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        蘆丁對全氟辛酸所致的小鼠脂代謝紊亂及腎臟損傷的改善作用▲

        2022-11-04 11:12:18王廣胤孫偉強馬新壯
        廣西醫(yī)學 2022年17期
        關鍵詞:小鼠血清水平

        王廣胤 孫偉強 馬新壯 王 力,

        (1 蚌埠醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室,安徽省蚌埠市 233030;2 慢性疾病免疫學基礎與臨床安徽省重點實驗室,安徽省蚌埠市 233030)

        全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)是一種應用廣泛的全氟類化合物,由于PFOA具有穩(wěn)定的C-F鍵,故其具有極高的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性。PFOA是一種常見的表面活性劑,存在于不粘炊具的金屬涂層,以及紡織品、紙張、清潔和個人護理產(chǎn)品(如洗發(fā)水、牙線)等的表面涂層中[1],PFOA釋放到環(huán)境中能夠抵抗物理或化學機制的降解,對環(huán)境造成持續(xù)和廣泛的污染[2-3]。人們可通過使用含PFOA產(chǎn)品或攝入受污染的水和食物接觸到PFOA。研究表明,PFOA在機體中難以代謝排出,經(jīng)腸肝循環(huán)吸收后,主要分布到腎臟和肝臟[4]。PFOA暴露會對多種器官造成損傷,可能與PFOA抑制脂質轉運、炎癥和免疫相關基因的表達有關[5]。類黃酮是一類分子量較低的多酚類植物化學物質,蘆丁屬于典型的類黃酮,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗凝血、預防和治療心腦血管疾病等藥理作用[6-8]。蘆丁屬于維生素P,主要存在于日常食用的蔬菜、水果和中草藥,其以各種形式被用于食品制造,例如著色劑、抗氧化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、紫外線吸收劑等,同時也是用于制作藥物、化妝品、化學工業(yè)用品及動物飼料的活性成分[9]。已有研究表明,蘆丁可通過減輕氧化應激和修復腎小管損傷來改善腎功能[10],對糖尿病腎病[11]、缺血再灌注腎損傷[12]及藥物性腎損害[13]等具有顯著的改善作用。本研究探討蘆丁對PFOA誘導的小鼠腎臟損傷的保護作用,為蘆丁的藥用研究提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料和儀器 蘆丁(純度≥98%)購自北京百靈威科技有限公司(批號:153-18-4);PFOA(純度≥98%)購自Sigma-Aldrich公司(批號:335-67-1);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測定試劑盒(微孔法,批號:20200706)、總膽固醇測定試劑盒(單試劑GPO-PAP法,批號:20210120T)、三酰甘油測定試劑盒(單試劑GPO-PAP法,批號:20210118)、HDL-C測定試劑盒(批號:20210123)、LDL-C測定試劑盒(批號:20210119)、尿素測定試劑盒(批號:20210125)、肌酐測定試劑盒(20210108)等均購自深圳雷杜生命科學股份有限公司。ME203E/02型電子天平購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司,KZ-Ⅱ型高通量組織研磨儀購自Servicebio公司,Synergy2型酶標儀購自BioTek公司,KDC-160HR型高速冷凍離心機購自科大創(chuàng)新公司,Chemray 800型全自動生化分析儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司。

        1.2 動物分組與干預方法 雄性ICR小鼠15只,鼠齡4~6周,初始體重為(25±5)g,購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場[動物合格證號:SCK(豫)2019-0003]。將小鼠飼養(yǎng)于干凈的籠子中,溫度適宜,光照/黑暗時間為12 h/12 h,自由獲取水和標準動物飼料。適應性喂養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表法將15只小鼠分為對照組、PFOA組、PFOA+蘆丁組,每組5只。對照組:每日上午9時稱重后,按5 mL/(kg·d)給予灌胃ddH2O,1次/d。PFOA組:每日上午9時稱重后,按20 mg/(kg·d)給予灌胃PFOA溶液,灌胃體積為5 mL/(kg·d),1次/d。PFOA+蘆丁組:每日上午9時稱重后,按20 mg/(kg·d)給予灌胃PFOA溶液,灌胃體積 5 mL/(kg·d),1次/d;每日下午3時按20 mg/(kg·d)給予灌胃蘆丁溶液,灌胃體積5 mL/(kg·d),1次/d。3組均連續(xù)灌胃處理14 d,實驗期間每天在相同時間點記錄小鼠的體重及基礎生命體征。

        1.3 標本制備 小鼠連續(xù)給藥處理14 d后稱重并記錄,穿刺眼眶靜脈采血0.5~1.0 mL,室溫下以3 500 r/min離心15 min獲取血清,4 ℃下儲存待檢;采血后采用頸椎脫臼法處死小鼠,剝離兩側腎臟,4%多聚甲醛固定腎組織24 h。

        1.4 組織病理學觀察 (1)通過HE染色觀察腎臟結構。取部分腎臟組織,經(jīng)脫水后石蠟包埋,以5 μm厚度連續(xù)切片,進行常規(guī)HE染色,中性樹膠封片,于光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。(2)通過基底膜過碘酸六胺銀(periodic acid-silver metheramine,PASM)染色觀察腎小球毛細血管基膜、紅細胞和細胞核的分布和病變程度。取部分腎臟組織,經(jīng)脫水后石蠟包埋,以5 μm厚度連續(xù)切片,切片脫蠟至水,0.5%高碘酸氧化液浸泡20 min,蒸餾水洗滌,室溫下浸入六胺銀工作液中1.5~2 h,蒸餾水洗滌后依次用氯化金、核固紅、馬休黃染色,溫箱烤干,二甲苯透明,中性樹膠封固,光學顯微鏡下觀察并拍照。

        1.5 血清生化指標的檢測 嚴格按試劑盒操作要求,采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酐水平及LDH活性。

        1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗,重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1 3組小鼠的體重變化 3組小鼠的體重比較,差異有統(tǒng)計學意義(F組間=21.746,P組間<0.001),3組的體重均無隨時間變化的趨勢(F時間=2.210,P時間=0.132),分組與時間有交互效應(F交互=10.574,P交互<0.001)。從干預第6天開始,PFOA組和PFOA+蘆丁組小鼠的體重均低于對照組(均P<0.05),而PFOA組與PFOA+蘆丁組比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

        表1 干預期間3組小鼠體重的變化情況(x±s,g)

        2.2 3組小鼠腎臟組織的HE染色結果 HE染色結果提示,對照組小鼠的腎小球外形規(guī)則飽滿,形態(tài)正常,毛細血管袢薄而清晰,腎小囊邊界清晰,系膜細胞和內皮細胞正常,腎小管和收集管形態(tài)正常,未見腎小球硬化、腎間質炎癥反應和纖維化;與對照組相比,PFOA組小鼠腎臟出現(xiàn)明顯的結構性損傷,腎小球體積增大,系膜細胞和內皮細胞增生,腎小管上皮細胞水腫、脫落,出現(xiàn)輕度空泡樣變性;而與PFOA組相比,PFOA+蘆丁組小鼠腎臟組織的結構性損傷明顯減輕。見圖1。

        圖1 3組小鼠腎臟組織的HE染色結果(皮質,×1000;髓質,×400)

        2.3 3組小鼠腎臟組織的PASM染色結果 PASM染色結果提示,對照組小鼠的腎皮質、髓質分界清晰,腎小管基底膜形態(tài)正常,無增厚、皺縮,腎間質清晰;與對照組相比,PFOA組小鼠的腎皮質、髓質分界較清晰,腎小球系膜增厚,腎小球基底膜增厚,腎小管基底膜增厚、皺縮,近端小管刷狀緣消失;而與PFOA組相比,PFOA+蘆丁組小鼠的腎臟基底膜損傷情況明顯減輕。見圖2。

        圖2 3組小鼠腎臟組織的PASM染色結果(×400)

        2.4 3組小鼠血清三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C水平的比較 3組小鼠的血清總膽固醇、LDL-C水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),其中,PFOA組的血清總膽固醇、LDL-C水平均高于對照組,PFOA+蘆丁組的血清總膽固醇、LDL-C水平均低于PFOA組(均P<0.05),而PFOA+蘆丁組與對照組的血清總膽固醇、LDL-C水平比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。3組小鼠的血清三酰甘油、HDL-C水平比較,差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

        表2 3組小鼠血清三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、LDL-C水平的比較(x±s,mmol/L)

        2.5 3組小鼠血清尿素、肌酐水平及LDH活性的比較 3組小鼠的血清尿酸、肌酐水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),其中,PFOA 組血清尿素水平高于對照組,血清肌酐水平低于對照組,而PFOA+蘆丁組血清尿素水平低于PFOA組,血清肌酐水平高于PFOA組(均P<0.05)。3組小鼠的血清LDH活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

        表3 3組小鼠血清尿素、肌酐水平及LDH活性的比較(x±s)

        3 討 論

        流行病學研究表明,腎臟疾病與環(huán)境污染物暴露程度有關[14]。近年來,多項研究表明PFOA與腎臟功能障礙、腎臟組織學改變之間存在關聯(lián)性[15-16]。有學者報告,PFOA暴露易造成小鼠的腎臟損傷,主要表現(xiàn)在體重及腎臟組織形態(tài)學變化等方面[5]。本研究結果顯示,PFOA暴露可造成小鼠腎臟損傷,表現(xiàn)為小鼠血清尿素水平升高,以及腎臟發(fā)生顯著病理學改變,如腎小球體積增大、系膜細胞和內細胞增生、腎小管上皮細胞水腫、脫落纖維結構紊亂等;且PFOA暴露可誘導腎臟脂質代謝異常,表現(xiàn)為血清總膽固醇、LDL-C水平升高,與既往文獻報告的結果[17-18]相似。同時,PFOA暴露可導致小鼠體重降低,這可能與其造成脂質代謝紊亂有關。血清肌酐是廣泛用于評估腎功能的標志物之一,但血清肌酐濃度易受年齡、性別、肌肉質量和飲食等諸多非腎臟因素的影響[19]。本研究中,PFOA組小鼠的血清肌酐水平降低,與臨床上腎功能損傷可導致血清肌酐水平升高的現(xiàn)象不一致,原因可能是PFOA影響能量代謝平衡造成糖、脂質和蛋白質代謝紊亂,導致肌肉萎縮、質量下降,最終導致血清肌酐水平降低[20],但具體的原因仍需進一步研究明確。

        臨床研究表明,蘆丁具有抗炎、抗氧化、降低血清膽固醇水平、抑制血小板聚集等多方面作用[21-23]。Qu等[24]采用蘆丁干預萬古霉素所致的腎臟損傷小鼠模型,發(fā)現(xiàn)蘆丁對小鼠腎臟損傷具有改善作用,可減輕萬古霉素誘導的氧化應激、炎癥和細胞凋亡;Rakshit等[25]研究發(fā)現(xiàn),蘆丁可顯著降低腎組織中三酰甘油和膽固醇水平;Chen等[26]研究報告,蘆丁可增加高尿酸血癥小鼠24 h肌酐的排泄,降低其血清肌酐和尿素氮水平,發(fā)揮改善腎功能的作用。本研究結果顯示,與PFOA組相比,PFOA+蘆丁組小鼠腎臟組織的結構性損傷和腎臟基底膜損傷明顯減輕,血清總膽固醇、LDL-C、尿素水平均降低(均P<0.05)。這提示蘆丁對PFOA所致的小鼠腎臟結構和功能的損傷均有明顯的改善作用,其機制可能與蘆丁參與調節(jié)脂質代謝,以及通過調節(jié)腎臟有機離子轉運蛋白發(fā)揮其降尿酸作用有關[27]。值得注意的是,本研究中PFOA+蘆丁組小鼠同樣出現(xiàn)體重降低的現(xiàn)象,這可能與蘆丁具有減輕體重、調節(jié)脂質代謝的作用[28]有關。

        綜上所述,蘆丁可改善PFOA造成的小鼠腎臟病理學變化和腎功能損傷,對小鼠腎臟具有一定的保護作用,并有助于調節(jié)其脂質代謝。

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