馬思佳 范 嬌 潘知玉 張紫嫣 薛舜暄 張 昱

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腎病科，北京市 100091)

在全球范圍內(nèi)，腎臟疾病尤其是終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的患者數(shù)量增加，嚴重威脅著人類的健康，并給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)[1]。雖然目前已有一些治療方法可以有效地延緩早期ESRD的進展，但很難延緩?fù)砥贓SRD患者的疾病進程[2]。不論是接受血液透析還是腎臟移植，ESRD患者都需要承受巨大的心理和生理壓力，早期ESRD患者可無明顯不適，但隨著腎功能的進行性下降，毒素在體內(nèi)進一步蓄積，患者可出現(xiàn)惡心、嘔吐、納差、皮膚瘙癢、水腫等表現(xiàn)，并出現(xiàn)認知障礙等一系列并發(fā)癥[3]。

ESRD在中醫(yī)學(xué)中屬“關(guān)格”“癃閉”“虛勞”等范疇，病因病機較為冗雜，多屬虛中夾實，最后進展為陰陽兩虛、臟腑氣血受損。腎位于人體下焦，內(nèi)蘊元陰元陽，是先天之本?！端貑枴に疅嵫ㄕ摗吩啤澳I何以能聚水而生?。酷唬耗I者胃之關(guān)也，關(guān)閉不利，故聚水而從其類也”。飲食水谷入于胃，胃受納之，其中糟粕的部分皆由腎蒸騰氣化而轉(zhuǎn)輸膀胱，排出體外。腎居于下焦，內(nèi)蘊真陰真陽；胃為水谷之海，主腐熟水谷。若腎陽虛弱，元陽虧損，則命門火衰，腎氣化生乏源，腎氣不足則不能推動水液運行，水液停聚，發(fā)為水腫。胃在中焦，其氣主降，水液停聚于內(nèi)，水道不利，則胃氣運行受阻，不得其降，必夾腎之聚水而上逆于胃，發(fā)為嘔吐[4]。脾胃運化失職，升降失司，不能斡旋中焦，則惡心納差。濕濁毒邪犯溢肌膚，則皮膚瘙癢。臨床研究結(jié)果表明，應(yīng)用中醫(yī)藥療法干預(yù)ESRD，在提高透析效果、緩解透析相關(guān)癥狀、改善患者的生活質(zhì)量、降低醫(yī)療費用等方面都具有非常重要的作用[5]。

加味蘇連溫膽湯主要化裁于蘇葉黃連湯與溫膽湯，由蘇葉、黃連、半夏、萆薢、紅花等藥物組成，臨床隨證加減。方中蘇葉性辛、溫，歸肺、脾經(jīng)，其氣辛溫能散，氣薄能通，上走入肺，中走脾胃，外透于肌表，一藥三功，辛、溫、行、散并用。肺主氣，司清肅，對調(diào)整氣化樞機起主導(dǎo)作用，氣機調(diào)達，則升降自如，胃氣乃和。黃連性寒、味苦，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰“黃連主熱氣”。凡藥能去濕者必增熱，能除熱者必不能去濕，唯黃連能以苦燥濕，以寒除熱，一舉而兩得[6]。又因黃連味苦堅陰，可厚腸胃，有一定的止瀉作用。半夏燥濕化痰的同時可以和胃，與萆薢合用宣化濕濁，開通郁結(jié)；血不利則為水，濕濁毒邪充斥三焦，氣滯則水停血瘀，血瘀又會進一步加重水腫，瘀血不去，新血難生，故佐以紅花活血化瘀。諸藥合用，共奏理氣活血、通腑瀉濁之功，可以改善ESRD患者的臨床癥狀，減輕服用激素的副作用并延長患者進入透析的時間。

GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中收錄了眾多生物醫(yī)學(xué)的基因數(shù)據(jù)，內(nèi)含多種疾病的原始基因表達數(shù)據(jù)集和平臺操作記錄，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以預(yù)測藥物活性成分的生物靶點[7]，二者結(jié)合可以從整體上分析加味蘇連溫膽湯治療ESRD的潛在作用機制，可為臨床上應(yīng)用加味蘇連溫膽湯治療ESRD提供參考。

1 材料與方法

1.1 加味蘇連溫膽湯活性成分的篩選 將加味蘇連溫膽湯中的蘇葉、黃連、半夏、萆薢、紅花5種藥物成分，分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中進行成分檢索[8]，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)值≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)值≥0.18作為條件篩選出加味蘇連溫膽湯的活性成分，物種限定為 “Homo sapiens”。

1.2 加味蘇連溫膽湯活性成分潛在作用靶點的獲取 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取加味蘇連溫膽湯活性成分的潛在作用靶點，借助UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)除去沒有相應(yīng)靶點的活性成分，然后應(yīng)用Perl軟件(V5.24.1)為篩選出的靶點添加基因名并規(guī)范靶點的基因名。

1.3 ESRD組織與正常腎臟組織差異基因的獲取 根據(jù)樣本量及相關(guān)條件(樣本量≥20，選擇芯片的表達數(shù)據(jù)陣，選擇物種為人)，在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中選取與ESRD有關(guān)的芯片GSE37171，下載相關(guān)平臺的數(shù)據(jù)后，利用R語言軟件(V3.6.2)設(shè)定篩選條件為P值<0.05、|log2FC|>1，得到ESRD組織與正常腎臟組織的差異基因(簡稱ESRD差異基因)文件“diff”，然后運用R語言軟件中的pheatmap包，分別篩選出上調(diào)與下調(diào)最顯著的20個基因，繪制ESRD差異基因的熱圖，運用R語言軟件中的plot包繪制火山圖。

1.4 藥物靶點與ESRD差異基因的韋恩圖的繪制 利用R語言軟件(V3.6.2)對加味蘇連溫膽湯活性成分的潛在作用靶點與ESRD差異基因取交集，得到的交集基因即為加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點，將映射結(jié)果以韋恩圖的形式展示。

1.5 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和拓撲分析 將1.4中的交集基因?qū)氲紺ytoScape 3.7.0軟件中，構(gòu)建活性成分-疾病靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。使用Bisogenet和CytoNCA兩個插件，構(gòu)建交集基因的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，對交集基因設(shè)置相應(yīng)參數(shù)[度中心度(degree centrality，DC)>61，中間中心度(betweenness centrality，BC)>600)]構(gòu)建相應(yīng)的拓撲網(wǎng)絡(luò)，篩選出度值最高的基因為核心作用靶點。

1.6 功能和通路富集分析 采用R語言軟件(V3.6.2)的“ggplot”和“clusterProfiler”包對得到的交集基因進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析(包括細胞組分、分子功能、生物過程)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，繪制相應(yīng)的柱狀圖和氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 加味蘇連溫膽湯的活性成分及其潛在作用靶點 共篩選得到加味蘇連溫膽湯的活性成分2 763個，其中槲皮素為紅花、黃連共有的有效成分，黃芩苷元為半夏、紅花共有的有效成分。獲得有效活性成分的潛在作用靶點共457個。

2.2 ESRD差異基因 從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE37171芯片及平臺數(shù)據(jù)，共獲得115個樣本，其中正常腎臟組織40個，ESRD組織75個，運用R語言軟件對兩組樣本進行分析，共得到422個ESRD差異基因，其中包括98個上調(diào)基因，324個下調(diào)基因。差異基因熱圖見圖1，火山圖見圖2。

圖1 ESRD差異基因的熱圖

圖2 ESRD差異基因的火山圖

2.3 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點 利用R語言軟件取交集后共獲得10個交集基因(即加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點)，分別為Fos原癌基因轉(zhuǎn)錄因子AP-1亞基(Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit，F(xiàn)OS)、缺氧誘導(dǎo)因子1α亞基(hypoxia-inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)、保守螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域擴散激酶(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase,CHUK)、RAS P21蛋白激活因子1(RAS P21 protein activator 1,RASA1)、晶狀體蛋白ζ(crystallin zeta,CRYZ)、C-X-C基序趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)、α-突觸核蛋白(synuclein alpha,SNCA)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)、E1A結(jié)合蛋白P300(E1A binding protein P300,EP300)、中鏈?；o酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase medium chain,ACADM)。映射結(jié)果的韋恩圖見圖3。

圖3 加味蘇連溫膽湯有效活性成分潛在作用靶點與ESRD差異基因的韋恩圖

2.4 加味蘇連溫膽湯活性成分-疾病靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 將加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點導(dǎo)入CytoScape軟件中，構(gòu)建出活性成分-疾病靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖4)，10個作用靶點對應(yīng)有效成分13個，包括烏索酸、1-檸檬烯、肉豆蔻酸、肉桂醛、黃芩苷元、芹黃素、孕酮、槲皮素、薯蕷皂甙元、蛇床子素、辛酸、乙酸葑酯、迷迭香酸，其中10個來自于蘇葉，1個來自于萆薢，2個為多種藥物共有，如圖4所示。其中槲皮素(MOL000098)對應(yīng)的靶點最多，可認為槲皮素是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的關(guān)鍵作用成分。

圖4 加味蘇連溫膽湯活性成分-疾病靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.5 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點的拓撲網(wǎng)絡(luò) 將加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點導(dǎo)入到CytoScape 3.7.0軟件中，使用Bisogenet和CytoNCA兩個插件，構(gòu)建交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖5(1)。將DC設(shè)置為>61，BC設(shè)置為>600，構(gòu)建其拓撲網(wǎng)絡(luò)，共得到7個候選基因，如圖5(3)。其中EP300的度值最高，提示EP300是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的核心作用靶點。

圖5 加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點的拓撲網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程

2.6 GO功能富集分析結(jié)果 GO功能富集分析結(jié)果顯示，加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點共涉及399種生物過程、10種分子功能、1種細胞組分。其中生物過程包括細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等，分子功能包括Tau蛋白連接等，細胞組分為轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物。見圖6、圖7、圖8。

圖6 GO功能富集分析-生物過程分析結(jié)果

圖7 GO功能富集分析-分子功能分析結(jié)果

圖8 GO功能富集分析-細胞組分分析結(jié)果

2.7 KEGG通路富集分析結(jié)果 KEGG富集分析結(jié)果顯示，加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點主要涉及脂肪酸降解通路，以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路，氣泡圖見圖9。

圖9 KEGG通路氣泡圖

3 討 論

ESRD的主要病因是腎小球腎炎、慢性間質(zhì)性腎炎、糖尿病腎病和高血壓腎硬化等，涉及的病理變化包括腎小球間質(zhì)纖維化、局灶性和節(jié)段性腎小球硬化、腎小管萎縮等[9]。晚期ESRD患者多會進入到尿毒癥階段，即慢性腎臟病腎功能衰竭的終末階段。腎臟的濾過和代謝功能減退、毒素堆積及腎臟內(nèi)分泌功能障礙均會引發(fā)電解質(zhì)紊亂、酸堿代謝失衡和水鈉潴留等現(xiàn)象，嚴重者可危及生命。目前，除腎移植和腹膜透析治療外，維持性血液透析是延長大部分晚期ESRD患者生存期的主要方法[10]。雖然應(yīng)用透析治療有助于提高ESRD患者的生存率，但與普通人群相比，這些患者的生活質(zhì)量明顯降低[11]，且透析并不能解決全部問題，ESRD患者常伴有多種并發(fā)癥，如腎性貧血、皮膚瘙癢、納差、惡心嘔吐、不寧腿綜合征、高血壓等，且至后期更為明顯，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。然而，目前臨床亦缺乏有效的針對性靶向治療。

中藥復(fù)方的組合形式往往多種多樣，每一味藥物含有的有效活性成分不同，在治療疾病時具有多成分、多靶點、多通路的作用特點。中藥復(fù)方往往是治療ESRD這類受多種病理機制共同影響的疾病的重要方法，并且具有服用方便、副作用小的優(yōu)勢，能有效地緩解癥狀，從而提高患者的生活質(zhì)量。但由于中藥復(fù)方成分、治療靶點、作用機制均復(fù)雜，傳統(tǒng)藥理學(xué)方法很難從整體的角度探討加味蘇連溫膽湯的潛在生物學(xué)機制，尤其是相互關(guān)聯(lián)的生物分子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。而生物信息學(xué)的方法可以很好地解決這一問題。因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法，尋找藥物與疾病的共同基因，探討中藥復(fù)方多途徑治療ESRD的分子靶點及作用機制，以期進一步促進其在臨床上的應(yīng)用與相關(guān)機制的研究。

本研究共篩選出加味蘇連溫膽湯治療ESRD的10個作用靶點，及其對應(yīng)的13個活性成分，主要活性成分包括槲皮素、孕酮、黃芩苷元、芹黃素等，其中槲皮素對應(yīng)多個作用靶點，如FOS、HIF-1α、CHUK、RASA1α、EP300等，提示槲皮素很可能是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的關(guān)鍵多效活性化合物。槲皮素具有抗氧化、抗炎癥、抗應(yīng)激反應(yīng)等作用，Yang等[12]發(fā)現(xiàn)，槲皮素除了可預(yù)防腎小管損傷和慢性間質(zhì)炎癥，還具有預(yù)防蛋白尿和改善腎功能的作用，其可劑量依賴性地抑制成纖維細胞生長因子23和甲狀旁腺激素，這兩種物質(zhì)在調(diào)節(jié)腎臟的鈣和磷含量中都起著至關(guān)重要的作用，而調(diào)節(jié)血液中的鈣、磷含量對于治療腎性骨病也有一定作用。研究顯示，與其他性激素相比，內(nèi)源性孕酮可增強女性對腎損害的抵抗，外源性孕酮也具有顯著的抗氧化和腎保護作用，孕酮主要通過存在于腎單位中的膜孕酮受體α和γ發(fā)揮腎保護作用，參與調(diào)節(jié)腎功能，對缺血再灌注所致的大鼠急性腎損傷起著保護腎臟的作用[13]。而黃芩苷元也被證實可減少晚期氧化蛋白產(chǎn)物的積累，具有下調(diào)炎癥細胞因子表達，以及保護腎小管上皮細胞免受氧化應(yīng)激損傷的作用[14]。芹黃素則可在體內(nèi)外發(fā)揮改善腎功能的作用，不僅可防止腎小管細胞凋亡，還能夠減輕腎缺血再灌注損傷后腎小管細胞壞死、胞漿空泡化、腎小管上皮細胞空泡化等嚴重的腎損傷表現(xiàn)[15]。加味蘇連溫膽湯對ESRD的治療作用可能與上述成分具有保護腎臟的作用有關(guān)。

本研究共獲得10個加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用靶點，分別為FOS、HIF-1α、CHUK、RASA1、CRYZ、CXCR4、SNCA、TLR4、EP300、ACADM；為了得到更精準的結(jié)果，在PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中，通過設(shè)置DC與BC兩個參數(shù)，最終確定了以EP300、BRCA1、TP53、ESR1、HSP90AA1、CUL3、NTRK1為主要基因的拓撲網(wǎng)絡(luò)，其中EP300的度值最高，提示EP300是加味蘇連溫膽湯治療ESRD的核心作用靶點。研究表明，EP300是人類纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)肌成纖維細胞的多種生物過程，并在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與降解過程中發(fā)揮重要作用，可以導(dǎo)致腎臟纖維化[16-17]。在腎細胞癌的細胞中，EP300與穩(wěn)定的低氧誘導(dǎo)因子1形成復(fù)合物，參與調(diào)控與腎透明細胞癌進展相關(guān)的基因編碼因子的表達，如血管內(nèi)皮生長因子、碳酸酐酶9和促紅細胞生成素[18]。加味蘇連溫膽湯可能是通過調(diào)控EP300來發(fā)揮抗腎臟纖維化、抑制血管內(nèi)皮生長因子表達、減少細胞外基質(zhì)沉積的作用。

GO富集分析結(jié)果顯示，加味蘇連溫膽湯治療ESRD的作用與細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過程，轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等細胞組分，以及Tau蛋白連接等分子功能相關(guān)。氧化應(yīng)激是指引起細胞損傷的高度反應(yīng)性氧化分子的累積效應(yīng)[19]，其參與了IgA腎病的發(fā)病機制[20]，也可作為炎癥機制的重要組成部分對ESRD患者發(fā)生貧血有一定影響，是導(dǎo)致血液透析患者尿毒癥發(fā)生率和病死率升高的主要因素[21]。復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子是能夠以序列特異性方式結(jié)合DNA并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的一系列蛋白質(zhì)。例如，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α是一種控制線粒體生物發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子，在一些腎臟疾病中具有保護腎臟的作用，可以減輕因線粒體變化而引起的急性腎損傷[22]。血管轉(zhuǎn)錄因子ETS原癌基因1轉(zhuǎn)錄因子(ETS proto-oncogene 1 transcription factor，ETS-1)是受血管緊張素Ⅱ調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，研究表明血管緊張素Ⅱ?qū)δI纖維化、炎癥和氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)作用，有一部分是通過ETS-1介導(dǎo)的；ETS-1還參與了急性腎衰竭中腎小管再生的調(diào)控，而減少腎臟表達的ETS-1可以預(yù)防高血壓相關(guān)的腎臟損傷[23]。Tau蛋白是一種多功能蛋白，屬于與微管結(jié)合的原生未折疊微管相關(guān)蛋白家族，參與微管的組裝并維持其穩(wěn)定，廣泛表達于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，但也存在于腎臟、肺和睪丸[24]。既往有關(guān)Tau蛋白的研究多是針對阿爾茨海默病的，但本研究結(jié)果提示Tau蛋白可能也與慢性腎臟病的發(fā)生有關(guān)。

KEGG分析結(jié)果顯示，加味蘇連溫膽湯主要是通過調(diào)節(jié)脂肪酸降解通路，以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路來治療ESRD。炎癥和代謝失調(diào)是腎臟疾病最重要的特征。體外實驗表明，脂肪酸氧化調(diào)節(jié)因子可以抑制腎小管上皮細胞腺嘌呤核苷三磷酸耗竭、細胞死亡、腎小管上皮細胞去分化和細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，而恢復(fù)脂肪酸代謝，可以保護小鼠免受腎小管間質(zhì)纖維化的影響[25]。脂肪酸結(jié)合蛋白4在 IgA腎病患者腎小球組織中的表達水平顯著高于無內(nèi)皮增生性病變的患者[26]。此外，腎臟參與了氨基酸代謝的過程，其能夠精細調(diào)控循環(huán)組織池中的氨基酸，對體內(nèi)氨基酸的代謝平衡起到至關(guān)重要的作用；當(dāng)腎臟功能受損時易發(fā)生氨基酸代謝紊亂，其中，腎實質(zhì)發(fā)生病變時血漿中氨基酸譜亦會發(fā)生改變[27]。研究表明，2～3期慢性腎臟病患者體內(nèi)瓜氨酸含量明顯升高，而色氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸等必需氨基酸，以及氨基丁酸、甘氨酸等非必需氨基酸含量均明顯降低[28]。同時，糾正患者體內(nèi)的氨基酸代謝平衡，也是維持腎臟功能的重要手段。

綜上所述，加味蘇連溫膽湯中的多種活性成分可能通過與EP300、FOS、HIF-1α等10個交集基因相互作用，調(diào)控細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過程，轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等細胞組分，Tau蛋白連接等分子功能，進而單獨或者共同調(diào)控脂肪酸降解通路及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路來發(fā)揮治療ESRD的作用。但既往的研究極少涉及本研究獲得的KEGG通路，今后可進一步研究這些通路在ESRD治療中的作用。由于本研究為基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的研究，加味蘇連溫膽湯的具體有效成分及其作用機制還有待更深入、更細化地挖掘，并需要進行相關(guān)實驗佐證。