楊 寧 張素亮 王亞飛 袁壽其 毛罕平 張曉東

(1.江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程學(xué)院， 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)流體機(jī)械工程技術(shù)研究中心， 鎮(zhèn)江 212013)

0 引言

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織最新統(tǒng)計(jì)，每年因作物病害造成的糧食損失量約占總產(chǎn)量的10%[1]，作物病害的監(jiān)測與預(yù)防對于減少糧食損失尤為重要。作物真菌病害主要由空氣中的真菌孢子侵染引起[2-4]，因此，對空氣中病害孢子的監(jiān)測成為近年來的研究熱點(diǎn)[5]。

當(dāng)前真菌孢子檢測的傳統(tǒng)方法主要有平板菌落計(jì)數(shù)法、分子生物學(xué)檢測法、微懸臂梁檢測法和顯微圖像法。如MATIC等[6]、CHEONG[7]用眼觀察平板中菌落與背景的差異來識別平板中的菌落，并借助菌落計(jì)數(shù)器實(shí)現(xiàn)平板中的菌落準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。ALICIA等[8]用PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了梭菌孢子生存能力的快速檢測。NUGAEVA等[9]利用鍍金和未涂覆的硅微機(jī)械懸臂陣列快速定量檢測黑曲霉和釀酒酵母的濃度。李小龍等[10]、齊龍等[11]利用形態(tài)學(xué)鑒定的方法對捕捉的孢子實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。姜玉英等[12]將自動(dòng)對焦顯微鏡集成到孢子捕捉儀上實(shí)現(xiàn)孢子捕捉數(shù)量的大概統(tǒng)計(jì)。雷雨等[13]提出基于改進(jìn)CenterNet孢子自動(dòng)檢測方法，該方法能夠精準(zhǔn)檢測并分割圖像中的孢子。以上方法雖能對病害孢子進(jìn)行有效檢測，但平板計(jì)數(shù)法存在操作繁瑣、檢測時(shí)間長、具有一定的主觀性等問題[14]；分子生物學(xué)檢測法存在需要特異性抗體且需專業(yè)人員操作的問題[15]；微懸臂梁檢測法存在對檢測環(huán)境要求嚴(yán)格，難以適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境條件的問題[16]；顯微圖像法存在工作量大、誤差大、自動(dòng)化程度低的問題[17]。目前，病害孢子在線檢測主要是孢子捕捉儀[18]，如托普云農(nóng)智能孢子捕捉儀，該設(shè)備將孢子捕捉與顯微識別相結(jié)合，一定程度上實(shí)現(xiàn)了孢子在線檢測，但該方法需借助高精度顯微鏡進(jìn)行輔助檢測，無法推廣實(shí)施。

隨著微納米技術(shù)加工工藝的發(fā)展，基于微流控芯片的微生物傳感器檢測系統(tǒng)因其具有集成度高、成本低、高通量、光學(xué)性能好等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[19-23]。微流控芯片雖在一定程度上解決了檢測效率低和便捷性差的問題[24-28]，但上述實(shí)驗(yàn)液體中粒子分離芯片大多為一次性微流控芯片，易造成資源浪費(fèi)；氣體中粒子分離主要基于微環(huán)境慣性原理，不同質(zhì)量粒子隨氣流運(yùn)動(dòng)到芯片固定位置，之后在固定位置檢測粒子，這易造成芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)過于復(fù)雜，氣動(dòng)式芯片使用一次后，固定位置粒子不易清理，易導(dǎo)致芯片復(fù)用率不高的問題。

基于此，提出一種基于氣載微流控芯片的作物病害孢子流式動(dòng)態(tài)檢測方法，無需將孢子運(yùn)動(dòng)到芯片固定位置進(jìn)行檢測。通過設(shè)計(jì)一種平行雙鞘流聚焦的微流控芯片，實(shí)現(xiàn)孢子的聚焦流動(dòng)；利用光路聚焦原理和雙向Mie散射原理設(shè)計(jì)光電檢測結(jié)構(gòu)；將微流控芯片和光電檢測結(jié)構(gòu)組合搭建光電檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)稻曲病孢子動(dòng)態(tài)檢測，以解決微流控芯片孢子檢測復(fù)用率低的問題。

1 檢測原理與系統(tǒng)構(gòu)成

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用稻曲病孢子來源于中國水稻研究所實(shí)驗(yàn)室，聚苯乙烯微球樣本購自天津大鵝科技有限公司。制備稻曲病孢子(7～9 μm)和聚苯乙烯微球(4 μm)樣本溶液，其菌體濃度和質(zhì)量濃度分別為4.08×108個(gè)/mL和0.625 mg/mL。實(shí)驗(yàn)利用氣溶膠發(fā)生器將稻曲病孢子和聚苯乙烯微球樣本制作成氣溶膠粒子，均勻釋放在1 L的容器中。實(shí)驗(yàn)采樣時(shí)間為60 s，分別取20 mL溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 微流控芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

為實(shí)現(xiàn)微流控光電檢測系統(tǒng)的聚焦和檢測，設(shè)計(jì)的微流控芯片由進(jìn)樣通道、鞘流通道、分壓通道、檢測通道和圓形腔室微結(jié)構(gòu)組成(圖1)。其中：芯片通道高度為70 μm；芯片進(jìn)樣接口用于真菌孢子進(jìn)樣，直徑為500 μm；為實(shí)現(xiàn)孢子在芯片中心排成一列，設(shè)計(jì)平行雙鞘流結(jié)構(gòu)，鞘流聚焦通道寬500 μm；為實(shí)現(xiàn)粒子減速進(jìn)入檢測區(qū)，設(shè)計(jì)分壓通道結(jié)構(gòu)，且分壓通道寬度為700 μm；為實(shí)現(xiàn)光電檢測系統(tǒng)檢測，粒子經(jīng)過檢測區(qū)被激光激發(fā)發(fā)生前向和側(cè)向散色光，芯片檢測區(qū)寬度為350 μm；為實(shí)現(xiàn)粒子準(zhǔn)確富集在富集區(qū)表面，設(shè)置圓形腔室結(jié)構(gòu)，且圓形腔室直徑為2 500 μm。

圖1 微流控芯片F(xiàn)ig.1 Microfluidic chip1.進(jìn)樣通道 2、3.鞘流通道 4.芯片檢測區(qū) 5、6.分壓通道 7.富集區(qū) 8.芯片出口

1.3 工作原理

1.3.1粒子聚焦原理

樣品在通道內(nèi)在鞘流的擠壓下有明顯的聚焦區(qū)，區(qū)域?qū)挾萪小于初始進(jìn)口寬度D2。如圖2所示，通過控制聚焦流的大小，可以讓微球逐個(gè)單獨(dú)通過聚焦區(qū)。樣品流的狀態(tài)是從寬的入口形態(tài)變成一條細(xì)的聚焦線狀態(tài)。

圖2 粒子聚焦示意圖Fig.2 Schematic of particle focusing

由質(zhì)量守恒定律可知，同時(shí)通過中心處的流體質(zhì)量和聚焦流中通過的流體質(zhì)量相等，即

v2D2=vcd

(1)

式中D2、d——樣品流和聚焦流寬度，μm

v2、vc——樣品流和聚焦流流速，mL/min

微觀狀態(tài)的流體處于層流狀態(tài)，因此一些宏觀流體的性質(zhì)，如樣品聚焦流體和鞘氣之間的物質(zhì)擴(kuò)散、混合等被忽略。根據(jù)這樣的假設(shè)和質(zhì)量守恒定律，可得

(2)

式中D1、D3——兩個(gè)鞘氣通道寬度，μm

v1、v3——鞘氣流速，mL/min

va——在出口Da處的流體平均速度，mL/min

ρ1、ρ2、ρ3——對應(yīng)3個(gè)入口通道內(nèi)部流體密度，kg/m3

Da——芯片檢測區(qū)通道寬度

ρa(bǔ)——整個(gè)氣體出口處所有流體平均密度，kg/m3

假設(shè)此時(shí)，在通道出口處的微觀流體是完全的層流狀態(tài)，則在Da處的流速剖面呈拋物線分布，則

vc=vmax=1.5va

(3)

通過推導(dǎo)可知，流體聚焦后的寬度可表示為[29]

(4)

式(4)可以用來預(yù)測聚焦流的寬度，聚焦流的寬度隨著鞘氣流和樣品流的速度比上升而下降。

1.3.2激光散射基本原理

當(dāng)粒子粒徑接近或大于入射光波長時(shí)稱為Mie散射現(xiàn)象，Mie散射適用于較大的粒子散射，一束波長為λ的激光照射到與其相距l(xiāng)的一個(gè)顆粒時(shí)，該粒子產(chǎn)生的散射光強(qiáng)為Is,其運(yùn)算關(guān)系為[30]

(5)

其中

(6)

α=2rTn=θ

式中I0——入射光強(qiáng)，cd/m2

l——激光與散射體的距離，mm

θ——散射角，(°)

i1、i2——在垂直和水平方向散射光強(qiáng)度函數(shù)

α——粒子尺度參數(shù)

r——粒子半徑，μm

F——粒子相對復(fù)振幅函數(shù)

Πn——角散射系數(shù)

an、bn——米氏散射系數(shù)

1.4 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

系統(tǒng)檢測平臺如圖3所示。實(shí)驗(yàn)所涉及的設(shè)備主要包括532 nm半導(dǎo)體激光器(深圳市華上激光科技有限公司)、微流控芯片、微型氣泵、流量計(jì)、電路板、聚焦光路裝置等。

圖3 系統(tǒng)檢測平臺Fig.3 System testing platform1.電路板 2.微流控芯片 3.樣本 4.光電二極管 5.聚焦光路結(jié)構(gòu) 6.半導(dǎo)體激光器 7.光源 8.半凸透鏡(焦距14 mm) 9.孔徑10 μm光闌面

系統(tǒng)的激發(fā)光源由532 nm半導(dǎo)體激光器和一個(gè)聚焦光路裝置組成，聚焦光路裝置為將光源聚焦到實(shí)驗(yàn)所需要的光斑直徑(10 μm)，聚焦光路裝置由濾光片、焦距為14 mm半透鏡和小孔直徑為10 μm光闌面組成。激發(fā)光源經(jīng)過聚焦光路結(jié)構(gòu)對流經(jīng)微流控芯片中的粒子進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后的信號分別被前向和側(cè)向的光電二極管(S8745-01型)采集。實(shí)驗(yàn)將通量為2.5 mL/min的微型氣泵連接到氣溶膠發(fā)生器出氣口，為微流控芯片收集稻曲病孢子提供進(jìn)樣動(dòng)力。為防止外界光進(jìn)入檢測系統(tǒng)造成實(shí)驗(yàn)誤差，整個(gè)檢測過程始終在暗室環(huán)境下進(jìn)行。

2 微流控芯片仿真與優(yōu)化

使用SolidWorks對微流控芯片的通道結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并將設(shè)計(jì)圖導(dǎo)入COMSOL Mutiphysics 5.1軟件中，利用層流模塊和粒子追蹤模塊對粒子的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行仿真。由于系統(tǒng)檢測光斑直徑為10 μm，粒子聚焦寬度需優(yōu)化到10 μm以內(nèi)才能滿足系統(tǒng)檢測需求。研究粒子到達(dá)聚焦區(qū)域的坐標(biāo)，記錄粒子經(jīng)過的最高點(diǎn)和最低點(diǎn)，計(jì)算兩者的差值，將其作為聚焦寬度。經(jīng)仿真發(fā)現(xiàn)粒子聚焦寬度受鞘流入口流速和芯片檢測區(qū)寬度影響較大。分別對鞘流入口流速和芯片檢測區(qū)通道寬度進(jìn)行優(yōu)化，保持樣品入口流速恒為2.5 mL/min，鞘流入口流速分別調(diào)整為6、9、12、15 mL/min，保持鞘流入口速度為恒定值，芯片檢測區(qū)寬度分別設(shè)置為250、300、350、400 μm。粒子聚焦寬度仿真優(yōu)化結(jié)果如圖4所示。

圖4 粒子聚焦寬度仿真優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Particle focus width simulation optimization results

當(dāng)鞘流流速分別為12、15 mL/min時(shí)，所對應(yīng)芯片檢測區(qū)通道寬度為250、300、350 μm的粒子聚焦程度較好?？紤]到芯片為PDMS軟膜制作，流速大易造成芯片通道變形，因此選擇12 mL/min作為最佳鞘流流速。由于芯片加工尺寸越小制作工藝就越復(fù)雜，綜合考慮成本及聚焦效果，將芯片檢測區(qū)寬度設(shè)計(jì)為350 μm，此時(shí)粒子聚焦寬度為8 μm，滿足系統(tǒng)檢測需求。

為更好地篩選出芯片富集區(qū)最佳直徑，將富集區(qū)直徑設(shè)置為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 μm進(jìn)行優(yōu)化。通過仿真計(jì)算芯片富集效率，富集效率計(jì)算公式為

(7)

式中n——富集區(qū)收集到的粒子數(shù)

m——一次釋放粒子數(shù)

從圖5可知，當(dāng)富集區(qū)直徑為2 500 μm時(shí)，富集芯片富集率可達(dá)96.7%(釋放300個(gè)粒子，芯片富集290個(gè)粒子)，最終將富集區(qū)直徑優(yōu)化為2 500 μm。

對結(jié)構(gòu)參數(shù)優(yōu)化后的微流控芯片進(jìn)行仿真，結(jié)果如圖6所示。聚焦檢測通道的速度為1 500 mm/s。

圖5 不同直徑下富集效率Fig.5 Enrichment efficiency under different diameters

圖6 粒子在芯片內(nèi)運(yùn)動(dòng)仿真分析Fig.6 Simulation analysis of particle motion in chip

由圖6可知，富集區(qū)兩側(cè)的速度較大，當(dāng)空氣中的粒子運(yùn)動(dòng)到富集區(qū)時(shí)，粒子速度變慢便停留在此區(qū)域，M型通道設(shè)計(jì)的作用主要實(shí)現(xiàn)降壓，以滿足粒子更好的聚焦。

3 前向散射信號分析

根據(jù)Mie散射理論可知，當(dāng)粒子流經(jīng)芯片檢測區(qū)時(shí)因受到聚焦光斑的照射而產(chǎn)生散射光，散射光主要分為前向散射和側(cè)向90°散射光，前向散射光強(qiáng)表征粒徑。實(shí)驗(yàn)分別配置20 mL的聚苯乙烯微球(4 μm)、稻曲孢子(7～9 μm)和兩種粒子混合溶液。分3次將3種溶液放入氣溶膠發(fā)生器中，接著往氣溶膠發(fā)生器中通入氣壓為2.02×105Pa的氣流，對溶液中的粒子進(jìn)行霧化操作，并在生物氣溶膠后接干燥管以除去氣溶膠流中的水分。最后，利用氣泵將霧化好的氣溶膠粒子以2.5 mL/min吸入微流控芯片進(jìn)樣口進(jìn)行光電檢測，在暗室條件下運(yùn)行60 s。結(jié)果如圖7所示，圖7a為4 μm聚苯乙烯微球溶液脈沖圖，圖7b為孢子溶液脈沖圖，圖7c為兩種粒徑混合溶液脈沖圖，圖7d為粒徑和光強(qiáng)降低量關(guān)系圖。由圖7d可知，前向散射光強(qiáng)降低量與粒徑成正相關(guān)，下降幅度越大被檢測到的粒子直徑也就越大，決定系數(shù)可達(dá)0.966 6。因此，根據(jù)前向散射光強(qiáng)降低量即可計(jì)算出被檢測的粒子粒徑。

圖7 粒徑與光強(qiáng)關(guān)系分析Fig.7 Relative analysis of particle size and light intensity

4 粒子分類與計(jì)數(shù)結(jié)果分析

用聚苯乙烯微球和稻曲病孢子進(jìn)行混合測試，系統(tǒng)每次工作60 s。圖8a為一組采集到的前向和側(cè)向散射光強(qiáng)信息，由圖8a可知，系統(tǒng)前向散射光強(qiáng)噪聲主要集中在2 120～2 180 cd/m2之間，聚苯乙烯微球光強(qiáng)下降至1 980～2 010 cd/m2，稻曲病孢子光強(qiáng)下降至1 915～1 950 cd/m2。系統(tǒng)側(cè)向散射光強(qiáng)噪聲主要集中在33～50 cd/m2之間，聚苯乙烯微球的側(cè)向光強(qiáng)信息集中在70～80 cd/m2之間，稻曲病孢子側(cè)向光強(qiáng)信息集中在90～105 cd/m2。圖8b為一組前向和側(cè)向散射光強(qiáng)信息散點(diǎn)圖，通過融合前向與側(cè)向散射光強(qiáng)信息，實(shí)現(xiàn)了稻曲病孢子和聚苯乙烯微球的分類。

圖8 混合測試結(jié)果Fig.8 Mixed test results

另外，為驗(yàn)證系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，本研究探測器的計(jì)數(shù)結(jié)果與富集區(qū)粒子計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行對比，共進(jìn)行7組實(shí)驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)的檢測誤差，誤差公式定義為

(8)

式中M——系統(tǒng)利用光強(qiáng)信息計(jì)算流經(jīng)芯片檢測區(qū)的孢子和聚苯乙烯微球的數(shù)量

N——芯片富集區(qū)顯微鏡觀察孢子和聚苯乙烯微球數(shù)量

光散射計(jì)數(shù)與芯片富集區(qū)粒子計(jì)數(shù)對比結(jié)果如表1所示，最大誤差不超過12%，平均誤差為7.04%，而文獻(xiàn)[31]孢子檢測方案平均誤差為16.64%，精度提高了9.6個(gè)百分點(diǎn)，且光散射計(jì)數(shù)與富集區(qū)計(jì)數(shù)高度線性相關(guān)(決定系數(shù)R2為0.94)。測試結(jié)果表明，基于氣載微流控芯片的作物病害孢子流式動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)可用于檢測和識別稻曲病孢子。

5 芯片復(fù)用率分析

將本研究提出的平行雙鞘流聚焦的微流控芯片與文獻(xiàn)[27]中的富集式微流控芯片以及孢子捕捉儀普通載玻片的復(fù)用率進(jìn)行對比。針對文獻(xiàn)[27]設(shè)計(jì)的富集式微流控芯片，實(shí)驗(yàn)后均用氣泵將芯片內(nèi)雜質(zhì)抽空，但因芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜仍有雜質(zhì)存于微流控芯片中，在孢子濃度為4.2×105個(gè)/mL下工作2 min，芯片復(fù)用次數(shù)超3次就難以繼續(xù)使用。孢子捕捉儀富集孢子是采用涂抹凡士林的載玻片，不易清洗，玻片正常使用1次就需更換[32]。本文提出的聚焦式微流控芯片是一種流式動(dòng)態(tài)檢測，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測試得出，當(dāng)連續(xù)使用超過31次，由于芯片材料是PDMS軟膜，芯片通道不斷有氣流流過，導(dǎo)致芯片通道發(fā)生變形，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，因此芯片使用次數(shù)在31次以內(nèi)結(jié)果較為準(zhǔn)確。3種芯片復(fù)用率如表2所示，由表2可知，本研究提出的芯片復(fù)用次數(shù)相比于文獻(xiàn)[27]提高約9倍。因此本文方法可有效解決微流控芯片復(fù)用率低的問題。

表1 光散射計(jì)數(shù)和富集區(qū)粒子計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.1 Results of light scattering count and particle count in enriched region

表2 不同檢測方法復(fù)用率Tab.2 Comparison of different detection methods

6 結(jié)論

(1)提出一種基于氣載微流控芯片的作物病害孢子流式動(dòng)態(tài)檢測方法，設(shè)計(jì)平行雙鞘流聚焦的微流控芯片,實(shí)現(xiàn)孢子動(dòng)態(tài)檢測。

(2)對芯片通道尺寸及進(jìn)氣速度進(jìn)行優(yōu)化，樣品入口流速為2.5 mL/min、鞘流速度為12 mL/min時(shí)粒子聚焦寬度可達(dá)8 μm、富集效率達(dá)96.7%。

(3)根據(jù)前向散射光強(qiáng)信息建立粒徑與光強(qiáng)的檢測模型，決定系數(shù)為0.966 6，具有較好的線性度。

(4)融合前向與側(cè)向散射光強(qiáng)信息，實(shí)現(xiàn)稻曲病孢子和聚苯乙烯微球的分類，平均檢測誤差為7.04%。

(5)芯片復(fù)用次數(shù)最多為31次，復(fù)用率提高約9倍。基于一種微流控芯片的氣體流式稻曲病孢子光電檢測方法有效解決了微流控芯片復(fù)用問題并為病害預(yù)警裝置研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。