林曉琴 唐冬艷 周海燕 李衛(wèi)紅

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)1 研究生學(xué)院，2 護(hù)理學(xué)院，廣西南寧市 530001)

近年來，不孕癥的發(fā)生率呈逐年增高趨勢，其中輸卵管因素占女性繼發(fā)性不孕病因的30%～50%，以慢性輸卵管炎為主[1]。輸卵管炎性不孕癥是指受淋病奈瑟菌、結(jié)核桿菌、衣原體等病原體感染，宮腔、腹腔內(nèi)手術(shù)操作等頻繁刺激，輸卵管黏膜損傷進(jìn)而引起粘連、閉鎖、堵塞、積水、積膿等，輸卵管結(jié)構(gòu)和功能破壞導(dǎo)致的不孕[2]。古籍中無輸卵管炎性不孕癥的病名，根據(jù)其癥狀和體征，可歸屬于“不孕”“婦人腹痛”“癥瘕”等范疇。為了改善妊娠結(jié)局，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用經(jīng)期抗炎、藥物通液、選擇性輸卵管造影及復(fù)通術(shù)、宮腹腔手術(shù)等多種方式促使輸卵管再通及蠕動功能恢復(fù)，這些治療方法常能快速起效，復(fù)通率高，但常存在輸卵管炎癥反復(fù)、輸卵管再阻塞、妊娠率低等問題[2-4]。中醫(yī)學(xué)遵循辨證論治原則，善于運用內(nèi)服、外敷、灌腸或針灸等方式改善輸卵管微環(huán)境，恢復(fù)其功能，具有療效確切、無創(chuàng)傷、痛苦小等優(yōu)點[5]。因此，本研究通過梳理近30年中藥復(fù)方治療輸卵管炎性不孕癥的臨床研究文獻(xiàn)，總結(jié)其用藥規(guī)律，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法從藥物的作用靶點等方面挖掘藥物治療輸卵管炎性不孕癥的潛在作用機制，以期為輸卵管炎性不孕癥的臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及檢索方式 檢索中國知網(wǎng)、萬方、維普三大數(shù)據(jù)庫收錄的中醫(yī)藥治療輸卵管炎性不孕的相關(guān)文獻(xiàn)，檢索時間為1990年1月至2020年12月。檢索方式：選擇“高級檢索”，以“輸卵管炎”“不孕癥”“輸卵管炎性不孕癥”“中醫(yī)”“中藥”“中醫(yī)藥”等為主題詞進(jìn)行檢索，對檢索出的文獻(xiàn)以人工篩查的方式嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)明確診斷為輸卵管炎性不孕者；(2)文獻(xiàn)干預(yù)措施主要采用內(nèi)治法，同時聯(lián)合西藥、灌腸、針灸、理療等治療方法；(3)文獻(xiàn)信息完整，具有明確的藥物組成和詳細(xì)劑量；(4)收錄處方均為中醫(yī)內(nèi)服湯藥；(5)試驗結(jié)果提示療效明確；(6)重復(fù)使用同一中藥處方的文獻(xiàn)以1篇計；(7)隨癥加減藥物的處方僅納入主方(基本方)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)僅描述方名而未羅列藥物組成和劑量的文獻(xiàn)；(2)會議論文、學(xué)位論文、文獻(xiàn)綜述、動物實驗等文獻(xiàn)。

1.3 中藥名稱的規(guī)范化處理 參照2015版《中華人民共和國藥典》[6]及《中藥學(xué)》[7]，對藥材名稱及因炮制或加工方法不同等導(dǎo)致的差異進(jìn)行規(guī)范處理，例如“元胡”統(tǒng)一為“延胡索”，“仙靈脾”統(tǒng)一為“淫羊藿”，“忍冬藤”統(tǒng)一為“銀花藤”等。

1.4 數(shù)據(jù)錄入與核對 利用Excel建立“輸卵管炎性不孕癥處方用藥”數(shù)據(jù)庫，采用二分類變量形式，對文獻(xiàn)中出現(xiàn)的中藥賦值為1，沒有出現(xiàn)的中藥賦值為0，并進(jìn)行藥物頻次分析、高頻藥物的藥效頻次和性味歸經(jīng)頻次分析，為確保錄入處方用藥信息準(zhǔn)確無誤，由雙人錄入并交叉檢查。采用SPSS Clementine 12.0軟件中的Apriori算法建模，建立“數(shù)據(jù)源→類型→Apriori→網(wǎng)絡(luò)”的關(guān)聯(lián)規(guī)則數(shù)據(jù)流，根據(jù)支持度和置信度，對高頻藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析[8]。應(yīng)用SPSS 25.0對高頻藥物進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

1.5 生物信息學(xué)分析 將組方規(guī)律分析得到的核心中藥配伍錄入到BATMAN-TCM系統(tǒng)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，設(shè)定預(yù)測目標(biāo)(候選目標(biāo))得分≥每個成分得分分界的20%，將“Adjust P-value”設(shè)為0.05，篩選出核心中藥配伍所含化學(xué)成分及其潛在作用靶點，并對靶點進(jìn)行疾病富集分析和信號通路分析[9]。

2 結(jié) 果

2.1 藥物頻次分析結(jié)果 共納入有效臨床處方138首，包含中藥168味，累計用藥頻次1 699次，使用頻次≥15次(高頻次)的中藥有34味，排名前10位的中藥依次為當(dāng)歸、赤芍、丹參、三棱、路路通、桃仁、莪術(shù)、香附、川芎、穿山甲，見表1。

表1 治療輸卵管炎性不孕癥的高頻次中藥

2.2 高頻藥物的藥效頻次 對34味高頻次藥物按中藥功效進(jìn)行分類統(tǒng)計，共得到有效數(shù)據(jù)1 240條(即34味中藥的總用藥頻次)，涉及的中藥類別主要有活血化瘀藥、清熱藥、補虛藥、行氣藥、祛風(fēng)濕舒經(jīng)活絡(luò)藥、解表藥、利濕藥，其中位居前3名的依次為活血化瘀藥、清熱藥、補虛藥，見表2。

表2 高頻藥物的藥效頻次統(tǒng)計

2.3 高頻藥物的性味歸經(jīng)頻次 對34味高頻藥物的性味歸經(jīng)頻次的分析結(jié)果顯示，藥物的藥性以寒性(493次)、溫性(392次)居多，藥味以苦味(790次)常見，其次為辛味(741次)，歸經(jīng)主歸肝經(jīng)(1 045次)、心經(jīng)(513次)。見圖1、圖2、圖3。

圖1 高頻藥物的四氣頻次分布

圖2 高頻藥物的五味頻次分布

圖3 高頻藥物的歸經(jīng)頻次分布

2.4 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律 運用SPSS Clementine 12.0軟件對處方中34味高頻中藥通過Apriori 算法進(jìn)行建模，設(shè)置支持度>15%，置信度>80%，最大前項數(shù)為5，共得到17條藥物組合，其中4條為二階關(guān)聯(lián)藥物組合、13條為三階關(guān)聯(lián)藥物組合(見表3、表4)，并以網(wǎng)絡(luò)展示結(jié)果(見圖4)。規(guī)則組合的提升度越大表明關(guān)聯(lián)性越強[9]，所得藥物組合的提升度均>1，其中莪術(shù)→三棱藥對的支持度最高，說明其為治療輸卵管炎性不孕癥的核心藥對。

表3 二階關(guān)聯(lián)藥物組合及其關(guān)聯(lián)規(guī)則

表4 三階關(guān)聯(lián)藥物組合及其關(guān)聯(lián)規(guī)則

圖4 高頻藥物的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

2.5 高頻藥物的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果 針對34味高頻藥物，利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行R型聚類分析，輸出樹狀圖，見圖5。因聚類具有無監(jiān)督的特點，因此結(jié)合臨床將34味高頻中藥聚為7組核心組方較為合適，見表5。

圖5 高頻藥物的聚類分析樹狀圖

表5 聚類分析結(jié)果

2.6 核心藥物的作用機制

2.6.1 莪術(shù)→三棱核心藥對的疾病富集分析結(jié)果：在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中以“E Zhu”“San Leng”為關(guān)鍵詞，得到三棱、莪術(shù)有明確結(jié)構(gòu)信息的化學(xué)成分32種(對應(yīng)的作用靶點共1 131個)，無結(jié)構(gòu)信息的化學(xué)成分17種(無作用靶點)。通過對上述1 131個作用靶點進(jìn)行疾病富集，得出與三棱、莪術(shù)作用靶點相關(guān)的疾病共419種，其中潛在靶點>6個的疾病共24種，見表6。

表6 莪術(shù)→三棱核心藥對的疾病富集分析結(jié)果

2.6.2 莪術(shù)→三棱核心藥對的潛在作用信號通路：BATMAN-TCM 在線分析系統(tǒng)顯示，與三棱、莪術(shù)作用靶點相關(guān)的生物學(xué)通路共185條，其中潛在靶點數(shù)≥20個的通路有21條(見表7)，其中最有可能在治療輸卵管炎性不孕癥中發(fā)揮作用的信號通路是磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、叉頭框O(forkhead box O,FOXO)、瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)信號通路。三棱、莪術(shù)的靶點-通路-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖見圖6。

表7 KEGG信號通路分析

圖6 靶點-通路-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

近年來，輸卵管炎性不孕癥的發(fā)生率逐年增加，其作為不孕癥的主要類型，具有遷延難愈的特點，對育齡夫婦造成嚴(yán)重困擾。現(xiàn)代多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為本病病位在胞絡(luò)，病性為本虛標(biāo)實，致病因素不外乎濕、瘀、寒、熱，主要觀點有熱盛雍阻、濕熱瘀阻、寒濕瘀滯、痰濕瘀滯、氣滯血瘀、腎虛血瘀、氣虛血瘀[10]。盡管不同醫(yī)家在辨證分型和遣方用藥上各有側(cè)重，但無論病因為何，其關(guān)鍵病機離不開“瘀”，當(dāng)以“活血化瘀”為主要治則。正如《神農(nóng)本草經(jīng)》云“無子者多系沖任瘀血,瘀血去自能有子也”，其認(rèn)為不孕多由瘀血內(nèi)停、損傷沖任所致，瘀血去則自能受孕[11]。辨證論治是中醫(yī)的基本特色，內(nèi)治以活血化瘀為主從而加速盆腔局部血流循環(huán)，再根據(jù)導(dǎo)致血瘀的因素，或佐以清熱解毒，或理氣行滯，或化痰祛濁等方藥，均可有良好療效。

本研究分析了中藥治療輸卵管炎性不孕癥的用藥規(guī)律，其中中藥頻次分析結(jié)果顯示，使用頻次較多的單藥為當(dāng)歸、赤芍、丹參、三棱、路路通，四氣以寒、溫為主，五味以苦、辛居多，歸經(jīng)主歸肝、心兩經(jīng)。寒性藥物可清熱、瀉火、解毒等；溫性藥物可溫經(jīng)、散寒、補陽等。苦味具有泄、燥特性，辛味具有行、散特性，二者合用辛開苦降，開血氣之郁結(jié)，調(diào)暢氣血。從高頻中藥的藥效類別分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，活血化瘀藥、清熱藥、補虛藥、行氣藥最為常用，其中活血化瘀藥占比最大，根據(jù)“以藥測證”的原理，該結(jié)果也驗證了輸卵管炎性不孕癥的本質(zhì)屬性為血瘀。這提示在輸卵管炎性不孕癥的臨床用藥上，可注重選用辛溫之三棱、莪術(shù)等活血化瘀之品，隨證輔以苦寒之赤芍、甘溫之黃芪、辛苦之香附等清熱、補虛、行氣等藥物，符合中醫(yī)祛邪不傷正、扶正不留邪的基本治法。

關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果顯示，藥對莪術(shù)→三棱出現(xiàn)的頻次最多，支持度最高，說明其為治療輸卵管炎性不孕癥的最基本藥對，其次為川芎→當(dāng)歸。莪術(shù)→三棱是古今活血類方劑中的常用藥對，三棱善行氣中之滯，莪術(shù)善破血中之結(jié)，二藥配伍，行氣活血力宏，散瘀消癥功著。相關(guān)研究表明，三棱、莪術(shù)具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗血栓、降低血液黏稠度、改變血液流變學(xué)等作用[12-13]。和嵐等[14]的研究表明，三棱、莪術(shù)能有效改善血瘀證模型大鼠的血流動力學(xué)參數(shù)，改善大鼠機體高凝狀態(tài)，促進(jìn)血液循環(huán)。當(dāng)歸、川芎為活血化瘀類中藥，其中當(dāng)歸為血中之氣藥，功擅活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛，配伍氣中之血藥川芎，可增強行氣活血、調(diào)經(jīng)止痛之功[15-16]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，川芎、當(dāng)歸的活性成分具有舒張外周血管、改善微循環(huán)、下調(diào)血清腫瘤壞死因子α和C反應(yīng)蛋白等炎癥因子水平的作用[16]。本研究挖掘出的三階關(guān)聯(lián)藥物組合有莪術(shù)、丹參→三棱，川芎、赤芍→當(dāng)歸，以及川芎、香附→當(dāng)歸等，這些藥物組合的主要功效也以活血化瘀行氣為主。從藥物組合的特點看，活血化瘀仍是近現(xiàn)代醫(yī)家在治療輸卵管炎性不孕癥中最鮮明的共性。

系統(tǒng)聚類分析共得到7類(見表5)，其中聚類方1為乳香、沒藥、赤芍、薏苡仁、金銀花，方中薏苡仁走胃經(jīng)祛濕熱而利經(jīng)絡(luò)，金銀花清熱解毒，兼用活血化瘀藥乳香、沒藥、赤芍，共奏活血化瘀、清熱利濕之功，對于濕熱瘀阻型輸卵管炎性不孕癥可選用此方。聚類方2和3為膈下逐瘀湯合柴胡疏肝散加減，全方清熱藥、行氣藥、活血化瘀藥合用，共治郁熱、氣滯、血瘀之標(biāo)實，適用于熱毒熾盛、氣滯血瘀型患者。賈銳[17]發(fā)現(xiàn)，與單純采用輸卵管通液術(shù)治療相比，輸卵管通液術(shù)聯(lián)合膈下逐瘀湯加減可有效改善輸卵管炎性不孕癥患者的癥狀，提高輸卵管通暢率。胡喜姣等[18]研究發(fā)現(xiàn)，膈下逐瘀湯加減方可降低腫瘤壞死因子α、γ-干擾素的表達(dá)水平，抑制炎癥滲出、輸卵管粘連及纖維化，改善組織微循環(huán)，從而發(fā)揮治療輸卵管炎性不孕癥的作用。聚類方4以路路通、王不留行、穿山甲、皂角刺疏經(jīng)通絡(luò)、通滯消癥，三棱、莪術(shù)破血行氣，軟堅散結(jié)，諸藥相配，行血滯而化瘀結(jié)，走厥陰而暢胞絡(luò)。聚類方5為桂枝茯苓丸加減，方中敗醬草、紅藤清熱解毒，桂枝、茯苓直入血分溫經(jīng)散瘀，丹參功擅祛瘀生新，活血而不傷正，牛膝性下行，長于活血祛瘀，諸藥配伍而具有清熱解毒、活血化瘀之功，針對輸卵管炎性不孕熱盛雍阻之證。聚類方6和7為補陽還五湯方加減，全方由補氣藥和多味活血藥配伍組成，共奏補氣活血通絡(luò)之功?！疤摗薄梆觥倍叱Ｏ嗷ゴ龠M(jìn)，因此臨床治療上應(yīng)根據(jù)“虛”“瘀”的程度遣方用藥，適用于病程日久、兼有血瘀之象的患者?，F(xiàn)代研究表明，補陽還五湯可顯著降低氣虛血瘀型大鼠模型的血液黏度，抑制血小板聚集和抗血栓形成，改善血液濃、黏、凝、聚的瘀滯狀態(tài)[19]。

莪術(shù)→三棱為關(guān)聯(lián)規(guī)則分析中的高頻藥物組合，且支持度最高，因此本研究利用BATMAN-TCM 系統(tǒng)分析三棱、莪術(shù)治療輸卵管炎性不孕癥的潛在作用機制。結(jié)果顯示，在疾病富集結(jié)果中，炎癥、疼痛與輸卵管炎性不孕癥的關(guān)系最大；在所富集的相關(guān)信號通路中，最有可能在治療輸卵管炎性不孕癥中發(fā)揮作用的信號通路是PI3K/AKT、FOXO、TRP信號通路。其中，PI3K蛋白家族參與調(diào)控體內(nèi)細(xì)胞的增殖分化、凋亡及氧化應(yīng)激等過程，被認(rèn)為與炎性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等密切相關(guān)[20]。PI3K激活的同時，其下游信號通路上的核心蛋白AKT也被激活，AKT通過誘導(dǎo)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、糖原合成酶激酶-3β、FOXO1等下游蛋白調(diào)控炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫應(yīng)答及抗炎、抗凋亡的作用[21-23]。FOXO1是FOX家族的重要成員，近年來，越來越多的證據(jù)表明FOXO1在炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色。張娜等[24]的實驗結(jié)果提示，F(xiàn)OXO1參與了由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞Ana-1引起的炎癥改變，上調(diào)炎癥因子腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6的釋放；FOXO1過表達(dá)時又可減輕炎癥反應(yīng)。TRP通道在炎性及疼痛疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。多項研究表明，TRP介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與TRPV、TRPA、TRPM、TRPC有關(guān)，其中TRPV1通過結(jié)合T淋巴細(xì)胞，引起鈣內(nèi)流而激活T淋巴細(xì)胞；巨噬細(xì)胞FCγR激活可引起TRPV2表達(dá)的上調(diào)，TRPV2在脂筏中的聚集對細(xì)菌吞噬作用意義重大；TRPM7 在巨噬細(xì)胞活化中具有關(guān)鍵作用；TRPC6可動員中性粒細(xì)胞，通過增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度、重塑肌動蛋白的細(xì)胞骨架，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞C-X-C基序趨化因子配體2和C-X-C基序趨化因子受體2介導(dǎo)的趨化反應(yīng)[25]。TPR介導(dǎo)的疼痛主要與離子通道上的TRPV1、TRPA1傷害感受器有關(guān)，TRPV1參與調(diào)控炎癥反應(yīng)中的痛覺過敏及神經(jīng)性疼痛：在小鼠等實驗動物中敲除TRPA1或使用拮抗劑后，實驗動物對寒冷刺激及機械疼痛的閾值上調(diào)[26-29]。

綜上所述，內(nèi)服中藥治療輸卵管炎性不孕癥主要以活血化瘀藥為主，并隨證配伍清熱、行氣、補虛等藥物，其中莪術(shù)→三棱藥對為核心中藥配伍；核心藥物配伍組合通過調(diào)控炎癥反應(yīng)和疼痛相關(guān)信號通路發(fā)揮治療作用。