑰（Aishen Meigui)、 夏黑（Summer Black) 、陽(yáng)光玫瑰（Shine Muscat grape）、長(zhǎng)穗無(wú)核白（Long-bunch Thompson Seedless）。從生長(zhǎng)健壯的植株上，隨機(jī)挑選10個(gè)發(fā)育正常的花序，分別裝入自封袋中并送到實(shí)驗(yàn)室。用鑷子將花藥脫除，放置于陰涼干燥的地方晾干，用花粉篩篩出花粉備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在溫室和露地2種種植條件下，采集火焰無(wú)核、愛(ài)神玫瑰、夏黑3個(gè)品種的花粉開(kāi)展新鮮花粉萌發(fā)率測(cè)定試驗(yàn)；對(duì)火焰無(wú)核、陽(yáng)光玫瑰2個(gè)品種開(kāi)展開(kāi)花前5 d、有零星小花開(kāi)放、始花期（15%～20%小花開(kāi)放）、盛花期（50%花開(kāi)放）這4個(gè)時(shí)期的花粉活力測(cè)定試驗(yàn)；對(duì)陽(yáng)光玫瑰、火焰無(wú)核、長(zhǎng)穗無(wú)核白3個(gè)品種開(kāi)展在室溫（28～32 ℃）、空調(diào)26 ℃、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃這5種貯藏溫度條件下的花粉活力測(cè)定試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

培養(yǎng)基的配置按照10%蔗糖+10 mg/L硼酸+6.5 g/L瓊脂配制成離體萌發(fā)法培養(yǎng)基，pH值一般設(shè)定為6.0。將配制好的離體萌發(fā)培養(yǎng)基用移液管滴入干凈的載玻片上，待凝固后，用玻璃棒蘸取各葡萄品種的新鮮花粉均勻撒播到該培養(yǎng)基上，將載玻片放在墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，然后置于恒溫箱中25 ℃培養(yǎng)6 h，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率，每個(gè)品種觀察3個(gè)視野以上（每個(gè)視野花粉數(shù)大于30），每個(gè)處理重復(fù)3次。

將干燥的不同葡萄品種花粉分成小份，分別裝入1.5 mL離心管內(nèi)，做好標(biāo)記，用封口膜密封后放入自封袋中，分別置于室溫（28～32 ℃）、空調(diào)26 ℃、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃這5種貯藏溫度下，各貯藏條件下的花粉按照不同貯藏天數(shù)1、8、15、22、29 d分5次取出，接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上，并置于恒溫箱中25 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后觀察花粉的萌發(fā)情況，并計(jì)算花粉萌發(fā)率。

花粉萌發(fā)率（%）=（視野內(nèi)花粉萌發(fā)數(shù)/視野內(nèi)花粉總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 露地和溫室不同葡萄品種花粉活力的比較

由表1可知，不同品種露地栽培的葡萄花粉活力比溫室栽培的要高。3個(gè)品種中火焰無(wú)核在露地和溫室栽培條件下的花粉活力均最高，分別為74.67%、65.46%，而夏黑的花粉活力均最低，分別為4.19%、1.90%，愛(ài)神玫瑰在2種栽培條件下的花粉活力均超過(guò)50%。

表1 露地和溫室不同葡萄品種花粉活力比較

2.2 不同時(shí)期采集對(duì)不同葡萄品種花粉活力的影響

由表2可知，花粉采集時(shí)間對(duì)花粉活力影響較大，且火焰無(wú)核品種的花粉活力在各采集期均高于陽(yáng)光玫瑰的。在開(kāi)花前5 d，火焰無(wú)核的花粉活力只有1.29%，陽(yáng)光玫瑰的花粉活力為2.50%；當(dāng)有零星小花開(kāi)放時(shí)，火焰無(wú)核的花粉活力達(dá)到了54.10%，陽(yáng)光玫瑰的花粉活力達(dá)到了45.62%；始花期火焰無(wú)核的花粉活力最高達(dá)到了74.67%，陽(yáng)光玫瑰的花粉活力達(dá)65.68%；盛花期的花粉活力和始花期的相差不大，火焰無(wú)核的花粉活力為72.35%，陽(yáng)光玫瑰的為66.95%。

表2 火焰無(wú)核和陽(yáng)光玫瑰不同時(shí)期葡萄新鮮花粉活力比較 %

2.3 不同貯藏條件對(duì)不同葡萄品種花粉生長(zhǎng)活力的影響

通過(guò)記錄貯藏期間室內(nèi)溫度變化，明確室溫貯藏溫度范圍為28～32 ℃（圖1），在最低室溫28 ℃、最高室溫32 ℃時(shí)，花粉活力喪失較快，在室溫貯藏1 d后，火焰無(wú)核的花粉活力已降至6.38%，長(zhǎng)穗無(wú)核白、陽(yáng)光玫瑰的花粉活力僅為4.35%、3.26%；在室溫貯藏8 d后，3個(gè)品種的花粉活力均為0。

由表3可知，長(zhǎng)穗無(wú)核白在不同貯藏溫度和不同貯藏時(shí)間的花粉活力總體高于火焰無(wú)核和陽(yáng)光玫瑰的。在同一貯藏天數(shù)條件下，除室溫處理外，其他溫度條件下，各品種的花粉活性差異不大。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)品種的花粉活力逐漸下降，火焰無(wú)核、長(zhǎng)穗無(wú)核白在空調(diào)26 ℃、4 ℃條件下貯藏29 d后，花粉活力為0；陽(yáng)光玫瑰在4 ℃條件下貯藏22 d后，花粉活力為0。在-80 ℃條件下貯藏29 d后，長(zhǎng)穗無(wú)核白、火焰無(wú)核、陽(yáng)光玫瑰的花粉活力仍有4.21%、3.88%、2.91%。綜上，為保證葡萄品種雜交育種，火焰無(wú)核、長(zhǎng)粒無(wú)核白、陽(yáng)光玫瑰的花粉不適宜長(zhǎng)期貯藏，在冷藏冷凍條件下建議貯藏時(shí)間少于15 d為宜，在-80 ℃條件下貯藏時(shí)間不要超過(guò)20 d。

表3 不同貯藏條件對(duì)葡萄花粉活力的影響

3 結(jié)論與討論

父本花粉活力的高低直接影響葡萄雜交育種時(shí)的成功率，花粉活力低是造成葡萄雜交果率低的重要原因之一。本試驗(yàn)檢測(cè)了3個(gè)品種的溫室和露地葡萄花粉的活力，3個(gè)品種在露地時(shí)的花粉活力均明顯高于溫室的，溫室較露地葡萄花粉的萌發(fā)率低,這可能是因?yàn)闇厥覝囟群腿豕鈱?duì)花粉的質(zhì)量有影響，當(dāng)花粉數(shù)量少于一定量時(shí)，不能正常進(jìn)行萌發(fā)，花粉管亦無(wú)法正常進(jìn)行生長(zhǎng)［7］。吳金鳳等［8］對(duì)桃花花粉萌發(fā)率研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著太陽(yáng)光照和強(qiáng)度的減弱桃花粉體的生命力呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。夏黑葡萄的花粉活力相對(duì)偏低，在露地僅為4.19%，三倍體葡萄品種中花粉萌發(fā)率較低，這一現(xiàn)象可能是由于花粉的母細(xì)胞功能發(fā)育不正常而導(dǎo)致的［9］。

在葡萄雜交過(guò)程中，父本的花粉活力是雜交成功與否的一個(gè)關(guān)鍵因素，花粉的采集時(shí)期直接影響花粉活力，采集時(shí)間過(guò)早，花粉不成熟，花粉活力過(guò)低；采集時(shí)間晚，去除開(kāi)花小穗后能用的花粉少，葡萄花粉活力在開(kāi)花前和始花期、盛花期差別較大，始花期的花粉活力明顯高于開(kāi)花前5 d，始花期和盛花期的花粉活力相差不大，因?yàn)殚_(kāi)花前花粉發(fā)育不全，花粉成熟度較差，導(dǎo)致花粉活力低。因此，在父本花期早或父母本基本相同的葡萄品種間進(jìn)行雜交時(shí)，父本花粉最宜從始花期，即已有幾朵花開(kāi)放的花穗上采集，這與楊瑞等［10］的研究結(jié)果一致，也可采集盛花期花粉［11］，從而得到花粉活力高，質(zhì)量好的花粉，還可在未開(kāi)花之前在父本花穗上套上紙袋，用以防止花粉的混雜。

在葡萄雜交育種中經(jīng)常存在父母本花期不一致的情況，可以考慮使用貯藏后的花粉對(duì)其母本授粉，為了更好地保證其雜交授粉的成功率，貯藏后的花粉必須保證其具有一定的活力，所以應(yīng)選擇合理和適宜的葡萄花粉貯藏條件，來(lái)更好地保證葡萄花粉的活力。前人試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄花粉活力除了受到遺傳因素的制約外，還受到自然和環(huán)境因素的影響，濕度、溫度均可以直接影響花粉的活力，選擇合理和適宜的條件可以適當(dāng)保持花粉的活力，從而滿(mǎn)足父母本不同時(shí)期的雜交育種需求［12-13］。杜克兵等［14］將在-20 ℃條件下貯藏1年的楊樹(shù)花粉用于雜交取得了較好效果。本試驗(yàn)選取了3個(gè)葡萄品種測(cè)定了在5個(gè)溫度貯藏條件下的葡萄花粉活力，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，花粉活力整體下降，即在-80 ℃、29 d時(shí)花粉活力最低，降至2.91%；在室溫條件下，即使保存1 d的花粉活力也銳減，這與徐坤［15］在梨花粉上的研究結(jié)論一致，花粉活力隨著處理溫度的升高而顯著下降。在空調(diào)室26 ℃，花粉活力下降減緩，在-20 ℃和-80 ℃貯藏，花粉活力差異不明顯，這與張少偉等［3］的試驗(yàn)結(jié)果不一致。賀普超［16］研究認(rèn)為，當(dāng)葡萄的花粉萌發(fā)率＞6%時(shí)，即可正常用于葡萄雜交育種，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果得出，火焰無(wú)核、長(zhǎng)粒無(wú)核白、陽(yáng)光玫瑰的花粉不適宜長(zhǎng)期貯藏，在冷藏和冷凍條件下建議貯藏時(shí)間少于15 d為宜，在-80 ℃條件下貯藏時(shí)間不要超過(guò)20 d。常溫保存對(duì)葡萄花粉活力的影響特別是高溫對(duì)花粉活力的影響需進(jìn)一步研究。