郭文川 李思睿 楊 燁 董一鳴 張毛賽 朱新華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)機(jī)械與電子工程學(xué)院， 陜西楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)重點實驗室， 陜西楊凌 712100)

0 引言

牛乳富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等多種營養(yǎng)成分，是人們攝取營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源[1]。為了防止牛乳變質(zhì)，一些牛乳生產(chǎn)者常給牛乳中添加一定量的亞硝酸鹽。長期或過量食用亞硝酸鹽食品，會導(dǎo)致人體急性中毒、致癌，甚至死亡[2]。因此，我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]已經(jīng)將亞硝酸鹽含量作為乳及乳制品的常規(guī)檢測項目之一，且規(guī)定液態(tài)乳中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度(以NaNO2計)不超過0.2 mg/L。

文獻(xiàn)[4]規(guī)定檢測乳品中亞硝酸鹽含量的方法有離子色譜法和分光光度法。馮偉科等[5]和顏琪等[6]利用離子色譜法測量了牛乳及其制品中的亞硝酸鹽含量，其檢測限分別為0.02 mg/kg和0.04 mg/kg。肖琴等[7]和苗攀登等[8]基于分光光度法測定了牛乳中的亞硝酸鹽含量，其檢測限分別為0.009 0 mg/L和76.43 ng/mL。這些結(jié)果說明，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法在檢測亞硝酸鹽含量方面具有檢測靈敏度高、誤差小的優(yōu)點，但其樣品前處理過程復(fù)雜、操作耗時，且所需儀器價格昂貴，尤其是離子色譜法，難以廣泛適應(yīng)于現(xiàn)場檢測。

國內(nèi)外學(xué)者也采用氣相色譜法[9]、高效液相色譜法[10-11]、熒光法[12-14]、化學(xué)發(fā)光法[15]、電化學(xué)法[16-18]、毛細(xì)管電泳法[19]等定量測定乳品中的亞硝酸鹽含量，雖取得了較好的研究成果，但氣相色譜法、高效液相色譜法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法和毛細(xì)管電泳法仍存在著儀器體積大并且價格昂貴、前期樣品處理過程繁瑣、后期數(shù)據(jù)處理過程復(fù)雜等缺點；電化學(xué)檢測方法又存在傳感器的制備較為復(fù)雜、儀器昂貴的缺點。所以這些檢測方法不便于普及應(yīng)用。因此，研發(fā)一種成本低、響應(yīng)快且便于攜帶的牛乳中亞硝酸鹽含量檢測裝置對于保障乳品品質(zhì)安全具有重要意義。

亞硝酸鹽在弱酸條件下會與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，再與鹽酸萘乙二胺偶合后會形成紫紅色的偶氮化合物，且其顯色的程度與亞硝酸鹽的含量密切相關(guān)?；诖嗽恚疚脑O(shè)計一種便攜式牛乳中亞硝酸鹽含量檢測儀，并對檢測儀的性能進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及制備方法

為了保證所用樣品具有良好的代表性，選擇以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為3.2 g/mL的全脂滅菌乳(伊利牌)作為研究對象。所用樣品均購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

采用NaNO2作為亞硝酸鹽，向97.5 mL的牛乳中加入2.5 mL質(zhì)量濃度為200 mg/L的NaNO2溶液。混合均勻后，以0.08 mL的間隔移取混合液0～2 mL，隨后加牛乳定容至10 mL，并分4批制備得到亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為0～1 mg/L，間隔為0.04 mg/L的牛乳樣品共104份，定義為A批。按照上述的方法，制備亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為0～0.78 mg/L，間隔為0.02 mg/L的牛乳樣品160份(B批)，同時另配制亞硝酸鹽含量在此濃度范圍內(nèi)隨機(jī)分布的牛乳樣品20份(C批)。其中，A批樣品用于提取檢測牛乳中亞硝酸鹽含量的特征波長，B批樣品用于建立和評估亞硝酸鹽含量定量檢測模型的性能，而C批樣品用于測試所開發(fā)檢測儀的性能。

每個樣品中首先加入2 mL質(zhì)量濃度為4 g/L的對氨基苯磺酸鹽酸溶液，混勻后靜置3 min，然后再加入1 mL質(zhì)量濃度為2 g/L的鹽酸萘乙二胺水溶液，混勻后靜置20 min進(jìn)行試驗。整個試驗在室溫((23±1)℃)下進(jìn)行。

1.2 特征波長提取

1.2.1可見漫反射光譜采集和光譜預(yù)處理

將A批中的每個樣品置于一平底的石英杯后，利用微型光譜儀(USB4000型，Ocean Optics公司，美國)采集A批各樣品的可見漫反射光譜。光譜掃描范圍380～780 nm，掃描3次，平滑度100；以在250～2 000 nm波長范圍內(nèi)具有99%反射率的聚四氟乙烯的可見漫反射光譜作為參比光譜[20]。試驗過程中杯底至探頭的距離為7 mm。每個樣品重復(fù)測量3次，以3次重復(fù)的平均值作為測量結(jié)果。

由于儀器內(nèi)部或測量環(huán)境因素的變化導(dǎo)致光譜儀在采集目標(biāo)參數(shù)時存在噪聲，因此在建模前常需要對光譜進(jìn)行預(yù)處理[21]。Savizky-Golay (SG)平滑算法是一種常用的光譜預(yù)處理方法，它是根據(jù)選定窗口的大小，在使窗口移動的過程中，對其內(nèi)部光譜變量進(jìn)行最小二乘擬合分析，從而達(dá)到去噪的目的。

1.2.2樣本劃分

將A批樣品中前3批樣本作為校正集，最后1批樣本作為預(yù)測集，即校正集與預(yù)測集比例為3∶1。

1.2.3特征波長選擇

提取特征波長是設(shè)計基于多光譜技術(shù)的便攜式檢測儀的先決條件[22]。本研究選擇常用的連續(xù)投影算法(Successive projections algorithm, SPA)提取特征波長。根據(jù)向量的投影分析，SPA從A批校正集內(nèi)篩選出具有低冗余信息的光譜變量。由最小的校正均方根誤差(Root mean square error of calibration，RMSEC)確定最佳特征波長。SPA能最大限度降低光譜數(shù)據(jù)間的共線性，從而使建立的模型更為簡便、高效。

1.3 檢測儀硬件系統(tǒng)設(shè)計

圖1所示是檢測儀硬件系統(tǒng)示意圖。該檢測儀的硬件系統(tǒng)主要由微控制器模塊、光源模塊、光傳感器模塊、電源和輸入輸出模塊組成。微控制器模塊負(fù)責(zé)控制外圍設(shè)備，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集與處理；光源模塊負(fù)責(zé)輸出光強(qiáng)穩(wěn)定的特征波長；光傳感器模塊采集漫反射光信號，并將轉(zhuǎn)換后的數(shù)字信號傳輸至微控制器；輸入輸出模塊負(fù)責(zé)輸入工作指令，指引用戶完成操作并將檢測結(jié)果反饋至顯示屏；電源采用鋰電池，為系統(tǒng)各硬件提供穩(wěn)定的電壓輸入。

1.3.1微控制器模塊

微控制器模塊由時鐘電路、復(fù)位電路、電源管理電路和降壓電路組成。本文以STC12C5A60S2為微控制器，時鐘采用11.059 2 MHz的石英晶振，復(fù)位電路使用按鍵復(fù)位方式。

以IP5306芯片管理電源。該芯片具有充放電一體、升壓轉(zhuǎn)換和電量指示的功能，其電路如圖2所示。在本設(shè)計中，IP5306的充電輸入端VIN與TYPE-C接口相連，可以為電源直接供電。升壓輸入端BAT與電源正極相連，輸出端VOUT負(fù)責(zé)向STC12C5A60S2芯片提供5 V的工作電壓。發(fā)光二極管(Light-emitting diode，LED)驅(qū)動端用來驅(qū)動5個LED，以便根據(jù)燈顯模式判斷電源的充放電狀態(tài)。結(jié)合按鍵輸入端KEY處的按鍵控制，整體電量顯示和升壓輸出可通過操作鍵操作實現(xiàn)。

圖1 檢測儀硬件系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic of hardware system of detector

圖2 電源管理電路Fig.2 Power management circuit

在向微控制器的外圍設(shè)備提供電源輸出的前提下，使用AMS117芯片設(shè)計了一個5 V轉(zhuǎn)3.3 V的降壓電路，如圖3所示。該電路輸入端VIN和輸出端VOUT均并聯(lián)有100 nF和10 μF的電容，其作用是濾除直流電路中的高頻和低頻干擾信號。

圖3 降壓電路Fig.3 Buck circuit

1.3.2光源模塊

綜合比較不同類型光源的光強(qiáng)、功耗和體積等，選擇以LED作為光源。結(jié)合1.2節(jié)確定的特征波長，選擇469、500、546、628、665 nm的LED作為檢測光源，各LED的工作電流為100 mA。LED驅(qū)動電路由驅(qū)動器QX7136和采樣電阻組成，如圖4所示。將5 V作為QX7136的電源電壓，則LED電流ILED與RCS的關(guān)系為

(1)

式中ILED——LED電流，mA

VCS——采樣電壓，取50 mV

RCS——采樣電阻，Ω

根據(jù)LED工作電流可計算出RCS，本文取0.5 Ω。由于處理器需依次控制多個LED的恒流導(dǎo)通，因此將經(jīng)采樣電阻后的電流設(shè)定腳CS與芯片地引腳GND同時連至微控制器Px口，進(jìn)行高電平和低電平的轉(zhuǎn)換。

1.3.3光傳感器模塊

考慮到成本和精度的需求，選擇GY-30型數(shù)字光照傳感器檢測經(jīng)牛乳樣品漫反射后的光照強(qiáng)度。該傳感器的光響應(yīng)范圍為400～700 nm，內(nèi)置16位A/D轉(zhuǎn)換器，輸入電壓為3～5 V，可通過I2C協(xié)議實現(xiàn)與微控制器的通信[23]。

1.3.4電源和輸入/輸出模塊

以604060型鋰電池作為該檢測儀的移動電源，容量為2 200 mA·h，供電電壓為3.7～4.2 V。本檢測儀設(shè)計了4個按鍵用于控制檢測儀電源的通斷、檢測電路的啟動、儀器校準(zhǔn)和樣品檢測等功能。顯示器件為OLED 12864顯示屏，其與微控制器之間采用I2C協(xié)議通信。

1.4 檢測儀軟件設(shè)計

在Keil μVision4開發(fā)軟件環(huán)境中采用C51語言編寫檢測儀的軟件。該軟件主要包括主函數(shù)、按鍵子函數(shù)、光照度采集子函數(shù)、數(shù)據(jù)處理子函數(shù)以及顯示子函數(shù)等。主函數(shù)用于完成元器件的初始化和各子函數(shù)的協(xié)調(diào)運行；按鍵子函數(shù)根據(jù)用戶操作完成各模塊的功能調(diào)用；光照度采集子函數(shù)用于實現(xiàn)漫反射光照度的采集和數(shù)據(jù)的傳輸控制；數(shù)據(jù)處理子函數(shù)負(fù)責(zé)實現(xiàn)漫反射率的計算，以得到牛乳中亞硝酸鹽含量的測定值；顯示子函數(shù)實現(xiàn)將儀器的檢測結(jié)果輸出到顯示屏。

1.5 建模方法及評價指標(biāo)

偏最小二乘回歸(Partial least squares regression, PLSR)是一種線性校正方法。該方法是在分解光譜矩陣X和濃度矩陣Y的基礎(chǔ)上，結(jié)合迭代分析確定隱變量集合，并利用它對Y實施線性回歸，從而求取X與Y的關(guān)聯(lián)預(yù)測模型的過程。PLSR可以有效避免變量多和樣本數(shù)少的問題，滿足單組分定量分析的可靠性需求。

本研究采用校正相關(guān)系數(shù)RC、校正均方根誤差(RMSEC)、預(yù)測相關(guān)系數(shù)RP、預(yù)測均方根誤差(RMSEP)及預(yù)測偏差比率(RPD)作為評估PLSR模型性能的指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 特征波長確定

2.1.1光譜分析

圖5所示是經(jīng)SG預(yù)處理后的A批104份牛乳樣本的漫反射光譜。由圖5可知，在380～780 nm的可見光譜范圍內(nèi)，各樣品的漫反射率隨波長的變化規(guī)律基本一致。在460～660 nm之間，牛乳樣品出現(xiàn)吸收峰或反射峰，且隨著牛乳中亞硝酸鹽含量的增大，吸收峰更加突出。這說明，隨著亞硝酸鹽含量的增大，牛乳中的亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸鹽酸溶液和鹽酸萘乙二胺水溶液反應(yīng)后的顏色更加明顯。

圖5 經(jīng)SG預(yù)處理后牛乳樣本的可見漫反射光譜Fig.5 Visible diffuse reflectance spectra of milk samples after SG pretreatment

2.1.2特征波長提取

按3∶1的比例對A批中的牛乳樣品進(jìn)行樣本劃分，則校正集中有78份樣品，預(yù)測集中有26份樣品。對校正集中的78份樣品應(yīng)用SPA法提取對亞硝酸鹽含量的敏感特征波長。在提取特征波長時，將特征波長數(shù)的范圍設(shè)定為1～11，間隔為1，計算每個特征波長下的RMSEC，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，當(dāng)特征波長數(shù)為10時，RMSEC達(dá)到最小值0.047 60 mg/L。少的波長數(shù)有助于降低儀器成本并減小儀器體積。由于波長數(shù)為8時的RMSEC與最小的RMSEC在0.05 mg/L的水平上沒有顯著差異，因此，將特征波長數(shù)確定為8。此時，所確定的特征波長為492.13、456.49、553.02、627.60、412.51、433.10、402.60、668.75 nm。

基于A批樣品的校正集所提取的特征波長建立預(yù)測A批牛乳樣品中亞硝酸鹽含量的PLSR模型，結(jié)果表明，RC和RMSEC分別為0.990和0.043 mg/L，RP和RMSEP分別為0.986和0.052 mg/L，RPD為5.838?？梢?，基于SPA法提取特征波長所建立的PLSR模型能夠很好地預(yù)測牛乳樣品中的亞硝酸鹽含量。

圖6 基于SPA提取的不同特征波長數(shù)計算的RMSECFig.6 Calculated RMSEC at different numbers of characteristic wavelengths selected by SPA

2.1.3檢測波長確定

由于實際LED都有一定的響應(yīng)范圍，綜合考慮市場上LED的規(guī)格參數(shù)以及選擇的特征波長，最終確定以中心波長為469、500、546、628、665 nm的LED作為檢測光源。圖7為用USB4000微型光譜儀測量得到的5個LED的光響應(yīng)譜。由圖7可知，每個LED都有良好的光響應(yīng)特性。

圖7 所選擇LED燈的光響應(yīng)譜Fig.7 Optical response spectra of selected LEDs

2.2 檢測儀設(shè)計

圖8a為所設(shè)計的牛乳中亞硝酸鹽含量檢測儀的原型機(jī)，其外殼采用3D打印技術(shù)制作。該儀器的尺寸為120 mm×90 mm×80 mm，總質(zhì)量為340 g。為避免外部環(huán)境光干擾和內(nèi)部光的泄漏，儀器頂部另置有遮光蓋。

圖8b為樣品池、光源和光傳感器的位置關(guān)系。其中樣品池為石英杯，5個LED均勻分布在石英杯的底部，且與水平方向呈45°夾角。

圖8 牛乳中亞硝酸鹽含量檢測儀的樣機(jī)以及樣品 池、光源和光傳感器的位置關(guān)系Fig.8 Prototype of nitrite content detector for milk and positions of sample cell, light source and light sensor 1、9.支撐座 2.樣品池 3.遮光蓋 4.顯示屏 5.電源鍵 6.啟動鍵 7.校準(zhǔn)鍵 8.檢測鍵 10.石英杯 11.牛乳樣本 12.LED 13.光傳感器 14.托臺

為了克服外界環(huán)境對檢測結(jié)果的影響，在使用前以聚四氟乙烯作為參考白板對該檢測儀進(jìn)行校正。測量時，首先依次按下電源鍵和啟動鍵，然后將參考白板放在傳感器頂部。接著按校準(zhǔn)鍵，采集并保存?zhèn)鞲衅魉@取的各個波長下白板的漫反射光照度IWi。隨后，向樣品池加入配制好的牛乳樣本，并將樣品池放于光源上部的測試位置。用遮光蓋蓋住樣品池，然后按下檢測鍵，記錄傳感器在各個波長下感知的牛乳樣本的漫反射光照度ISi。每份樣本重復(fù)測量3次，3次測量平均值作為該樣本的最終檢測結(jié)果。根據(jù)求樣品在各個波長下的漫反射率Ri，進(jìn)而得到該樣品的漫反射多光譜R。式中i取1～5分別對應(yīng)波長469、500、546、628、665 nm。

(2)

2.3 建模結(jié)果

利用檢測儀采集B批160個牛乳樣品的漫反射多光譜，將樣本按3∶1的比例劃分為校正集和預(yù)測集后，采用PLSR建立預(yù)測牛乳中亞硝酸鹽含量模型。在求得的建模結(jié)果中，RC和RMSEC分別為0.981和0.045 mg/L，RP和RMSEP分別為0.992和0.033 mg/L，而RPD為7.104，說明模型具有良好的定量預(yù)測能力。所構(gòu)建的牛乳中亞硝酸鹽含量的PLSR模型為

y=0.099 4R1-1.408 9R2-2.422 5R3+ 1.280 5R4+1.695 5R5+0.566 8

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式中y——亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，mg/L

基于所建立的PLSR模型編寫數(shù)據(jù)處理子函數(shù)，使得檢測儀能夠根據(jù)所獲得的漫反射率計算出牛乳中的亞硝酸鹽含量。

2.4 儀器穩(wěn)定性測量

2.4.1漫反射率測量穩(wěn)定性

為了驗證本檢測儀在測定樣本漫反射率過程中的穩(wěn)定性，從C批樣品中任取亞硝酸鹽含量不同的牛乳樣本5份，對每個樣本重復(fù)測量10次，測量結(jié)果的變異系數(shù)如表1所示。由表1可知，各樣本的變異系數(shù)不大于1.35%，說明本檢測儀具有良好的穩(wěn)定性。

表1 多次測量下不同亞硝酸鹽含量牛乳樣品漫 反射率的變異系數(shù)Tab.1 Coefficient of variation of diffuse reflectance of milk samples at different nitrite contents under multiple measurements

2.4.2亞硝酸鹽含量測量穩(wěn)定性

另從C批中任取5份亞硝酸鹽含量不同的牛乳樣本，用于檢驗該檢測儀對亞硝酸鹽含量測量結(jié)果的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，牛乳樣本在10次測量中，隨著亞硝酸鹽含量的增大，變異系數(shù)迅速減小，對于任取的5份樣本，測量結(jié)果的變異系數(shù)范圍為0.63%～14.64%，平均值為4.26%。對于農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.2 mg/L最大允許殘留量下，此時變異系數(shù)為1.75%，說明儀器能夠穩(wěn)定地檢測亞硝酸鹽含量。

2.5 亞硝酸鹽含量檢測精度驗證

利用C批配制的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度在0～0.78 mg/L范圍內(nèi)的20份樣本對所設(shè)計的便攜式牛乳中亞硝酸鹽含量檢測儀的精度進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，測量結(jié)果緊密分布在45°線周圍，可見本儀器的亞硝酸鹽含量測定值與亞硝酸鹽含量實際值基本一致。

與亞硝酸鹽質(zhì)量濃度實際值相比，該檢測儀絕對測量誤差為-0.13～0.07 mg/L，平均絕對誤差為0.03 mg/L。這說明本檢測儀能夠精確地檢測牛乳中的亞硝酸鹽含量。另外，對20份樣品檢測時間的統(tǒng)計結(jié)果表明，從按下“檢測”鍵到給出測量結(jié)果所用時間小于3 s。

圖9 亞硝酸鹽質(zhì)量濃度儀器測定值與實際值比較Fig.9 Comparison of actual values of nitrite mass concentration with instrumental measurements

3 結(jié)論

(1) 基于亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺反應(yīng)變色的原理，設(shè)計了一種由微控制器模塊、光源模塊、光傳感器模塊、電源和輸入輸出模塊等硬件系統(tǒng)組成的便攜式亞硝酸鹽含量檢測儀。采用C51語言編寫檢測軟件。

(2) 利用SPA算法從380～780 nm的波長范圍內(nèi)提取了對牛乳中亞硝酸鹽含量敏感的8個特征波長。綜合考慮成本、LED光譜響應(yīng)范圍等，確定了以中心波長為469、500、546、628、665 nm的5個LED為檢測光源。

(3) 在0～0.78 mg/L的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，該檢測儀檢測牛乳中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度絕對誤差為-0.13～0.07 mg/L，平均絕對誤差為0.03 mg/L。