陳泓岑，劉世洲，王 樂(lè)，常可欣，盧天航，雒星辰，鄧 楊，李子萱，劉博文，張永紅 ，崔德鳳

（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院／獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

病毒、細(xì)菌和環(huán)境應(yīng)激等諸多因素可誘發(fā)呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory syndrome，PRDC），其病毒類病原主要包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus，PCV2）、豬巨大細(xì)胞病毒等；細(xì)菌類病原包括豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida，Pm）和副豬嗜血桿菌（ Haemophilus parasuis，Hs）等。呼吸道疾病綜合征發(fā)病豬的主要癥狀為較高的體溫，同時(shí)伴有咳嗽、體型消瘦、喘氣、呼吸困難、食欲減退等癥狀，最終導(dǎo)致降低經(jīng)濟(jì)價(jià)值或死亡。本病主要發(fā)生于斷奶仔豬，因?yàn)槟溉橹泻锌贵w，而斷奶仔豬缺乏抗體會(huì)導(dǎo)致免疫功能低下而患病，本病的發(fā)病率高達(dá)30%～80%，且病死率高達(dá)5%～30%。呼吸道疾病綜合征（PRDC）主要與規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的密集養(yǎng)殖、通風(fēng)不良、衛(wèi)生環(huán)境不良和環(huán)境應(yīng)激刺激等諸多因素有關(guān)，這些是引起該病在養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)病率高的重要原因。一般而言，豬場(chǎng)在發(fā)生呼吸道疾病的前期，常見(jiàn)各種應(yīng)激因素，如：寒冷潮濕、轉(zhuǎn)群或運(yùn)輸、突然冷熱交替、豬群密度大過(guò)于擁擠、氨氣味過(guò)大、疫苗免疫等；還有營(yíng)養(yǎng)不良或不均衡、免疫力低和豬流感或感冒共同作用，故而使豬呼吸道疾病頻頻發(fā)作交叉感染，最終導(dǎo)致多種致病因素的混合感染，并導(dǎo)致死亡率增加。

1 疾病簡(jiǎn)介

1.1 豬傳染性胸膜肺炎

放線桿菌可導(dǎo)致高傳染性、高致死率的豬傳染性胸膜肺炎。劉奎昊等人對(duì)山東某豬場(chǎng)的病死豬剖檢，發(fā)現(xiàn)豬的心包有擴(kuò)張、肺臟胸膜表面出現(xiàn)纖維素滲出，還有研究表明有的豬會(huì)出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大。董發(fā)明等人對(duì)一豬場(chǎng)的傳染性胸膜肺炎進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬和育肥豬的發(fā)病率高，最急性、急性、慢性型3種發(fā)病形式均存在，其中最急性型發(fā)病率僅0.98%，但是病死率極高，約為91.43%，呼吸困難是該病導(dǎo)致豬死亡的主要原因，病死豬皮膚往往呈現(xiàn)藍(lán)紫色。該病在我國(guó)流行的血清型為1型、5型和7型。

1.2 豬支原體肺炎

豬肺炎支原體又稱豬氣喘病。有研究表明，該病在春冬季節(jié)的陽(yáng)性檢出率高，分別為66.67%和77.78%；育肥豬以及繁育母豬陽(yáng)性率較高，分別為63.41%和86.49%。李石對(duì)北疆地區(qū)的豬場(chǎng)發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，染病后的豬會(huì)出現(xiàn)明顯的咳嗽，腹式呼吸等癥狀，對(duì)病死豬進(jìn)行剖檢后發(fā)現(xiàn)肺部有不同程度的肺氣腫和肺實(shí)變。

1.3 豬圓環(huán)病毒病

豬圓環(huán)病毒（PCV）是已知最小的動(dòng)物病毒之一，現(xiàn)已知有四種血清型，主要病原為PCV2。在尹麗萍等人的研究中，41到90日齡的豬只PCV2抗體檢出率最高，為47.92%；PCV2還常與其他病原混合感染，其中與PRRSV的混合感染率最高為30.43%。PCV2可以造成母豬生殖障礙；生長(zhǎng)發(fā)育豬呼吸道疾病；皮膚炎癥和腎衰；仔豬先天震顫，仔豬一出生就會(huì)震顫，也稱“抖抖豬”和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，該病可直接、間接、垂直傳播。

1.4 豬繁殖與呼吸綜合征

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）主要引起病豬的皮膚發(fā)紺、呼吸障礙和雙耳皮膚變藍(lán)，所以又稱為“藍(lán)耳病”，可直接、間接和垂直傳播。2020年一研究表明，保育豬陽(yáng)性檢出率最高，為32.24%，其次是哺乳豬，為19.09%。賈義平等人對(duì)一豬場(chǎng)的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)該病可導(dǎo)致育肥豬發(fā)育緩慢，厭食沉郁，母豬流產(chǎn)，死胎，而后陸續(xù)傳染到其他豬舍，仔豬舍和保育豬舍。

2 材料與方法

2.1 發(fā)病情況與樣品采集

北京市某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)自2021年9月以來(lái)，該場(chǎng)斷奶仔豬（40日齡）進(jìn)入保育舍20 d左右出現(xiàn)咳嗽、氣喘、呼吸困難、持續(xù)性消瘦以及嚴(yán)重急性死亡等臨床癥狀，通過(guò)統(tǒng)計(jì)后死亡率在10%～30%。對(duì)病死豬進(jìn)行病理剖檢，結(jié)果顯示，肺組織有不同程度的間質(zhì)性肺炎，肺組織間水腫，淋巴結(jié)腫脹出血；肝腫大，呈黑褐色，有血水流出；腎臟表面存在白色壞死斑點(diǎn)；脾臟腫大，邊緣呈鋸齒狀，部分呈黑褐色。選取病豬進(jìn)行前腔靜脈采血10 mL，于4℃ 3 000 r/min 離心20 min分離得到血清，用于后續(xù)病毒DNA、RNA的提取與鑒定。將病死豬進(jìn)行剖檢，采集肺臟、肝臟、 脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、氣管及支氣管分泌物、扁桃體及滲出液進(jìn)行常見(jiàn)病原檢測(cè)。

2.2 主要試劑及儀器

LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，血瓊脂平板、血清瓊脂平板和巧克力瓊脂平板自制，革蘭氏染色液購(gòu)自碧云天，細(xì)菌核酸提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)，病毒 DNA/RNA提取試劑盒、2×Pro Taq預(yù)混液、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒購(gòu)自艾科瑞生物；PCR引物為生工生物工程（上海）股份有限公司合成。電泳儀（WH-600-LCD）購(gòu)自上海雙琪生物科技有限公司，PCR儀T100購(gòu)自Bio-Rad，全自動(dòng)高壓滅菌鍋TMQR-3250購(gòu)自山東新華醫(yī)療器械有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 樣品處理

將豬場(chǎng)采集的病豬組織切成小塊，用剪刀剪碎，放入組織勻漿器中，加入適量滅菌PBS緩沖液反復(fù)研磨，置-80℃的超低溫冰箱內(nèi)反復(fù)凍融3次以上，最后將組織勻漿離心，提取上清液備用。

2.3.2 病毒DNA和RNA的提取

用制備好的組織勻漿上清液及血清作為待檢樣本，采用 Steady Pure 病毒DNA/RNA 提取試劑盒，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病毒核酸提取、純化，將得到的 DNA和RNA保存于-20℃冰箱中備用。

2.3.3 cDNA的制備

將提取的病毒RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行 PT-PCR擴(kuò)增，首先去除基因組DNA，5Xg DNA Clean Reaction Mix加 入 2μL和RNA樣本8μL，反應(yīng)條件：42℃2 min后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后將該病毒的cDNA置于-20℃冰箱保存。

2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

PRRSV和PCV2的檢測(cè)都選擇20μL的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為 10μL 的 2×SYBRGreen Pro Tap HS Premix；上游引物和下游引 物 各 0.4 μL；模 板 2.0 μL；ROX Reference Dye（20μmol/L）0.4 uL；RNase Free dH2O 為6.8 μL。PRRSV的引物F為AAT AACAACGGCAAGCAGCAG；R為CCTCTGGACTGGTTTTGT反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；然 后 95℃ 5 s，55℃ 30 s重 復(fù)40個(gè) 循 環(huán)。PCV2的 引 物F為GCGGGCCAAAAAAGGTACAG TTCC；R為 ACCAGCGCACTT CGGCAGCGGCAG，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 30 s；然后 95℃ 5 s，66℃ 30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)。各自分別使用10倍稀釋的自建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行絕對(duì)定量PCR擴(kuò)增。

2.3.5 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系為2×Pro Taq預(yù)混液10 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L） 各 1 μL，cDNA模板2μL，無(wú)酶無(wú)菌水6μL；反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，退火45 s（退火溫度根據(jù)表1中各自的退火溫度設(shè)定），72℃延伸 45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。取5μL擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件110 V，30 min。

2.3.6 細(xì)菌分離

從病死豬采集的臟器等樣品，用燒灼滅菌的接種環(huán)釣取組織，進(jìn)行血清營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌37℃培養(yǎng)24 h，分別劃線接種于血瓊脂平板、血清瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h；進(jìn)行細(xì)菌純培養(yǎng)，細(xì)菌形態(tài)觀察和細(xì)菌16SrRNA鑒定。采用細(xì)菌16SrRNA 通用引物和特異性引物，詳見(jiàn)表1，按照細(xì)菌常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳成像，觀察結(jié)果。

表1 病原菌和病毒引物序列

2.3.7 病原菌和病毒引物

3 結(jié)果與分析

3.1 PRRSV檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)本研究設(shè)計(jì)的以PRRSV ORF7基因?yàn)槟康钠蔚囊?，?duì)19個(gè)血清樣品進(jìn)行了PRRSV檢測(cè)，PRRSV陽(yáng)性樣品可于434 bp處看見(jiàn)高亮條帶。如圖1中樣 本 編 號(hào) 3、5、6、7、11、12、13、15、16、17、18、19的 樣本在434 bp處可以觀察到陽(yáng)性條帶。

圖1 PRRSV RCR電泳結(jié)果

使用PRRSV N蛋白基因特異性引物，對(duì)PRRSV陽(yáng)性樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒載量，檢測(cè)結(jié)果與普通PCR結(jié)果相一致，其中編號(hào)為17、18的樣本PRRSV N蛋白mRNA表達(dá)量較高（見(jiàn)圖2）。

圖2 PRRSV陽(yáng)性樣本qRT-PCR結(jié)果

在 19 份血清樣品中檢出PRRSV 陽(yáng)性有12份，檢出率為63.15%。據(jù)了解，該豬場(chǎng)目前正在使用天津株豬藍(lán)耳病弱毒疫苗，經(jīng)過(guò)基因序列比較，結(jié)果表明，所檢出病毒不屬于疫苗毒株，而屬于流行毒株。

3.2 PCV2檢測(cè)結(jié)果

運(yùn)用普通PCR的方法對(duì)9份組織樣品與10份血清樣品進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的檢測(cè)，PCV2陽(yáng)性樣品可于494 bp處看見(jiàn)高亮條帶。如圖3中樣本編號(hào)為1、4、5、8、10的樣本在494 bp處可以觀察到陽(yáng)性條帶。

圖3 PCV2 PCR電泳結(jié)果

使用PCV2 Cap蛋白基因特異性引物，對(duì)PCV2陽(yáng)性樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果與普通PCR 電泳結(jié)果相一致，其中編號(hào)為4的樣本PCV2 Cap蛋白mRNA表達(dá)量最高（見(jiàn)圖4）。

圖4 PCV2陽(yáng)性樣本qRT-PCR結(jié)果

在9個(gè)組織樣品本中，4份樣品檢出PCV2，在10個(gè)血液樣本中，1個(gè)樣本檢出PCV2，累計(jì)檢出率達(dá)26.3%。據(jù)了解，該場(chǎng)目前采用的是PCV2 2a型豬圓環(huán)病毒疫苗，經(jīng)基因序列比較，顯示PCV2病毒為2d型。

3.3 細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增SS、App、Pm、MH的核酸，病原菌均未檢出，結(jié)果都為陰性。

3.4 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

在檢測(cè)的19例斷奶仔豬的樣品中，有12例感染PRRSV和5例感染PCV2，檢測(cè)樣品中未撿出SS、Hps、Pm、Bb等病原。經(jīng)基因序列比較，結(jié)果顯示，PRRSV和PCV2與接種疫苗的基因序列存在很大的差異。

4 討論

豬呼吸道傳染病是集約化豬場(chǎng)養(yǎng)殖中的大問(wèn)題，豬場(chǎng)因此病引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失也是不可估量的。該病的發(fā)病率約在30%～80%之間，病死率在5% ～ 30%之間，甚至?xí)^(guò)上限值。在該豬場(chǎng)的19例病豬中，PRRSV的檢出率是63.15%，PCV2的檢出率為26.3%，雖然該豬場(chǎng)已經(jīng)接種過(guò)疫苗，但是由于基因型不一致而導(dǎo)致免疫效果不理想，而無(wú)法起到有效的保護(hù)作用。

有研究表明，從2015到2019年我國(guó)各地發(fā)現(xiàn)PCV2的總患病率為46%，母豬患病率為48.8%，公豬患病率為47.6%，新疆的患病率最高為86.3%。PCV2進(jìn)入機(jī)體以后，可感染淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，引起免疫抑制；PCV2感染淋巴組織后，可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡、破壞淋巴濾泡結(jié)構(gòu)，淋巴組織流失并被結(jié)締組織取代，最終導(dǎo)致免疫抑制，機(jī)體對(duì)其他病原的抵抗能力減弱導(dǎo)致繼發(fā)感染。有研究表 明，2016-2018年P(guān)RRSV的 檢出率逐年上升，從21.08%上升到41.72%，并且育肥豬、保育豬和哺乳仔豬的感染比例分別為35.29%、41.83%和56.67%。在豬場(chǎng)中，PRRSV與PCV2常常處于共感染狀態(tài)，并且這種狀態(tài)有助于PCV2的復(fù)制，在共同感染狀態(tài)下，病豬的臨床癥狀要比單獨(dú)感染更強(qiáng)，死亡率也更高。

養(yǎng)豬場(chǎng)在疫病防治上不能松懈，在加強(qiáng)硬件設(shè)備基礎(chǔ)的同時(shí)應(yīng)著重加強(qiáng)對(duì)病毒的管理，加強(qiáng)對(duì)疾病的防治。同時(shí)，獸醫(yī)應(yīng)適時(shí)、有序地對(duì)豬場(chǎng)的免疫情況進(jìn)行監(jiān)控、評(píng)價(jià)，并制定出一套科學(xué)、有效的疫苗接種方案，這對(duì)提高養(yǎng)豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益、提高生產(chǎn)的穩(wěn)定性起到了關(guān)鍵作用。從養(yǎng)豬的飼養(yǎng)管理上，對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行及時(shí)的補(bǔ)漏，才能達(dá)到預(yù)防或減少疫情發(fā)生的目的。

防控措施：

1）接種疫苗，在豬場(chǎng)采集樣本送實(shí)驗(yàn)室檢查，針對(duì)豬場(chǎng)現(xiàn)有病原接種相應(yīng)疫苗；

2）使用抗菌藥，如泰樂(lè)菌素、恩諾沙星等藥物，以“預(yù)防為主，治療為輔”為用藥原則；

3）合理運(yùn)用中藥、中藥組方及其衍生物等作為飼料預(yù)添加劑來(lái)達(dá)到預(yù)防疾病的作用，如蒲公英、淫羊藿、板藍(lán)根等；

4）改善豬場(chǎng)的飼養(yǎng)環(huán)境：

①斷奶仔豬不能密度太大，會(huì)影響采食、飲水和休息，主要容易產(chǎn)生應(yīng)激；

②保持每天通風(fēng)、換風(fēng)，保持環(huán)境衛(wèi)生干凈；

③本病在秋冬季節(jié)要做好豬舍的防寒、保溫工作，以免天氣驟變對(duì)生豬產(chǎn)生應(yīng)激，降低其免疫力；

④對(duì)病死豬及時(shí)進(jìn)行隔離以及無(wú)害化處理，以免造成大面積傳染。